武月霞，司姍姍，張 昕，連克乾

（1.南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院番禺院區(qū)正畸科，廣州 511400；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科，廣州 510080；3.南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院番禺院區(qū)牙體牙髓科，廣州 511400；4.南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院番禺院區(qū)種植修復(fù)科，廣州 511400）

牙周炎是一種以多種炎癥反應(yīng)為特征的慢性炎癥性疾病，包括牙槽骨，牙骨質(zhì)，牙周膜（PDL），牙齦組織等牙周組織的破壞，這也是導(dǎo)致牙齒脫落的主要原因［1］。革蘭氏陰性厭氧菌，如牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis），被認(rèn)為造成成人慢性牙周炎的重要原因［2］，而革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分脂多糖（LPS），被證明是造成牙周病的重要危險(xiǎn)因素［3］。在不同的革蘭氏陰性菌種中LPS的組成成分不同。 LPS能夠增加成骨細(xì)胞炎性溶骨因子（如前列腺素E2）的釋放速率，從而間接刺激骨吸收［4］。

TLRs是先天性抗微生物和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，并在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。有研究表明LPS通過(guò)與病原體相關(guān)的模式分子結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，從而介導(dǎo)Toll樣受體（TLR）［5］。然而，當(dāng)在感染過(guò)程中TLR被過(guò)度激活或不適當(dāng)?shù)乜刂茣r(shí)，可能會(huì)造成炎性相關(guān)疾病例如牙周炎的發(fā)生［6］。盡管如此，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞表達(dá)TLR并且通過(guò)TLR刺激的破骨細(xì)胞生成而被激活表明TLR可能將炎癥與骨代謝相聯(lián)系［7］。TLRs有很多種表型，文獻(xiàn)報(bào)道，TLR2不僅參與LPS的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，還能識(shí)別分枝桿菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的脂磷壁酸和脂蛋白受體［8］。研究顯示在牙周炎病變中有TLR2的上調(diào)［9］。然而，牙周炎疾病中人骨細(xì)胞TLR2的表達(dá)水平和作用尚不清楚。

生理性骨重塑被骨形成和骨吸收之間的平衡控制。骨唾液蛋白和白細(xì)胞介素-8（IL-8）是與骨代謝密切相關(guān)的兩種主要蛋白。骨涎蛋白基因表達(dá)的調(diào)節(jié)在成骨細(xì)胞的分化、骨基質(zhì)礦化和腫瘤轉(zhuǎn)移中具有重要作用［10］。IL-8被證明與多種疾病密切。它是一種重要的促炎細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)因子，能夠誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化成熟，從而維持牙周組織破骨細(xì)胞吸收活性。研究表明IL-8基因的表達(dá)能夠被多種刺激激活，從而誘導(dǎo)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。IL-8不僅能夠抑制成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，而且還可以作為破骨細(xì)胞分化和骨吸收的直接的刺激物［11］。

有文獻(xiàn)報(bào)道，0.1mg/L LPS能夠減少大鼠成骨細(xì)胞樣細(xì)胞中骨唾液蛋白mRNA的水平，而0.01mg/L LPS能夠增加大鼠成骨細(xì)胞樣細(xì)胞中骨唾液蛋白mRNA的表達(dá)［12］。但其具體機(jī)制尚不清楚，本研究擬體外培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞，并進(jìn)一步探討LPS調(diào)節(jié)人牙周膜成纖維細(xì)胞骨唾液蛋白和IL-8表達(dá)的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；胰蛋白酶（Gibco，美國(guó)）；Lipofectamine 2000（Invitrogen，Grand Island，NY，美國(guó)）；LPS（Invivogen，San Diego，CA，美國(guó)）；小干擾RNA（siTLR2）（GCU GAUGCC GCU GAU GCC AdTdT-）（銳博生物，中國(guó)廣州）；對(duì)照siRNA（siNT）（Control）（GCU GAUGCC GCU GAU GCC AdTdT-）（銳博生物，中國(guó)廣州）；EXScript RT reagent Kit 和SYBR Premix Ex Taq（QIAGEN，Tokyo，Japan）；Beta-actin（Santa Cruz Biotechnology，美國(guó)）；hPDLFs（上海中科院細(xì)胞庫(kù)）；RT-PCR儀（Bio-rad，美國(guó)）引物由軟什primer5設(shè)計(jì)，Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與鋪板hPDLFs培養(yǎng)于含10% FBS和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，每?jī)商鞊Q液一次，培養(yǎng)2～3周。然后用礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基（不含酚紅的MEM，10%FBS，10-8μM地塞米松，10 mMβ-甘油磷酸，50μg/mL抗壞血酸）替換第三代粘附誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)基，以刺激hPDLFs的成骨分化。然后將細(xì)胞接種于六孔板中，每組三個(gè)復(fù)孔，每孔4萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。貼壁培養(yǎng)24h后，更換MEM培養(yǎng)基（含1%青鏈霉素，無(wú)血清）繼續(xù)培養(yǎng)12h。

1.2.2 濃度依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)和時(shí)間依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基將LPS稀釋成不同濃度（0.1、1、10 和 50 mg/L），然后加入孔板中孵育8h進(jìn)行濃度依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)；選取10mg/L LPS濃度LPS加入孔板中孵育0、2、4、8、12小時(shí)，進(jìn)行時(shí)間依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，采用RNeasy Mini Kit和RNase-Free DNase Set試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，檢測(cè)基因濃度及完整性，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成相應(yīng)cDNA，以β-actin為內(nèi)參基因。配制real-time PCR 20μL反應(yīng)體系，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)（反應(yīng)參數(shù)均根據(jù)試劑盒使用說(shuō)明），反應(yīng)完成后進(jìn)行擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列表

1.2.3 siRNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)當(dāng)hPDLFs達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞鋪與六孔板中，每孔4萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，但細(xì)胞密度達(dá)到50～70%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將siTLR2或siNT與Lipo2000共孵育15～20 min后，加入孔板中，轉(zhuǎn)染濃度為20nM，具體轉(zhuǎn)染步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)，無(wú)血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染24h后，更換含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h，然后加入10mg/mL LPS繼續(xù)培養(yǎng)8h，對(duì)照組不加LPS刺激。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)提取總RNA，q-RT-PCR檢測(cè)骨唾液蛋白和IL-8 mRNA水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)從復(fù)獨(dú)立進(jìn)行三次。采用Graphpad Prism 5.0 進(jìn)行作圖，SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，行單因素方差分析，以LSD法進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS調(diào)節(jié)骨唾液酸蛋白mRNA的表達(dá)通過(guò)qPCR檢測(cè)不同LPS濃度（0.1、1、10 和 50 mg/L）刺激和刺激不同時(shí)間（0、2、4、8、12h）后hPDLFs的骨唾液酸蛋白mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果如圖1和圖2所示。由圖1可知，在于LPS孵育8h后，除0.1mg/mL LPS顯著增加hPDLFs的骨唾液酸蛋白mRNA的表達(dá)外，隨著LPS濃度的進(jìn)一步增加，骨唾液酸蛋白mRNA的表達(dá)逐漸顯著降低。圖2表明，骨唾液酸蛋白mRNA的表達(dá)隨著LPS刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸降低，8h時(shí)有最低值，進(jìn)一步增加刺激時(shí)間，骨唾液酸蛋白mRNA的表達(dá)不再降低，結(jié)果具有顯著性差異。

圖1 不同濃度LPS對(duì)骨唾液酸蛋白mRNA的影響

圖2 LPS處理不同時(shí)間對(duì)骨唾液酸蛋白mRNA的影響

2.2 LPS調(diào)節(jié)IL-8 mRNA的表達(dá)通過(guò)qPCR檢測(cè)不同LPS濃度（0.1、1、10 和 50 mg/L）刺激和刺激不同時(shí)間（0、2、4、8、12h）后hPDLFs的IL-8的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3和圖4所示。由圖3可知，隨著LPS濃度的增加，hPDLFs的IL-8的表達(dá)顯著增加，具有濃度依賴(lài)性，當(dāng)LPS濃度為10mg/mL時(shí)，IL-8的表達(dá)有最高，進(jìn)一步增加LPS濃度，hPDLFs的IL-8的表達(dá)不再增加。由圖4可知，隨著刺激時(shí)間增加，hPDLFs的IL-8的表達(dá)水平也顯著升高，8h時(shí)有最大值，進(jìn)一步增加刺激時(shí)間至12h時(shí)，IL-8的表達(dá)水平顯著減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖3 不同濃度LPS對(duì)IL-8 mRNA的影響

圖4 LPS處理不同時(shí)間對(duì)IL-8 mRNA的影響

2.3 siTLR2對(duì)LPS調(diào)節(jié)骨唾液酸蛋白和IL-8 mRNA表達(dá)的影響為進(jìn)一步探討LPS調(diào)節(jié)骨唾液酸蛋白和IL-8 mRNA表達(dá)的相關(guān)機(jī)制，本研究采用siTLR2轉(zhuǎn)染hPDLFs，qPCR檢測(cè)TLR2 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明siTLR2能夠顯著抑制TLR2 mRNA的表達(dá)。采用siTLR2和LPS共處理hPDLFs，qPCR檢測(cè)骨唾液酸蛋白mRNA和IL-8 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖6和圖7。由圖6可知，siTLR2轉(zhuǎn)染過(guò)后，完成廢除了LPS抑制骨唾液酸蛋白mRNA的表達(dá)的作用，反而增加了骨唾液酸蛋白mRNA的表達(dá)。由圖7可知，siTLR2轉(zhuǎn)染同樣完全廢除了LPS增加IL-8 mRNA水平的作用，反而顯著降低IL-8 mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TLR2在LPS調(diào)節(jié)骨唾液酸蛋白和IL-8 mRNA表達(dá)的作用中起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的作用。LPS可能通過(guò)調(diào)節(jié)TLR2的表達(dá)從而影響唾液酸蛋白和IL-8 mRNA的表達(dá)。

圖5 LPS處理不同時(shí)間對(duì)IL-8 mRNA的影響（***P＜0.001）

3 討論

LPS作為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的一種成分，具有非常高的毒性和抗原性，在牙周病的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵的作用。研究表明LPS不僅能夠直接誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，還能夠通過(guò)成骨細(xì)胞的作用間接影響牙槽骨吸收，并直接作用于破骨細(xì)胞［13］。在本研究中，我們研究了LPS調(diào)節(jié)骨唾液蛋白和IL-8 mRNA表達(dá)的作用。并且采用具有干細(xì)胞和多向分化潛能的特點(diǎn)的hPDLFs進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)［14］。

圖6 siTLR2對(duì)LPS調(diào)節(jié)骨唾液酸蛋白mRNA表達(dá)的影響

圖7 siTLR2對(duì)LPS調(diào)節(jié)IL-8 mRNA表達(dá)的影響（**P＜0.01）

有文獻(xiàn)報(bào)道，在ROS17/2.8細(xì)胞上，高劑量LPS能夠降低骨唾液蛋白的表達(dá)，而低劑量LPS能夠增加骨唾液蛋白的表達(dá)［12］。本研究中，LPS能夠濃度依賴(lài)性的調(diào)節(jié)hPDLFs中骨唾液蛋白的表達(dá)，而且。高劑量LPS（10mg/mL）刺激8h顯著上調(diào)hPDLFs中IL-8的表達(dá)水平。這些研究結(jié)果表明LPS能夠同時(shí)調(diào)節(jié)骨唾液蛋白和IL-8的轉(zhuǎn)錄水平。

LPS能夠通過(guò)TLR2通路激活上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，提示LPS可能在TLR表達(dá)的細(xì)胞中充當(dāng)TLR2的激動(dòng)劑［15］。有文獻(xiàn)報(bào)道0.01mg/mL LPS能夠ROS17/2.8細(xì)胞中TLR2 mRNA的表達(dá)。本研究中，我們之間用siRNA去敲除TLR2，研究表明siTLR2顯著廢除了LPS調(diào)節(jié)骨唾液蛋白和IL-8 mRNA表達(dá)的作用。siTLR2單獨(dú)作用能夠顯著增加骨唾液蛋白mRNA的表達(dá)，可能原因?yàn)閟iTLR2同時(shí)能夠影響其他調(diào)節(jié)骨唾液蛋白mRNA表達(dá)的蛋白或細(xì)胞因子，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。有研究報(bào)道，IL-8對(duì)破骨細(xì)胞分化和骨吸收的刺激作用依賴(lài)于破骨細(xì)胞表面上的特異性IL-8受體（CXCR1）［16］。單核細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的樹(shù)突狀細(xì)胞能夠被TLR的下游信號(hào)分子IL-8所調(diào)控［17］，進(jìn)一步揭示的IL-8和TLR之間的聯(lián)系。本研究進(jìn)一步證實(shí)了這一聯(lián)系。

本研究揭示了LPS對(duì)骨唾液蛋白和IL-8 mRNA的調(diào)節(jié)作用，而且這種作用可能與其直接調(diào)節(jié)TLR2的表達(dá)有關(guān)。