楊玲玲 何艷桃 王宇欣 馬會(huì)明 徐 仙

1 寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川市 750004； 2 寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 3 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心

顆粒細(xì)胞與卵泡的發(fā)育密切相關(guān)，它的狀態(tài)及其數(shù)量可作為預(yù)測卵泡發(fā)育能力、胚胎質(zhì)量以及妊娠結(jié)局生物學(xué)標(biāo)志物[1-3]。顆粒細(xì)胞的生理功能主要依賴于外周血中的生殖激素(FSH、LH、E2和雄激素)以及卵泡微環(huán)境中自分泌和旁分泌的細(xì)胞因子(IGF-1、TGF-α等)，它們對顆粒細(xì)胞的增殖、發(fā)揮生理功能以及對卵泡成熟和排卵很重要[4]。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1是促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖、發(fā)揮生理功能的重要因子。適當(dāng)濃度的IGF-1作為顆粒細(xì)胞重要的有絲分裂原，可促進(jìn)FSH對顆粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用[5]，同時(shí)通過影響P450的生成促進(jìn)顆粒細(xì)胞芳香化酶的活性，使E2水平升高，進(jìn)而促進(jìn)卵泡的發(fā)育[6]。且有研究證實(shí)IGF-1與LH、FSH、GH、hCG、IGFs有協(xié)同作用，共同促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖[7]。因此，積極尋找IGF-1對小鼠顆粒細(xì)胞增殖作用的最佳時(shí)間是本研究的重點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來源 具有正常動(dòng)情周期的清潔級雌性昆明白4周齡小鼠(質(zhì)量18～22g)，購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證編號(hào)SCXK(寧)2015-0001]，動(dòng)物飼養(yǎng)條件:溫度(22±2)℃;濕度50%～65%,光照周期12h∶12h,通風(fēng)良好,標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由進(jìn)食飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 TCM199：美國 Gibco公司；胎牛血清：美國 Gibco 公司；青、鏈霉素、0.05% Trypsin-EDTA(1x):GIBCO；C57顆粒細(xì)胞系：上交大醫(yī)學(xué)院吳際教授贈(zèng)送；低溫離心機(jī)：德國Eppendorf公司；二甲基亞砜：美國 Sigma 公司；IGF-1：北京科昕生物科技有限公司；超凈工作臺(tái)：新加坡ESCO公司；96孔板：COSTAR公司；37℃ 5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：HEAL FORCE 公司；CCK-8試劑盒：大連美侖生物技術(shù)有限公司；多功能酶標(biāo)儀：美國Thermo Fisher公司;全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒：中國江蘇凱基生物公司；蛋白Mark：美國Thermo Fisher公司；蛋白電泳儀：美國BIO-RAD；PCNA：中國北京博奧森公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)及分組：按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法[8]，取小鼠顆粒細(xì)胞培養(yǎng)后，吸取細(xì)胞混合液移至1.5ml EP管中，離心棄上清液。加入TCM199培養(yǎng)基吹打混勻，置于60mm培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，次日更換新鮮TCM199。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至 70%～80%時(shí)，加入胰蛋白酶(含EDTA)0.5/60mm消化、進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組：小鼠顆粒細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿，細(xì)胞密度調(diào)整為1×104個(gè)，每組設(shè)置3個(gè)平行培養(yǎng)皿，并設(shè)不含細(xì)胞的空白培養(yǎng)皿，減少CCK-8檢測誤差。實(shí)驗(yàn)分為兩組:空白對照組和IGF-1 培養(yǎng)組，空白對照組是基礎(chǔ)培養(yǎng)基TCM199培養(yǎng)基，含100U/ml雙抗、10%FBS、EGF等。IGF-1 培養(yǎng)組是在空白對照組的基礎(chǔ)上添加100ng/ml的IGF-1，對兩組細(xì)胞37℃ 繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 CCK-8檢測顆粒細(xì)胞增殖情況：將對數(shù)生長期的顆粒細(xì)胞以每孔3×103接種于96孔培養(yǎng)板中，平行接種兩組，設(shè)6個(gè)復(fù)孔；每孔加完全培養(yǎng)基100μl。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，用完全培養(yǎng)基將IGF-1配置成100ng/ml濃度加入實(shí)驗(yàn)組，對照組只加完全培養(yǎng)基。分別在培養(yǎng)后6h、9h、12h加入CCK-8試劑10μl,再孵育4h,在波長450nm下，用酶標(biāo)儀檢測培養(yǎng)細(xì)胞光密度(OD)。

1.3.4 Western blot檢測PCNA蛋白的表達(dá)：兩組顆粒細(xì)胞培養(yǎng)9h后，清洗，消化并裂解細(xì)胞，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)定量試劑盒測蛋白濃度。上樣蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗PCNA(濃度1∶800)，4℃孵育過夜，TBST漂洗4次，加入鼠二抗(1∶20 000)，室溫?fù)u床孵育1h，超敏ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，曝光。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測顆粒細(xì)胞增殖情況 CCK-8結(jié)果可見，與空白對照組相比，IGF-1培養(yǎng)組增殖能力顯著增加(P<0.05)，IGF-1培養(yǎng)6h、9h、12h后，小鼠顆粒細(xì)胞在9h增殖速度最快，繼續(xù)培養(yǎng)出現(xiàn)不同程度的抑制作用。見圖1。

圖1CCK-8檢測各時(shí)間段OD值

注：兩組比較，**P<0.05。

2.2 Western blot檢測顆粒細(xì)胞增殖標(biāo)記PCNA蛋白表達(dá)水平 PCNA可間接反映細(xì)胞增殖情況，IGF-1培養(yǎng)組中PCNA蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，反映IGF-1培養(yǎng)組顆粒細(xì)胞較空白對照組增殖快。該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。見圖2。

圖2Westernblot檢測PCNA蛋白表達(dá)及灰度值分析

注：兩組比較，**P<0.01。

3 討論

卵泡生長發(fā)育異?？赡苁且鸹颊卟慌怕鸭皟?nèi)分泌改變的病理基礎(chǔ)，卵巢卵泡生長發(fā)育異常與顆粒細(xì)胞的增殖調(diào)控密切相關(guān)。研究證實(shí)：調(diào)節(jié)卵泡生長發(fā)育的生長因子都參與顆粒細(xì)胞增殖的過程[9-10]。IGF-1是一類多肽生長因子，由70多個(gè)氨基酸組成，其編碼基因位于12號(hào)染色體短臂上[11]，其主要作用之一就是在卵泡發(fā)育的不同階段促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖、分化，抑制顆粒細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞的生存，其通過自分泌和旁分泌的方式發(fā)揮作用。IGF-1對顆粒細(xì)胞的增殖主要通過促進(jìn)顆粒細(xì)胞有絲分裂、刺激RNA和DNA合成作用，從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖[12-13]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[14-15]，體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞單一添加FSH或IGF-1均能使激素合成增加，當(dāng)同時(shí)添加FSH和IGF-1時(shí)，培養(yǎng)液中E2合成增加。由此推斷IGF-1可增強(qiáng)促性腺激素促進(jìn)卵泡發(fā)育。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組相比，IGF-1培養(yǎng)組顆粒細(xì)胞在9h細(xì)胞增殖速度最快，提示小鼠卵巢顆粒細(xì)胞經(jīng)IGF-1處理后細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，該結(jié)論證實(shí)IGF-1促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促進(jìn)卵泡發(fā)育，對生殖功能調(diào)節(jié)具有重要作用，為IGF-1在輔助生殖領(lǐng)域臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

細(xì)胞增殖核抗原(Proliferatingcell nuclear antigen,PCNA)是DNA聚合物酶δ的輔助蛋白，可參與NDA合成，廣泛存在于體內(nèi)增殖旺盛的細(xì)胞中，是細(xì)胞生長和增殖的標(biāo)記物[16]。本研究以PCNA蛋白的表達(dá)可作為判斷顆粒細(xì)胞增殖活性的標(biāo)志。Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組相比，IGF-1培養(yǎng)組中PCNA蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，明確經(jīng)IGF-1處理增強(qiáng)了顆粒細(xì)胞增殖能力，進(jìn)一步證實(shí)了 IGF-1 可促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖，促進(jìn)卵泡生長,減少卵泡發(fā)育障礙，為生育力保護(hù)和保存提供很好的策略。

綜上所述，IGF-1作為調(diào)節(jié)卵泡生長發(fā)育的生長因子之一，其主要的作用之一就是在卵泡發(fā)育的不同階段促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，本研究中IGF-1可顯著性促進(jìn)小鼠顆粒細(xì)胞在體外培養(yǎng)9h的增殖能力。