崔夢(mèng)君，張振東，萬(wàn)舒曼，葛東穎，郭壯

(湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽(yáng)，441053)

豆瓣醬是我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，色澤鮮艷，香氣濃郁，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。它的生產(chǎn)主要經(jīng)過(guò)制曲、蠶豆發(fā)酵、辣椒發(fā)酵和混合發(fā)酵等過(guò)程[2]。發(fā)酵時(shí)，原料中的糖類(lèi)和蛋白質(zhì)等會(huì)被分解產(chǎn)生酸、醇和酯等物質(zhì)，從而賦予豆瓣醬特殊的風(fēng)味[3]。研究顯示，豆瓣醬中近40%的微生物為細(xì)菌[4]，細(xì)菌對(duì)與食品的發(fā)酵有著重要的作用[5]，因此對(duì)于豆瓣醬樣品細(xì)菌的研究就顯得尤為重要。目前，對(duì)于豆瓣醬的研究主要集中在菌株的分離鑒定[6]和生產(chǎn)工藝的優(yōu)化[7]，而對(duì)于豆瓣醬中細(xì)菌多樣性和品質(zhì)的研究相對(duì)較少。

隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，以Illumina MiSeq為代表的第二代測(cè)序技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確對(duì)發(fā)酵食品中的微生物進(jìn)行解析[8-9]。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于白酒[10]和酸菜[11]等食品中微生物的解析；電子舌技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)食品中基本味和回味的相對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，已廣泛應(yīng)用于酸奶[12]和啤酒[13]等發(fā)酵食品的滋味品質(zhì)評(píng)價(jià)；電子鼻技術(shù)可以對(duì)食品中特定的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，被廣泛應(yīng)用于醬油[14]和蝦醬[15]等發(fā)酵食品中。

本研究從湖北省荊州市荊州區(qū)的農(nóng)戶家中采集了13 個(gè)豆瓣醬，采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)農(nóng)家豆瓣醬中細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，同時(shí)采用電子舌和電子鼻技術(shù)對(duì)相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，并將細(xì)菌多樣性和豆瓣醬品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析，最終對(duì)豆瓣醬中細(xì)菌的基因功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)，以期對(duì)后續(xù)農(nóng)家豆瓣醬品質(zhì)和食用安全性的提升提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

農(nóng)家豆瓣醬：采集至湖北省荊州市荊州區(qū)。

dNTPs Mix、FastPfuFly DNA Polymerase、5×TransStartTMFastPfuBuffer，北京全式金生物技術(shù)有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒，德國(guó)QIAGEN公司；陰陽(yáng)離子溶液、參比溶液和味覺(jué)標(biāo)準(zhǔn)溶液，日本Insent公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Nano Drop公司；SA 402B電子舌，日本Insent公司；PEN3電子鼻，德國(guó)Airsense公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

于2018年10月上旬從湖北省荊州市荊州區(qū)郢城鎮(zhèn)和李埠鎮(zhèn)(E112°07′～112°22′，N30°32′～30°36′)農(nóng)戶家中采集豆瓣醬樣品13 份。其制作時(shí)間約在70～80 d左右。

1.3.2 樣品微生物宏基因組DNA提取

取2.0 g豆瓣醬，按DNA基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)中進(jìn)行DNA提取，并對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)，將檢驗(yàn)合格后的DNA樣品置于-20 ℃暫存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 細(xì)菌16S rRNA V4-V5區(qū)PCR擴(kuò)增及測(cè)序

正反向引物分別為338F(5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，參照郭壯的PCR擴(kuò)增參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增[16]。將擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序主要流程如下：(1)文庫(kù)制備，對(duì)DNA進(jìn)行片段化處理，并向兩端添加特定的接頭來(lái)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。接頭含有的互補(bǔ)序列使DNA片段結(jié)合到流動(dòng)槽上，進(jìn)行再擴(kuò)增和片段純化。(2)測(cè)序，將文庫(kù)上樣到流動(dòng)槽后置于測(cè)序儀中，擴(kuò)增DNA片段簇。邊合成邊測(cè)序過(guò)程中，核苷酸通過(guò)天然的互補(bǔ)性與DNA模板鏈結(jié)合。每個(gè)核苷酸均含有熒光標(biāo)記和可逆終止子，熒光信號(hào)可指示出加入的核苷酸種類(lèi)，而終止子被切割后，下一個(gè)堿基繼續(xù)結(jié)合，讀取正向DNA鏈后，序列會(huì)脫落，隨后重復(fù)該過(guò)程，讀取反向鏈，最終完成測(cè)序過(guò)程。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

使用QIIME(v1.70)平臺(tái)對(duì)質(zhì)控后的有效序列進(jìn)行細(xì)菌物種分析和多樣性評(píng)價(jià)[16]。使用GREENGENE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并對(duì)其分類(lèi)學(xué)地位進(jìn)行注釋，從而對(duì)豆瓣醬中細(xì)菌的基因功能進(jìn)行PICRUSt預(yù)測(cè)[17]。

1.3.5 核酸登錄號(hào)

本研究中所有序列數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為mgp89184。

1.3.6 基于電子舌技術(shù)對(duì)農(nóng)家豆瓣醬滋味品質(zhì)的評(píng)價(jià)

參考王玉榮等方法并做適當(dāng)優(yōu)化[18]。樣品處理：取10 g豆瓣醬樣品和90 mL蒸餾水混勻后10 000 r/min離心15 min，取上清液抽濾后置于4 ℃冰箱中24 h，去除上層油層后待用。數(shù)據(jù)處理：每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定4 次，取后3 次數(shù)據(jù)為有效數(shù)據(jù)。

1.3.7 基于電子鼻技術(shù)對(duì)農(nóng)家豆瓣醬風(fēng)味品質(zhì)的評(píng)價(jià)

參考王玉榮等對(duì)鲊廣椒風(fēng)味測(cè)定方法并做適當(dāng)優(yōu)化[19]。樣品處理：取10 g豆瓣醬樣品于電子鼻樣品瓶中，60 ℃保溫15 min，室溫靜置10 min后插入電子鼻測(cè)試電極進(jìn)行測(cè)定，平行測(cè)定3 次。數(shù)據(jù)處理：響應(yīng)曲線在60 s后達(dá)到穩(wěn)定，選取63、64和65 s的響應(yīng)值，并計(jì)算其平均值為測(cè)試值。

1.3.8 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用相關(guān)性分析法對(duì)平均相對(duì)含量大于0.5%的細(xì)菌屬與品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)之間的相關(guān)性進(jìn)行研究，選取相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值大于0.5，且矯正后P<0.5的評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Cytoscape軟件(v3.5.1)進(jìn)行相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖繪制；使用Pearson相關(guān)性分析法對(duì)豆瓣醬樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬和COGs功能類(lèi)別之間的相關(guān)性進(jìn)行計(jì)算，并使用熱圖對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。使用R軟件(v3.3.2)進(jìn)行相關(guān)性計(jì)算和作圖；使用Origin 8.5軟件(OriginLab Corp，MA，USA)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

本研究采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)農(nóng)家豆瓣醬樣品中細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析。16S rRNA測(cè)序結(jié)果及各分類(lèi)學(xué)地位數(shù)量信息如表1所示。

表1 樣品16S rRNA測(cè)序情況及各分類(lèi)地位數(shù)量

由表1可知，高通量測(cè)序共產(chǎn)生了733 177 條高質(zhì)量的16S rRNA序列，平均每個(gè)樣品56 398 條。按照100%和97%相似度對(duì)序列進(jìn)行劃分且去除嵌合體后共得到了33 036 個(gè)OTU。DBJ8樣品的超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均最大，分別為3 233和8.33。由此可見(jiàn)，DBJ8樣品細(xì)菌多樣性豐度和多樣性均最大。

2.2 農(nóng)家豆瓣醬中細(xì)菌微生物的構(gòu)成分析

在門(mén)水平上，樣品中的細(xì)菌隸屬于23 個(gè)門(mén)，其中硬壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)的平均相對(duì)含量分別為61.92%、21.18%和11.98%。在屬水平上，共發(fā)現(xiàn)530 個(gè)細(xì)菌屬，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬(相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌屬)相對(duì)含量比較分析如圖1所示。

由圖1可知，農(nóng)家豆瓣醬中相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌屬共有12 個(gè)，其中隸屬于硬壁菌門(mén)的有芽孢桿菌屬(Bacillus，20.69%)、葡萄球菌屬(Staphylococcus，20.50%)、片球菌屬(Pediococcus，7.09%)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus，6.30%)和四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus，1.17%)；隸屬于放線菌門(mén)的有棒狀桿菌(Corynebacterium，7.42%)、短桿菌屬(Brevibacterium，1.71%)和短狀桿菌屬(Brachybacterium，1.19%)，而隸屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria)的有腸桿菌屬(Enterobacter，3.64%)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella，2.68%)、雷氏菌屬(Ralstonia，1.47%)、和沙門(mén)氏菌屬(Salmonella，1.03%)。由此可知，納入本研究的農(nóng)家豆瓣醬中的細(xì)菌主要是由隸屬于硬壁菌門(mén)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬構(gòu)成，其平均含量累計(jì)為55.65%。值得一提的是，芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和乳酸桿菌屬在13 個(gè)樣本中均存在，其累計(jì)平均含量為47.49%?；贠TU的UpSet圖如圖2所示。

由圖2可知，DBJ5與其他樣品的獨(dú)有OTU數(shù)量最多為631 個(gè)，其次是DBJ2和DBJ7分別為546和524，分別占其豆瓣醬樣品OTU總數(shù)的56.95%、37.07%和35.77%。同時(shí)，DBJ1和DBJ13中有102個(gè)相同OTU，DBJ2和DBJ5中有58個(gè)相同OTU。由此可見(jiàn)，雖然不同農(nóng)家豆瓣醬樣品中細(xì)菌屬的相對(duì)豐度存在著較大差異，但其細(xì)菌菌屬的種類(lèi)卻有一定的相似趨勢(shì)，這也說(shuō)明同一地區(qū)的豆瓣醬其菌群組成的相似性[20]。

圖1 農(nóng)家豆瓣醬中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬相對(duì)含量的比較分析

圖2 基于OTU的UpSet圖

2.3 農(nóng)家豆瓣醬優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬及品質(zhì)的相關(guān)性分析

本研究首先使用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)農(nóng)家豆瓣醬中細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析，再使用電子舌和電子鼻對(duì)其滋味和風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并構(gòu)建了優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與品質(zhì)指標(biāo)相關(guān)性的網(wǎng)絡(luò)圖。農(nóng)家豆瓣醬樣品各滋味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度的箱型圖如圖3所示。

圖3 農(nóng)家豆瓣醬滋味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度值的箱形圖(n=13)

由圖3可知，農(nóng)家豆瓣醬在酸味上的差異最大，其次是豐度(鮮的回味)、鮮味和咸味；而在后味B(苦的回味)、苦味和后味A(澀的回味)上的差異相對(duì)較小。由此可知，酸味、鮮味和咸味可能是導(dǎo)致農(nóng)家豆瓣醬樣品滋味品質(zhì)差異的主要指標(biāo)。豆瓣醬風(fēng)味指標(biāo)強(qiáng)度如表2所示。

農(nóng)家豆瓣醬樣品的整體風(fēng)味品質(zhì)差異主要集中在W1C、W5S、W2S和W1S等風(fēng)味指標(biāo)上。由此可知，不同的農(nóng)家豆瓣醬其風(fēng)味品質(zhì)存在較大差異，且其風(fēng)味品質(zhì)的差異要大于滋味品質(zhì)。因豆瓣醬的滋味和風(fēng)味品質(zhì)均受發(fā)酵菌群的影響[21],本研究對(duì)樣本中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬和感官指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行分析。

表2 農(nóng)家豆瓣醬風(fēng)味指標(biāo)強(qiáng)度表(n=13)

由圖4可知，10 個(gè)品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)與14 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬之間存在顯著相關(guān)性(|r|>0.5,P<0.05)。值得注意的是，僅Weissella(魏斯氏菌屬)和Citrobacter(枸櫞酸桿菌屬)與風(fēng)味指標(biāo)呈顯著正相關(guān)。鮮味、豐度、W1C、W3C和W5C均為豆瓣醬的優(yōu)良型指標(biāo)，而苦味、咸味、后味A和澀味則為缺陷型指標(biāo)，由此可見(jiàn)，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬中魏斯氏菌屬、枸櫞酸桿菌屬和假單胞菌屬(Pseudomonas)的增加，雷氏菌屬、鹽單胞菌屬(Halomonas)、棒狀桿菌(Corynebactenum)、短桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和沙門(mén)氏菌屬的降低，且根瘤菌屬和草螺菌屬等維持在一定比例均有助于提高農(nóng)家豆瓣醬的產(chǎn)品品質(zhì)。

圖4 農(nóng)家豆瓣醬優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬和感官指標(biāo)相關(guān)性的網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 基于多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析農(nóng)家豆瓣醬細(xì)菌構(gòu)成

本研究就樣品間的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。基于OTU水平進(jìn)一步采用非加權(quán)的UniFrac距離主坐標(biāo)分析和UPGMA聚類(lèi)分析對(duì)13 個(gè)豆瓣醬樣品的β多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖5所示。

圖5 基于分類(lèi)操作單元的非加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析(A)和UPGMA聚類(lèi)分析(B)

由圖5-A可知，13 個(gè)農(nóng)家豆瓣醬樣品呈現(xiàn)出明顯的分類(lèi)趨勢(shì)，編號(hào)為DBJ1、DBJ3、DBJ9和DBJ13的豆瓣醬分為一類(lèi)，編號(hào)為DBJ4、DBJ6、DBJ8、DBJ10、DBJ11和DBJ12的豆瓣醬樣品分為一類(lèi)。由圖5-B可知，13 個(gè)農(nóng)家豆瓣醬樣品可分為2個(gè)聚類(lèi)，其中聚類(lèi)一由DBJ1、DBJ2、DBJ3、DBJ9和DBJ13構(gòu)成，聚類(lèi)二由其他樣品構(gòu)成，兩者結(jié)果基本一致。由此說(shuō)明，盡管納入本研究的農(nóng)家豆瓣醬樣品中均存在大量的核心細(xì)菌菌群，但在不同的樣品間其微生物群落結(jié)構(gòu)也存在較大的差異。以聚類(lèi)分組為依據(jù)，對(duì)豆瓣醬樣品優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬、滋味指標(biāo)和風(fēng)味指標(biāo)進(jìn)行Mann-Whiney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，滋味和風(fēng)味指標(biāo)在兩者中均不存在顯著性差異，這可能是由于非加權(quán)UniFrac聚類(lèi)分析未將菌群含量考慮在內(nèi)，但在優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬上面，芽孢桿菌屬、雷氏菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌和短狀桿菌屬均具有顯著性差異(P<0.05)，由此說(shuō)明，樣品間的微生物群落結(jié)構(gòu)存在較大的差異。

2.5 PICRUSt基因預(yù)測(cè)

本研究共計(jì)注釋到4195 COGs(蛋白質(zhì)直系同源簇)，這些COGs分別屬于23 個(gè)功能大類(lèi)。以聚類(lèi)分組為依據(jù)，對(duì)功能大類(lèi)進(jìn)行Mann-Whiney檢驗(yàn)，其顯著差異功能大類(lèi)相對(duì)豐度的箱型圖如圖6所示。

A-RNA的加工和修飾；B-染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)；C-能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換；G-碳水化合物的運(yùn)輸和代謝；H-輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；I-脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；M-細(xì)胞壁/膜/包膜生物生成；N-細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；Q-次生代謝產(chǎn)物的生物合成，轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝；S-功能未知；U-細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，分泌和囊泡運(yùn)輸(下同)

由圖6可知，23 個(gè)功能大類(lèi)中有10 個(gè)功能大類(lèi)具有顯著性差異(P<0.05)，分別為A、B、C、G、H、I、M、N、Q和U。類(lèi)別C、G、H、I、Q、U和M在所用樣品中占主導(dǎo)性地位。值得注意的是，聚類(lèi)一中有更多的基因代表序列G和M，因此，聚類(lèi)一中的細(xì)菌菌群對(duì)于碳水化合物的利用更加高效，細(xì)菌的生長(zhǎng)也更加旺盛，更有利于豆瓣醬的發(fā)酵。COGs功能類(lèi)群與優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬之間的秩相關(guān)熱圖如圖7所示。

由圖7可知，納入本研究的農(nóng)家豆瓣醬樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與COGs功能類(lèi)群之間存在著明顯的相關(guān)關(guān)系。其中細(xì)胞壁/膜/包膜生物生成與芽孢桿菌屬呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，而與葡萄球菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬和短狀桿菌屬呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)；碳水化合物的運(yùn)輸和代謝與克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、沙門(mén)氏菌屬和片球菌屬呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，而與短桿菌屬和短狀桿菌屬呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)。由此可見(jiàn)，克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、片球菌屬和芽孢桿菌屬對(duì)豆瓣醬發(fā)酵過(guò)程具有促進(jìn)作用。但結(jié)合圖4的結(jié)論可知，其相對(duì)豐度過(guò)高易對(duì)豆瓣醬滋味和風(fēng)味品質(zhì)造成影響。

圖7 COGs功能類(lèi)群與優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬之間的秩相關(guān)熱圖

3 結(jié)論

本研究以荊州地區(qū)的農(nóng)家豆瓣醬為研究對(duì)象，使用Illumina MiSeq高通量測(cè)序、電子舌和電子鼻技術(shù)相結(jié)合的方式對(duì)其細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析，同時(shí)探討細(xì)菌對(duì)豆瓣醬品質(zhì)的影響。研究發(fā)現(xiàn)硬壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和放線菌門(mén)的累計(jì)平均相對(duì)含量高達(dá)95.08%，而芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬、片球菌屬和乳酸桿菌屬為其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，相對(duì)含量占細(xì)菌總數(shù)的62%。納入本研究的農(nóng)家豆瓣醬中雷氏菌屬、鹽單胞菌屬、棒狀桿菌、短桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和沙門(mén)氏菌屬的降低可以顯著改善豆瓣醬的品質(zhì)。此外，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬在碳水化合物的運(yùn)輸與代謝、能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換、細(xì)胞壁/膜/包膜生物生成、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等方面發(fā)揮著積極作用。