高慶超，常應(yīng)九，馬蓉,曹效海,3,王樹(shù)林, 2, 3*

1(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧,810016) 2(省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(青海大學(xué))，青海 西寧,810016) 3(青海-甘肅食品研發(fā)與檢測(cè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧,810016)

酵素是微生物及相關(guān)代謝活性物質(zhì)的微生態(tài)整體[1-2]，是以果蔬、菌菇、谷物及中草藥等為原料，經(jīng)過(guò)乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等多菌種復(fù)合發(fā)酵后，形成富含多種生物活性成分、礦物質(zhì)、酶、有機(jī)酸和少量乙醇等產(chǎn)物的可食用液態(tài)或固態(tài)食品[3-4]。隨著酵素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，酵素中相關(guān)代謝產(chǎn)物的分析研究成為熱點(diǎn)，如MARISA等[5]從諾麗酵素中檢測(cè)到乙酸，抗壞血酸，琥珀酸和酒石酸等有機(jī)酸。陸雨[6]從諾麗酵素中分析鑒定出27個(gè)化合物，同時(shí)發(fā)現(xiàn)諾麗酵素具有良好的抗氧化活性。李云姣等[7]對(duì)水果酵素中的理化成分進(jìn)行了分析，并發(fā)現(xiàn)水果酵素具有良好的抗氧化效果和潛在的降血糖功效。

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)作為青藏高原的特色漿果資源，富含花青素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與活性成分，具備多種生物活性，如抗氧化、抗疲勞、延緩衰老、預(yù)防癌癥等[8]。因此，利用黑果枸杞結(jié)合青海特色漿果資源制備黑果枸杞酵素，在一定程度上可以延緩加工過(guò)程中花青素的降解[9]，豐富黑果枸杞系列產(chǎn)品，進(jìn)一步強(qiáng)化黑果枸杞在功能性食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

目前對(duì)于黑果枸杞酵素的研究鮮有報(bào)道，為了比較與分析不同原料配比黑果枸杞酵素發(fā)酵完成后的成分差異及體外抗氧化性能，本研究以黑果枸杞為主要原料，結(jié)合其他特色植物資源，經(jīng)過(guò)90 d自然發(fā)酵，制備4種黑果枸杞酵素，測(cè)定發(fā)酵前后4種酵素中理化成分、營(yíng)養(yǎng)活性成分及有機(jī)酸種類(lèi)和含量，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行了研究，這對(duì)高附加值黑果枸杞酵素產(chǎn)品的研發(fā)具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料及儀器

黑果枸杞鮮果采摘于青海省格爾木市(36°25’ N，94°53’ E，海拔2 800 m)，保存于干冰保溫箱中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保藏。黑果枸杞干果、枸杞、瑪卡、蕨麻、沙棘粉等由青海千平萬(wàn)安農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

SOD試劑盒、淀粉酶試劑盒、考馬斯亮藍(lán)試劑盒，南京建成生物工程研究所；蘆丁和沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，成都德思特生物技術(shù)有限公司；冰乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海吉至生化科技有限公司；乳酸、酒石酸和琥珀酸等12種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒、羥自由基清除能力檢測(cè)試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；DPPH自由基，東京化成工業(yè)株式會(huì)社。

UV-1780紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津儀器(蘇州)有限公司；H/T16MM臺(tái)式離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；Multiskan Sky全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher；UltiMate3000高效液相色譜儀，美國(guó)Thermo Scientific。

1.2 研究?jī)?nèi)容及實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑果枸杞酵素生產(chǎn)

制備4種自然發(fā)酵黑果枸杞酵素。

(1)黑果枸杞鮮果單一酵素：稱(chēng)取黑果枸杞鮮果2 000 g，打漿處理，轉(zhuǎn)至滅菌壇(121 ℃，15 min)，密封，編號(hào)為XD。

(2)黑果枸杞干果單一酵素：稱(chēng)取黑果枸杞干果400 g，與1 600 mL無(wú)菌水按質(zhì)量比1∶4進(jìn)行復(fù)水30 min，打漿處理，轉(zhuǎn)至滅菌壇(121 ℃，15 min)，密封，編號(hào)為GD。

(3)黑果枸杞鮮果復(fù)合酵素：稱(chēng)取黑果枸杞鮮果1 200 g、枸杞160 g、蕨麻100 g、瑪咖60 g、沙棘粉20 g、紅糖100 g和無(wú)菌水640 mL，將枸杞用無(wú)菌水沖洗后按質(zhì)量比1∶4與無(wú)菌水復(fù)水30 min，同時(shí)把瑪咖和蕨麻清洗后水煮60 min至變軟，將全部原料打漿處理，轉(zhuǎn)至滅菌壇(121 ℃，15 min)，密封，編號(hào)為XF。

(4)黑果枸杞干果復(fù)合酵素：稱(chēng)取黑果枸杞干果240 g、枸杞160 g、蕨麻100 g、瑪咖60 g、沙棘粉20 g、紅糖100 g和無(wú)菌水1 600 mL，將黑果枸杞和枸杞用無(wú)菌水沖洗后按質(zhì)量比1∶4分別與無(wú)菌水進(jìn)行復(fù)水30 min，同時(shí)把瑪咖和蕨麻清洗后水煮60 min至變軟，將全部原料打漿處理，轉(zhuǎn)至滅菌壇(121 ℃，15 min)，密封，編號(hào)為GF。

所有操作均在超凈工作臺(tái)進(jìn)行，所有發(fā)酵壇置于28 ℃培養(yǎng)箱中避光發(fā)酵，分別于未發(fā)酵前和自然發(fā)酵90 d后取樣，平行3次，經(jīng)4層紗布過(guò)濾后，3 000 r/min離心10 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱中待測(cè)。

1.2.2 理化成分的測(cè)定

可滴定酸測(cè)定(以乳酸計(jì))：按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》測(cè)定[10]。pH值測(cè)定：采用pH計(jì)測(cè)定?？偺菧y(cè)定：取樣品0.1 mL，稀釋至不同倍數(shù)，采用蒽酮-硫酸法，參考文獻(xiàn)[11]中的步驟，在波長(zhǎng)625 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算總糖含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，制作總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=7.356 7x-0.012(mg/mL，R2=0.990 6)。還原糖測(cè)定：取樣品0.1 mL，稀釋至不同倍數(shù)，采用3,5-二硝基水楊酸顯色法，參考文獻(xiàn)[12]中的步驟，在波長(zhǎng)485 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算還原糖含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，制作還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=2.159 3x-0.007 4(mg/mL，R2=0.995 8)。

1.2.3 營(yíng)養(yǎng)及活性成分測(cè)定

總蛋白測(cè)定：取50 μL樣品，采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定。花青素含量測(cè)定：取樣品0.1 mL，采用pH示差法[13]，分別在535 nm和700 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算花青素含量?？傸S酮測(cè)定：取樣品0.5 mL，稀釋至不同倍數(shù)，采用硝酸鋁比色法，參考文獻(xiàn)[14]中的方法，于502 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，計(jì)算總黃酮含量，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=11.403x+0.018 2(mg/mL，R2=0.996 8)。總酚測(cè)定：取樣品0.5 mL，稀釋至不同倍數(shù)，采用福林酚法，參考文獻(xiàn)[14]中的方法，在760 nm處測(cè)吸光值，計(jì)算總酚含量，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，制作沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=0.101 4x+0.044 4(μg/mL，R2=0.999 4)。SOD酶活力測(cè)定：取50 μL樣品，采用SOD試劑盒測(cè)定。淀粉酶活力測(cè)定：取50 μL樣品，采用淀粉酶試劑盒測(cè)定。

1.2.4 有機(jī)酸種類(lèi)及含量測(cè)定

色譜條件：參考GB/T 5009.157—2016《食品中有機(jī)酸的測(cè)定》中的方法[15]，并有所改進(jìn)。具體條件如下：色譜柱：CAPECELLPAK MGS5C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；流動(dòng)相：體積分?jǐn)?shù)0.1%磷酸溶液；液相條件：等梯度洗脫30 min；流速0.7 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量50 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

準(zhǔn)確稱(chēng)取乳酸8.5 mg，用超純水溶于10 mL棕色容量瓶，搖勻，即為0.85 mg/mL乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，以相同的方法配制沒(méi)食子酸、延胡索酸、山梨酸、抗壞血酸、琥珀酸、草酸、醋酸、莽草酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、酒石酸和γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，其質(zhì)量濃度分別為0.009 8、0.011 6、1、0.108、1.07、0.107 6、1.63、0.017 15、0.135、0.029 8、0.100 9和1.131 mg/mL，以質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。樣品用超純水稀釋一定倍數(shù)，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣。13種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 十三種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

1.2.5 體外抗氧化活性測(cè)定

DPPH自由基清除能力測(cè)定：分別取2 mL不同體積分?jǐn)?shù)的樣品，參考文獻(xiàn)[16]中的方法，以蒸餾水為參比，以不同濃度的Vc溶液作對(duì)照，在517 nm 處測(cè)定吸光值，利用SPSS軟件計(jì)算半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

式中：A1,樣品吸光值；A2,用無(wú)水乙醇代替DPPH 時(shí)測(cè)得對(duì)應(yīng)濃度的本底吸光值；A0,空白吸光值。

總抗氧化能力的測(cè)定：分別取6 μL不同體積分?jǐn)?shù)的樣品，按總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒中的方法測(cè)定。以不同濃度的Vc溶液作對(duì)照。

羥自由基清除能力的測(cè)定：分別取75 μL不同體積分?jǐn)?shù)的樣品，按羥自由基清除能力檢測(cè)試劑盒中的方法測(cè)定。以不同濃度的Vc溶液作對(duì)照，利用SPSS軟件計(jì)算IC50。

還原力的測(cè)定：分別取1 mL不同濃度的樣品，參考文獻(xiàn)[17]中的方法測(cè)定，以蒸餾水為參比，以不同濃度的Vc溶液作對(duì)照。在700 nm處測(cè)定吸光值。吸光值越高，還原力越強(qiáng)，利用SPSS軟件計(jì)算IC50。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 四種黑果枸杞酵素理化成分測(cè)定

經(jīng)過(guò)90 d發(fā)酵，4種黑果枸杞酵素的理化成分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，經(jīng)過(guò)90 d發(fā)酵，XD、GD、XF和GF可滴定酸含量均有增加，分別增加了109.73%、122.05%、166.67%和125.52%；總糖含量均有所減少，分別減少了94.90%、83.52%、55.16%和85.58%；還原糖含量均有減少，分別減少了97.51%、84.79%、73.30%和93.19%；pH值均下降，分別下降了0.810、1.200、0.950和1.100。90 d發(fā)酵完成后，4種酵素的pH值基本無(wú)差別，XF中可滴定酸含量顯著高于XD和GD(P<0.05)，且高于GF(P>0.05)，XF中總糖和還原糖含量均顯著高于XD、GD和GF(P<0.05)，XD中可滴定酸、總糖和還原糖含量均顯著低于GD、XF和GF(P<0.05)。

表2 理化成分測(cè)定結(jié)果

注：同行相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，4種酵素未發(fā)酵前各成分含量的高低與發(fā)酵90 d后的成分含量高低不一致，同時(shí)，利用鮮果制作的2種酵素(XD和XF)中理化成分含量差異顯著(P<0.05)，利用干果制作的2種酵素(GD和GF)中理化成分含量(除發(fā)酵90 d后的還原糖)差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明4種酵素發(fā)酵過(guò)程中糖酸類(lèi)物質(zhì)的消耗與積累主要是由于自然發(fā)酵方式產(chǎn)生的微生物菌群的代謝作用不同導(dǎo)致。

2.2 四種黑果枸杞酵素活性成分測(cè)定

測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 活性成分測(cè)定結(jié)果

由表3可知，經(jīng)過(guò)90 d發(fā)酵，XD、GD、XF和GF總蛋白含量均減少，分別減少了64.55%、51.39%、69.12%和56.15%，可能與微生物利用氮源物質(zhì)有關(guān),或者是由于樣品經(jīng)過(guò)離心處理后，微生物菌體蛋白被沉淀除去，導(dǎo)致總蛋白的檢測(cè)含量較低?；ㄇ嗨睾烤兴鶞p少，分別減少了60.17%、59.41%、91.77%和86.80%，主要是由于花青素極不穩(wěn)定，導(dǎo)致花青素含量有所下降?？傸S酮含量均增加，分別增加了19.96%、26.76%、42.28%和94.44%，總酚含量均增加，分別增加了16.83%、25.34%、44.04%和40.00%，主要是因?yàn)樵谖⑸锂a(chǎn)生的酶類(lèi)及有機(jī)酸的作用下，總酚和總黃酮溶出并呈游離態(tài)，大分子物質(zhì)分解為簡(jiǎn)單的小分子物質(zhì)[18]，從而引起總酚和總黃酮含量增加。SOD酶活性均升高，分別升高了1.03%、11.00%、21.33%和22.28%，XD、GD和XF中淀粉酶活性均升高，分別升高了9.94%、29.88%和1.73%，而GF中淀粉酶活性下降了70.39%，SOD酶和淀粉酶活性的變化主要是由微生物的代謝活動(dòng)引起的，而SOD酶含量升高不明顯，可能與酵素體系中的pH值有關(guān)[19]。

經(jīng)過(guò)90 d發(fā)酵之后，GD的總蛋白、花青素、總黃酮和總酚含量均顯著高于XD、XF和GF(P<0.05)，XF的總蛋白、花青素、總黃酮和總酚含量均顯著低于XD、GD和GF(P<0.05)；XF的SOD酶含量相對(duì)最高(P<0.05)，GD的SOD酶含量相對(duì)最低(P<0.05)；XD的淀粉酶含量顯著高于XF和GF(P<0.05)，且高于GD(P>0.05)，GF的淀粉酶含量相對(duì)最低(P<0.05)。綜合發(fā)酵之后的各項(xiàng)活性成分指標(biāo)來(lái)看，GD的質(zhì)量水平較好。

2.3 四種黑果枸杞酵素有機(jī)酸種類(lèi)及含量分析

13種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品及發(fā)酵90 d后的XD中有機(jī)酸的HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

4種黑果枸杞酵素中的有機(jī)酸種類(lèi)及含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

a-13種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖；b-XD中有機(jī)酸的HPLC色譜圖;1-γ-氨基丁酸;2-酒石酸;3-檸檬酸;4-蘋(píng)果酸;5-莽草酸;6-乳酸; 7-醋酸;8-草酸;9-琥珀酸;10-抗壞血酸;11-山梨酸;12-延胡索酸;13-沒(méi)食子酸

表4 四種黑果枸杞酵素中有機(jī)酸種類(lèi)及含量分析

續(xù)表4

有機(jī)酸種類(lèi)時(shí)間/d有機(jī)酸質(zhì)量濃度/(mg·mL-1)XDGDXFGF醋酸024.650±0.129a11.415±0.134b26.292±0.072c4.403±0.155d903.620±0.009a17.945±0.021b7.296±0.004c31.390±0.170d草酸03.195±0.042a1.586±0.015b2.083±0.122c11.465±0.035d902.794±0.001a3.972±0.000b2.144±0.001c0.050±0.000d琥珀酸01.200±0.007a1.217±0.007a1.955±0.011b5.640±0.096c9013.215±0.007a8.585±0.000b-0.290±0.001c抗壞血酸04.910±0.049a17.418±1.228b1.323±0.000c6.777±0.268d900.093±0.000a5.628±0.000b0.189±0.000c0.561±0.000d山梨酸0-0.003±0.000-0.002±0.000900.279±0.001a0.603±0.000b0.159±0.000c0.401±0.000d延胡索酸00.010±0.001a0.019±0.000b0.016±0.000c0.018±0.000bc90-0.001±0.000a0.014±0.000b-沒(méi)食子酸00.024±0.001a0.044±0.000b0.007±0.000c0.028±0.001d900.148±0.000a0.185±0.008b0.075±0.006c0.055±0.003d總計(jì)041.46034.27138.89830.6479044.78272.10228.41862.502

注：“—”表示未檢出

由表4可知，由于原料配比不同，4種酵素中的有機(jī)酸種類(lèi)及含量有所不同。在XD中，未發(fā)酵前檢測(cè)到11種有機(jī)酸，總量為41.460 mg/mL，主要以醋酸為主，未檢測(cè)到蘋(píng)果酸和山梨酸，90 d發(fā)酵后檢測(cè)到12種有機(jī)酸，總量為44.782 mg/mL，比未發(fā)酵前增加了8.01%，主要以乳酸和琥珀酸為主，未檢測(cè)出延胡索酸。在GD中，未發(fā)酵前檢測(cè)到12種有機(jī)酸，總量為34.271 mg/mL，主要以醋酸和抗壞血酸為主，未檢測(cè)到蘋(píng)果酸，90 d發(fā)酵后檢測(cè)到13種有機(jī)酸，總量為72.102 mg/mL，比未發(fā)酵前增加了110.39%，主要以乳酸、醋酸和琥珀酸為主。在XF中，未發(fā)酵前檢測(cè)到12種有機(jī)酸，總量為38.898 mg/mL，主要以醋酸為主，未檢測(cè)到山梨酸，90 d發(fā)酵后檢測(cè)到12種有機(jī)酸，總量為28.418 mg/mL，比未發(fā)酵前減少了26.94%，主要以乳酸和醋酸為主，未檢測(cè)出琥珀酸。在GF中，未發(fā)酵前檢測(cè)到13種有機(jī)酸，總量為30.647 mg/mL，主要以草酸和抗壞血酸為主，90 d發(fā)酵后檢測(cè)到12種有機(jī)酸，總量為62.502 mg/mL，比未發(fā)酵前增加了103.94%，主要以醋酸和乳酸為主，未檢測(cè)出延胡索酸。根據(jù)以上結(jié)果可知，經(jīng)過(guò)90 d發(fā)酵完成后，以黑果枸杞鮮果或干果為原料的單一酵素(XD和GD)中有機(jī)酸主要以乳酸、醋酸和琥珀酸為主。以黑果枸杞鮮果或干果+其他輔料為原料的復(fù)合酵素(XF和GF)中有機(jī)酸主要以乳酸和醋酸為主，其中，GD有機(jī)酸含量最高，且種類(lèi)最全。

由表4可以發(fā)現(xiàn)，4種酵素的有機(jī)酸組成及含量各有不同，通過(guò)發(fā)酵，以黑果枸杞鮮果為原料制作的酵素(XD和XF)中，醋酸被大量消耗，乳酸被大量積累。以黑果枸杞干果為原料制作的酵素(GD和GF)中，乳酸和醋酸被大量積累。自然發(fā)酵過(guò)程就是利用原料本身的混菌復(fù)合發(fā)酵的過(guò)程,因此，由于原料本身及表面微生物的不同，必定會(huì)出現(xiàn)不同的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)及各物質(zhì)間相互轉(zhuǎn)化的情況[20]，比如醋酸的消耗可能是由于某些細(xì)菌(如光合細(xì)菌)的乙醛酸循環(huán)作用，使得醋酸被大量消耗[21]；乳酸的形成可能是由于乳酸菌代謝及蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵作用[19]；醋酸的生成可能是由于乳酸菌降解乳酸產(chǎn)生醋酸[22]，從而導(dǎo)致4種酵素中的主要呈味物質(zhì)—有機(jī)酸會(huì)不盡相同。而XF自發(fā)酵后，有機(jī)酸含量比未發(fā)酵前減少了26.94%，且XD中有機(jī)酸含量增幅偏小，猜測(cè)原因?yàn)橐院诠坭锦r果制作的酵素在發(fā)酵過(guò)程中轉(zhuǎn)化生成了其他種類(lèi)的有機(jī)酸，不在檢測(cè)的13種有機(jī)酸類(lèi)型當(dāng)中。

2.4 四種黑果枸杞酵素對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

由圖2可知，XD、GD、XF、GF對(duì)DPPH自由基的清除能力在一定體積分?jǐn)?shù)范圍(0.02%～0.75%)內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng)，DPPH自由基清除率分別從20.61%、24.88%、14.51%、15.56%上升到91.98%、91.76%、92.43%、92.99%。VC在0.02～0.12 mg/mL范圍內(nèi)，清除率從41.44%上升到63.98%。經(jīng)SPSS軟件計(jì)算，4種酵素的IC50為0.049 mg VC/mL，且XD、GD、XF、GF的IC50分別為0.071%、0.055%、0.082%、0.066%，其中，GD的IC50最低，說(shuō)明在一定體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，GD清除DPPH自由基的能力相對(duì)較強(qiáng)。

圖2 四種黑果枸杞酵素的DPPH自由基清除能力

2.5 四種黑果枸杞酵素總抗氧化能力的測(cè)定

由圖3可知，XD、GD、XF、GF的總抗氧化能力在一定體積分?jǐn)?shù)范圍(0.25%～1.5%)內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng)，總抗氧化能力分別從0.230、0.300、0.156、0.190 U/mL上升到1.485、1.548、0.682、1.085 U/mL，VC在0.02～0.2 mg/mL范圍內(nèi)，總抗氧化能力從0.253 U/mL上升到2.264 U/mL。體積分?jǐn)?shù)為1.5%的XD和GD與0.12 mg/mL VC溶液(1.516 U/mL)總抗氧化能力相當(dāng)，體積分?jǐn)?shù)為1.25%的XF(0.571 U/mL)與0.04 mg/mL VC溶液(0.537 U/mL)總抗氧化能力相當(dāng)，體積分?jǐn)?shù)為1.5%的GF(1.085 U/mL)與0.08 mg/mL VC溶液(0.999 U/mL)總抗氧化能力相當(dāng)。綜合以上結(jié)果可知，在一定濃度范圍內(nèi)，GD的總抗氧化能力相對(duì)較強(qiáng)。

圖3 四種黑果枸杞酵素的總抗氧化能力

2.6 四種黑果枸杞酵素對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定

由圖4可知，XD、GD、XF、GF對(duì)羥自由基的清除能力在一定體積分?jǐn)?shù)范圍(0.5%～2.5%)內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng)，羥自由基清除率分別從52.37%、45.25%、54.45%、49.85%上升到79.23%、90.95%、85.01%、87.09%。VC在0.02～0.2 mg/mL范圍內(nèi)，清除率從56.68%升到97.92%。經(jīng)SPSS軟件計(jì)算，4種酵素的IC50為0.017 mg VC/mL，且XD、GD、XF、GF的IC50分別為0.536%、0.738%、0.488%、0.606%，其中，XF的IC50最低，說(shuō)明在一定濃度范圍內(nèi)，XF清除羥自由基的能力相對(duì)較強(qiáng)。

圖4 四種黑果枸杞酵素的羥自由基清除能力

2.7 四種黑果枸杞酵素還原力的測(cè)定

由圖5可以看出，XD、GD、XF、GF的還原力在一定體積分?jǐn)?shù)范圍(0.25%～1.5%)內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng)，還原力分別從0.098、0.180、0.116、0.176上升到0.615、1.090、0.814、1.142。VC在0.02～0.12 mg/mL范圍內(nèi)，還原力從0.114升到0.799。經(jīng)SPSS軟件計(jì)算，4種酵素的IC50為0.071 mg VC/mL，且XD、GD、XF、GF的IC50分別為1.251%、0.596%、0.938%、0.640%，其中，GD的IC50最低，說(shuō)明在一定濃度范圍內(nèi)，GD的還原能力相對(duì)較強(qiáng)。

圖5 四種黑果枸杞酵素的還原力

2.8 代謝物質(zhì)及抗氧化能力的相關(guān)性分析

采用Pearson法對(duì)4種黑果枸杞酵素中的相關(guān)代謝物質(zhì)及抗氧化能力進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 相關(guān)性分析結(jié)果

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)

由表5可知，DPPH自由基清除與總蛋白、花青素、總黃酮、總酚及有機(jī)酸均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，說(shuō)明DPPH自由基清除主要受總蛋白、花青素、總黃酮、總酚及有機(jī)酸的影響?？偪寡趸芰εc總蛋白、花青素、總黃酮、總酚及淀粉酶均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與有機(jī)酸呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，說(shuō)明總抗氧化能力主要受總蛋白、花青素、總黃酮、總酚、淀粉酶及有機(jī)酸的影響。羥自由基清除與SOD酶呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，說(shuō)明羥自由基清除主要受SOD酶的影響。還原力與有機(jī)酸呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，說(shuō)明還原力主要受有機(jī)酸的影響。

3 討論

通過(guò)比較4種酵素發(fā)酵完成后的活性成分含量差異發(fā)現(xiàn)(表3)，除了微生物代謝作用這一主要變化因素之外，XD和GD的成分含量分別高于XF和GF(除SOD酶外)，說(shuō)明由于黑果枸杞的極高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，導(dǎo)致了單一酵素的質(zhì)量水平比復(fù)合酵素相對(duì)較好，而SOD酶活性差異，可能是由于其他輔料添加而導(dǎo)致的。GD和GF的成分含量分別高于XD和XF(除SOD酶和淀粉酶外)，可能是由于干果與水比例偏大，導(dǎo)致干果酵素質(zhì)量水平高于鮮果酵素，而SOD酶和淀粉酶活性差異，猜測(cè)原因?yàn)楹诠坭皆诟芍七^(guò)程中多種酶活性被破壞所致。

4種酵素在一定的試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，具有良好的體外抗氧化效果，且呈劑量依賴(lài)效應(yīng)，這與程勇杰等[23]研究結(jié)果類(lèi)似。經(jīng)過(guò)SPSS計(jì)算IC50后，GD在清除DPPH自由基、總抗氧化能力和還原力方面相對(duì)較強(qiáng)，同時(shí)根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果(表5)，分析原因主要是由于GD中花青素、總黃酮、總酚、維生素和有機(jī)酸含量相對(duì)較高，這些物質(zhì)的作用取決于其分子質(zhì)量、芳香環(huán)的多少及羥基取代基等相關(guān)性質(zhì)[24]，尤其會(huì)受有機(jī)酸的影響[25]。XF在羥自由基清除能力方面相對(duì)較強(qiáng)，根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果(表5)，推測(cè)原因可能是XF中SOD酶含量較高或者存在高效清除羥自由基的活性物質(zhì)[26]。

4 結(jié)論

本文針對(duì)黑果枸杞酵素中主要成分的變化情況及清除自由基能力的強(qiáng)弱進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞酵素經(jīng)自然發(fā)酵之后，品質(zhì)良好，并具有很好的抗氧化活性，同時(shí)由于鮮果受季節(jié)性和貯藏條件的影響，以干果為主要原料制備酵素(GD和GF)能夠相對(duì)較好地適用于企業(yè)生產(chǎn)加工。但是由于自然發(fā)酵方式不能完全準(zhǔn)確地調(diào)控菌群結(jié)構(gòu)，可能會(huì)導(dǎo)致雜菌污染，因此，從自然發(fā)酵酵素中分離出優(yōu)勢(shì)菌種，再用于酵素接種發(fā)酵加工生產(chǎn)中，將對(duì)酵素的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展起到推動(dòng)作用。