陳瑾軒，印春華

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

急性肝損傷(Acute Liver Injury， ALI)是臨床常見(jiàn)疾病之一，可導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞嚴(yán)重受損，肝組織中大量肝細(xì)胞壞死和凋亡，肝功能衰竭[1].目前治療急性肝損傷的手段包括血漿置換、體外肝臟輔助裝置、肝臟移植等[2]，這些手段價(jià)格昂貴，治療風(fēng)險(xiǎn)大，患者順應(yīng)性差，缺乏特效藥物治療急性肝損傷.腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α， TNF-α)具有潛在的細(xì)胞毒性，可引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其過(guò)度表達(dá)與ALI相關(guān)[3].RNA干擾(RNA interference， RNAi)是一項(xiàng)誘導(dǎo)序列特異性mRNA降解后基因沉默技術(shù)[4]，其具有高效、低毒、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已用于腫瘤、炎癥等疾病的治療，具有較大的臨床應(yīng)用潛力[5-6].其中，短發(fā)夾RNA(shRNA)是誘導(dǎo)RNAi的常用手段之一，shRNA是含反向重復(fù)序列的發(fā)夾狀RNA，先克隆至pDNA表達(dá)載體，進(jìn)入細(xì)胞核持續(xù)轉(zhuǎn)錄shRNA后被Dicer酶切割為siRNA可發(fā)揮RNAi功效，故shRNA介導(dǎo)的基因沉默功效較siRNA更穩(wěn)定與持久[7].不過(guò)pDNA體內(nèi)穩(wěn)定性差；與荷負(fù)電細(xì)胞膜靜電相斥，不易被細(xì)胞攝取，轉(zhuǎn)染率低[8].故需借助安全有效的載體，遞送pDNA至靶細(xì)胞，發(fā)揮基因沉默功效.

近年來(lái)，非病毒納米載體在基因抗炎癥研究中發(fā)展迅速，其生物可降解，生物相容性好，無(wú)免疫原性[9]；無(wú)遺傳毒性和細(xì)胞毒性；可高效包裹、濃縮和保護(hù)pDNA[10]；表面積大，可偶聯(lián)功能配體，高效介導(dǎo)體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染[11].殼聚糖生物相容，生物可降解，無(wú)免疫原性，可進(jìn)行多種功能化修飾，用于化療藥物、基因藥物以及免疫藥物的遞送[12-13].殼聚糖經(jīng)季銨化修飾可增強(qiáng)其水溶性和正電性，增強(qiáng)聚合物與基因藥物的結(jié)合力，也可與小腸緊密連接處的荷負(fù)電脂質(zhì)作用，打開(kāi)緊密連接，促進(jìn)小腸吸收[14]；?；撬峥删徑饧毙愿螕p傷[15]，且文獻(xiàn)報(bào)道[16]膽汁酸在分泌出肝細(xì)胞前會(huì)與甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合，以結(jié)合物形式被小腸吸收并歷經(jīng)多次腸肝循環(huán)，以牛磺酸修飾殼聚糖，進(jìn)入肝臟的納米復(fù)合物有望通過(guò)?；撬峄鶊F(tuán)與膽汁酸結(jié)合后進(jìn)入腸道，再被腸道重吸收進(jìn)入全身循環(huán)，提高基因藥物的生物利用度[16-18]；殼聚糖經(jīng)巰基化修飾可與小腸黏液層糖蛋白和細(xì)胞膜表面富含半胱氨酸的區(qū)域交聯(lián)形成二硫鍵，增強(qiáng)黏膜黏附和細(xì)胞攝取[19].

本實(shí)驗(yàn)合成了牛磺酸修飾殼聚糖季銨鹽(Taurine-modified Trimethyl chitosan, TT)和?；撬嵝揎棊€基化殼聚糖季銨鹽(Taurine-modified Trimethyl Chitosan-cysteine, TTC)聚合物，TT和TTC包載沉默腫瘤壞死因子-α的質(zhì)粒編碼短發(fā)夾RNA(shTNF-α pDNA)，形成納米粒(TT-shTNF-α pDNA和TTC-shTNF-α pDNA)，考察納米粒的理化性質(zhì)、細(xì)胞毒性、攝取與攝取途徑、體外基因沉默效果等.

1 材料與方法

1.1 材料與細(xì)胞

殼聚糖(脫乙酰度： 85%，分子量： 200kDa)購(gòu)自浙江金殼藥業(yè)有限公司；?；撬?Taurine，Tau)、L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-cysteine， Cys)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide， EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide， NHS)購(gòu)自上海源聚生物科技有限公司；pGL、shTNF-α pDNA購(gòu)自山東維真生物科技有限公司；過(guò)濾器CS1(Filtration CS1)、吸附柱CP6(Spin Columns CP6)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；粗糠柴毒素(Rottlerin)、異硫氰酸熒光素(Fluorescein Isothiocyanate， FITC)購(gòu)自Sigma；染料木素(Genistein)、氯丙嗪(Chlorpromazine)購(gòu)自Selleck Chemicals；TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；其他試劑均為分析純.

Raw 264.7細(xì)胞(ATCC，美國(guó))，以含10% FCS、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、100U/mL氨芐青霉素和100U/mL鏈霉素的DMEM于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2 方法

1.2.1 TT和TTC的合成與表征

參照文獻(xiàn)[20]方法合成N,N,N-三甲基殼聚糖季銨鹽(TMC).稱(chēng)取0.1g Tau溶于2mL H2O，加入0.08g EDC和0.05g NHS，以1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.8，攪拌活化24h；稱(chēng)取0.05g TMC，溶于5mL H2O，加至Tau反應(yīng)液中，攪拌5h，以pH 5.0 HCl溶液透析3d(MWCO 3500 Da)，冷凍干燥，所得產(chǎn)物即為T(mén)T.

稱(chēng)取0.05g TT，溶于5mL H2O；稱(chēng)取0.1g Cys，溶于1mL H2O，以10mol/L NaOH調(diào)節(jié)Cys溶液pH至2.0，混合TT與Cys溶液，加入0.23g EDC和0.14g NHS，以1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至5.0，避光攪拌反應(yīng)5h，以pH 5.0 HCl溶液4℃透析3d，所得產(chǎn)物即為T(mén)TC.

TMC和TT分別溶于氘水(D2O)，以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)，核磁共振儀測(cè)定1H NMR圖譜.參照文獻(xiàn)[20]方法測(cè)定TTC游離巰基和二硫鍵含量.

1.2.2 納米粒的制備與表征

以H2O配制2mg/mL TT、TTC溶液和0.2mg/mL shTNF-α pDNA溶液，渦旋下滴加一定體積的shTNF-α pDNA溶液分別至TT和TTC溶液中，制備聚合物-shTNF-α pDNA質(zhì)量比為20∶1的納米粒，37℃水浴30min，制得納米粒，分別命名為T(mén)T-shTNF-α pDNA和TTC-shTNF-α pDNA.

ZetasizerNano-ZS型電位及粒度測(cè)定儀測(cè)定納米粒的粒徑和Zeta電勢(shì).量取一定體積的裸shTNF-α pDNA或TT-shTNF-α pDNA、TTC-shTNF-α pDNA(含2μg shTNF-α pDNA)，加入適量溴酚藍(lán)混合均勻，加樣至1%瓊脂糖凝膠上樣孔，130V電泳40min，Gelsafe核酸染料顯色，F(xiàn)R-980A生物電泳圖像分析系統(tǒng)觀(guān)察.

1.2.3 納米粒穩(wěn)定性

按1.2.2項(xiàng)下方法制備TT-shTNF-α pDNA和TTC-shTNF-α pDNA，以1mol/L HCl調(diào)節(jié)納米粒溶液pH至1.2，測(cè)定其粒徑和Zeta電勢(shì)，再將pH 1.2的納米粒溶液以1mol/L NaOH回調(diào)pH至7.4，測(cè)定其粒徑和Zeta電勢(shì).量取一定體積的TT-shTNF-α pDNA和TTC-shTNF-α pDNA溶液，分別與0.4，0.8，1.0，1.6，2.0，4.0和8.0mg/mL肝素鈉溶液等體積混合，使肝素鈉終濃度為0.2，0.4，0.5，0.8，1.0，2.0和4.0mg/mL，室溫避光靜置2h，加入適量溴酚藍(lán)混合均勻，加樣至1%瓊脂糖凝膠上樣孔，130V 電泳40min，Gelsafe核酸染料顯色，F(xiàn)R-980A生物電泳圖像分析系統(tǒng)觀(guān)察.

1.2.4 體外釋放

參照文獻(xiàn)[21]方法制備異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記shTNF-α pDNA，制備包載FITC-pDNA的納米粒(含5μg FITC-pDNA)，13300r/min離心15min，棄上清，沉淀加入500μL PBS(0.2mol/L，pH 7.4)，重懸分散，37℃，100r/min培養(yǎng)，分別于1，2，4，6，8，12和24h 13300r/min離心15min，吸取上清250μL，同時(shí)補(bǔ)充250μL釋放介質(zhì)，酶標(biāo)儀測(cè)定FITC-pDNA含量(λex=488nm，λem=519nm)，計(jì)算累積釋放百分率(%)，繪制釋放曲線(xiàn).

1.2.5 細(xì)胞毒性

按1.2.2項(xiàng)下方法制備載無(wú)功能質(zhì)粒pGL的TT-pGL和TTC-pGL納米粒，以1×104細(xì)胞/孔密度接種Raw 264.7細(xì)胞至96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h，每6孔為一組，按每孔5，50，250，1000和1500μg/mL 聚合物加入2mg/mL TT和TTC聚合物溶液，按每孔2，4，6，8，10和20μg/mL pGL加入TT-pGL和TTC-pGL，以加0.2mol/L pH 7.4 PBS的孔為對(duì)照，37℃、5%CO2培養(yǎng)6h；吸棄孔內(nèi)液體，每孔分別加入200μL新鮮培養(yǎng)基和20μL以0.2mol/L PBS(pH 7.4)配制的5mg/mL MTT溶液，37℃、5%CO2培養(yǎng)3h；每孔液體換為200μL DMSO，37℃、100r/min振蕩30min，測(cè)定570nm吸光值，以對(duì)照孔吸光值為100%存活率，計(jì)算各組細(xì)胞相對(duì)存活率.

1.2.6 細(xì)胞攝取

以5×104細(xì)胞/孔密度接種Raw 264.7細(xì)胞至24孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h，將每孔液體換為DMEM，3孔為一組，按照每孔2μg/mL FITC-pDNA加入TT-FITC-pDNA、TTC-FITC-pDNA和裸FITC-pDNA，37℃、5%CO2培養(yǎng)4h；棄去孔中液體，每孔加0.2mol/L PBS(pH 7.4)洗3次，棄去PBS，每孔加0.5mL 0.5%(質(zhì)量濃度)SDS溶液(pH 8.0)，37℃、100r/min避光振蕩30min，酶標(biāo)儀測(cè)定FITC-pDNA的熒光強(qiáng)度(λex=488nm，λem=519nm)，Lowry法測(cè)定細(xì)胞蛋白含量，攝取量以每毫克蛋白含F(xiàn)ITC-pDNA的量(μg)表示(μg/mg).

1.2.7 細(xì)胞攝取機(jī)制

1.2.7.1 抑制劑細(xì)胞毒性 以1×104細(xì)胞/孔的密度接種細(xì)胞至96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h；6孔為一組，每組孔中分別加入不同濃度的疊氮鈉(50，100和200mmol/L)，染料木素(5，10和20μg/mL)，氯丙嗪(0.75，1和2μg/mL)和粗糠柴毒素(10，50和100μmol/L)，以加0.2mol/L PBS(pH 7.4)的孔為對(duì)照，37℃，5%CO2培養(yǎng)6h；吸棄孔內(nèi)液體，每孔分別加入200μL新鮮培養(yǎng)基和20μL以0.2mol/L PBS(pH 7.4)配制的5mg/mL MTT溶液，37℃、5%CO2培養(yǎng)3h；每孔液體換為200μL DMSO，37℃、100r/min振蕩30min，測(cè)定570nm吸光值，以對(duì)照孔吸光值為100%存活率，計(jì)算各組細(xì)胞相對(duì)存活率.

1.2.7.2 Raw 264.7細(xì)胞攝取機(jī)制 分別加入終濃度為50mmol/L疊氮鈉、5μg/mL染料木素、50μmol/L 粗糠柴毒素和2μg/mL氯丙嗪，37℃、5%CO2培養(yǎng)30min，加入納米粒溶液(每孔含2μg/mL FITC-pDNA)，37℃、5%CO2培養(yǎng)4h，以不加抑制劑細(xì)胞攝取量記為100%，計(jì)算各試驗(yàn)組相對(duì)細(xì)胞攝取率.

1.2.8 體外基因沉默

以4×104細(xì)胞/孔的密度接種細(xì)胞至24孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h；3孔為一組，每組孔中分別加入TT-shTNF-α pDNA和TTC-shTNF-α pDNA(每孔含6μg/mL shTNF-α pDNA)，以加0.2mol/L PBS(pH 7.4)的孔為對(duì)照，37℃、5%CO2培養(yǎng)4h，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入1mL完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)44h，孔中加入LPS，使其終濃度為10ng/mL，37℃刺激5h；吸取上清液，TNF-α ELISA試劑盒測(cè)定TNF-α含量.以對(duì)照組TNF-α含量為100%，計(jì)算各試驗(yàn)組TNF-α相對(duì)百分含量(%).

2 結(jié)果與分析

2.1 TT和TTC的合成與表征

圖1為T(mén)TC合成路線(xiàn)圖.殼聚糖上游離氨基分別與碘甲烷、Tau和Cys反應(yīng)，制得?；撬嵝揎棜ぞ厶羌句@鹽(TT)和牛磺酸修飾巰基化殼聚糖季銨鹽(TTC).

圖2為T(mén)MC和TT的1H NMR圖譜.3.26×10-6處為殼聚糖上季胺基團(tuán)的甲基氫峰，表明成功合成TMC；3.48×10-6～3.58×10-6處為?；撬?CH2-基團(tuán)氫峰，表明成功合成TT；Ellman’s法測(cè)得TTC游離巰基含量為(76.6±3.5) μmol/g，二硫鍵含量為(147.1±4.5) μmol/g.

2.2 納米粒的制備和表征

表1為T(mén)T-shTNF-α pDNA和TTC-shTNF-α pDNA粒徑和Zeta電勢(shì).可見(jiàn)TTC-shTNF-α pDNA粒徑小于TT-shTNF-α pDNA，這是因?yàn)門(mén)TC分子內(nèi)與分子間二硫鍵可提高聚合物折疊并攏和縮合shTNF-α pDNA的能力，使納米粒結(jié)構(gòu)更緊致，粒徑減小[22-23].圖3(a)為納米粒的凝膠電泳圖，納米?？?/p>

表1 TT-shTNF-α pDNA和TTC-shTNF-α pDNA粒徑和電勢(shì)Tab.1 Particle sizes and Zeta potentials of TT-shTNF-α pDNA and TTC-shTNF-α pDNA

完全阻滯shTNF-α pDNA的遷移，表明納米粒可有效縮合shTNF-α pDNA.

2.3 納米粒穩(wěn)定性

模擬從胃部酸性環(huán)境進(jìn)入腸道中性環(huán)境后的pH變化過(guò)程，研究pH 1.2至7.4時(shí)納米復(fù)合物的穩(wěn)定性，若pH變化后納米復(fù)合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，則表明納米復(fù)合物口服遞送過(guò)程中可保護(hù)所載基因藥物的完整性.表2為T(mén)T-shTNF-α pDNA和TTC-shTNF-α pDNA pH變化后的粒徑和Zeta電勢(shì).pH降至1.2時(shí)，TT-shTNF-α pDNA粒徑變化不明顯，電勢(shì)降低，TTC-shTNF-α pDNA粒徑和電勢(shì)無(wú)明顯變化，表明TTC-shTNF-α pDNA耐受胃部酸性環(huán)境

表2 pH處理后TT-shTNF-α pDNA和 TTC-shTNF-α pDNA的粒徑和電勢(shì)Tab.2 Particle sizes and Zeta potentials of TT-shTNF-α pDNA and TTC-shTNF-α pDNA after pH alteration

能力強(qiáng)于TT-shTNF-α pDNA，可在胃部環(huán)境中保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；pH回調(diào)至7.4時(shí)，TT-shTNF-α pDNA粒徑和電勢(shì)無(wú)明顯變化，TTC-shTNF-α pDNA粒徑略微增大，電勢(shì)降低，表明兩種納米粒在從胃部酸性環(huán)境進(jìn)入腸道中性環(huán)境后可保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定.

肝素鈉為黏多糖硫酸酯類(lèi)物質(zhì)，其N(xiāo)-硫酸基在水溶液中水解而產(chǎn)生較強(qiáng)負(fù)電荷，可與陽(yáng)離子復(fù)合物形成分子絡(luò)合物.當(dāng)載有負(fù)電荷pDNA的納米粒與肝素鈉溶液混合時(shí)，肝素鈉可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至納米粒，致使pDNA從納米粒中解離，因此肝素鈉解離試驗(yàn)可用于定性考察納米粒與pDNA間的結(jié)合力.圖3(b)為T(mén)T-shTNF-α pDNA和TTC-shTNF-α pDNA與不同濃度肝素鈉溶液共培育2h后的凝膠電泳圖，可見(jiàn)TT-shTNF-α pDNA和TTC-shTNF-α pDNA肝素鈉最低解離濃度均為0.5mg/mL，TT、TTC與shTNF-α pDNA結(jié)合力相同.

2.4 體外釋放

pH 7.4的PBS可模擬動(dòng)物體內(nèi)生理環(huán)境，研究pH 7.4條件下納米復(fù)合物的藥物釋放特性可預(yù)測(cè)體內(nèi)基因藥物釋放行為.圖4為T(mén)T-shTNF-α pDNA和TTC-shTNF-α pDNA在0.2mol/L PBS(pH 7.4)中的釋放曲線(xiàn)，可見(jiàn)TT-shTNF-α pDNA和TTC-shTNF-α pDNA均初期突釋后期緩釋?zhuān)?4h累積釋放百分比分別為56.0%和54.5%.

2.5 細(xì)胞毒性

圖5為T(mén)T載體、TT-pGL、TTC載體和TTC-pGL分別與Raw 264.7細(xì)胞共培養(yǎng)6h后的細(xì)胞相對(duì)存活率，可見(jiàn)TT和TTC載體在5～250μg/mL范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率均超過(guò)90%，表明此濃度范圍內(nèi)的TT和TTC載體無(wú)明顯細(xì)胞毒性；載2～6μg/mL pGL納米粒組細(xì)胞平均存活率高于90%，表明pDNA濃度在6μg/mL以下時(shí)，兩種納米粒均無(wú)明顯細(xì)胞毒性，不影響細(xì)胞的代謝活力，確保了后續(xù)試驗(yàn)的可靠性.

2.6 細(xì)胞攝取與機(jī)制

圖6(a)為T(mén)T-FITC-pDNA和TTC-FITC-pDNA與Raw 264.7細(xì)胞共培養(yǎng)4h后的細(xì)胞攝取量結(jié)果，可見(jiàn)TT-FITC-pDNA和TTC-FITC-pDNA攝取量均顯著高于裸FITC-pDNA，TTC-FITC-pDNA攝取量顯著高于TT-FITC-pDNA，這是因?yàn)閹€基基團(tuán)可與細(xì)胞膜表面富含半胱氨酸的糖蛋白交聯(lián)形成二硫鍵增加細(xì)胞攝取.

圖6(b)為細(xì)胞攝取抑制劑處理后的Raw 264.7細(xì)胞活力，可見(jiàn)50mmol/L的疊氮鈉，5μg/mL的染料木素，50μmol/L的粗糠柴毒素和2μg/mL的氯丙嗪均無(wú)細(xì)胞毒性，確保后續(xù)細(xì)胞攝取抑制試驗(yàn)結(jié)果的可靠，故選擇上述濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

圖6(c)為不同細(xì)胞攝取抑制劑預(yù)處理后Raw 264.7細(xì)胞對(duì)TT-FITC-pDNA和TTC-FITC-pDNA的細(xì)胞攝取，疊氮鈉可抑制胞內(nèi)腺苷三磷酸(ATP)的合成，經(jīng)疊氮鈉處理后，TT-FITC-pDNA和TTC-FITC-pDNA攝取量均顯著降低，表明納米粒主要經(jīng)能量依賴(lài)的內(nèi)吞方式入胞[24]；粗糠柴毒素可阻斷巨胞飲介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞[25]，粗糠柴毒素處理后細(xì)胞對(duì)TT-FITC-pDNA和TTC-FITC-pDNA攝取量均顯著下降，表明兩種納米粒均通過(guò)巨胞飲介導(dǎo)的內(nèi)吞方式入胞；染料木素可特異性抑制小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞[26]，染料木素處理后細(xì)胞對(duì)兩種納米粒的攝取量顯著下降，表明納米粒均通過(guò)小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞入胞；氯丙嗪可特異性抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞[26]，氯丙嗪處理后細(xì)胞對(duì)TTC-FITC-pDNA攝取量顯著下降，對(duì)TT-FITC-pDNA攝取量無(wú)明顯變化，表明TTC-FITC-pDNA經(jīng)過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞方式入胞，TT-FITC-pDNA則不經(jīng)此途徑入胞.

2.7 體外基因沉默

圖7為T(mén)T-shTNF-α pDNA和TTC-shTNF-α pDNA轉(zhuǎn)染Raw 264.7細(xì)胞48h后TNF-α蛋白的表達(dá)情況.pDNA劑量為6μg/mL 時(shí)，TT-shTNF-α pDNA和TTC-shTNF-α pDNA均可顯著抑制TNF-α蛋白表達(dá)，TTC-shTNF-α pDNA基因沉默效果優(yōu)于TT-shTNF-α pDNA，這是因?yàn)門(mén)TC-shTNF-α pDNA細(xì)胞攝取量高于TT-shTNF-α pDNA.

3 討 論

殼聚糖脫乙酰度決定其分子鏈上胺基(-NH2)含量，85%的脫乙酰度有利于提高殼聚糖溶解性，降低生產(chǎn)難度和促進(jìn)殼聚糖以酰胺鍵接枝多種功能配體.文獻(xiàn)[27]報(bào)道聚合物分子量過(guò)大，聚合物分子鏈過(guò)長(zhǎng)，穿透細(xì)胞膜能力減弱，不利于有效遞送藥物.且本課題組前期研究表明分子量200kDa，脫乙酰度85%的殼聚糖衍生物可高效包載并遞送基因藥物，治療肝癌、急性肝損傷、潰瘍性結(jié)腸炎等多種疾病[3,11,28].因此本研究選擇脫乙酰度85%，分子量200kDa的殼聚糖進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).Raw 264.7細(xì)胞屬于巨噬細(xì)胞，且據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道脂多糖(LPS)活化的Raw 264.7細(xì)胞可作為炎癥巨噬細(xì)胞模型，可用于研究巨噬細(xì)胞的炎癥疾病治療方法[11].急性肝損傷的發(fā)病過(guò)程與促炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)密切相關(guān)，炎癥狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞分泌大量TNF-α，抑制TNF-α的分泌可治療急性肝損傷[3].以Raw264.7作為細(xì)胞模型，可模擬和預(yù)測(cè)體內(nèi)納米粒被炎癥巨噬細(xì)胞攝取的過(guò)程以及沉默TNF-α表達(dá)的效果.本研究采用季銨基團(tuán)、牛磺酸基團(tuán)和巰基基團(tuán)修飾殼聚糖，合成?；撬嵝揎棜ぞ厶羌句@鹽(TT)和?；撬嵝揎棊€基化殼聚糖季銨鹽(TTC).為達(dá)到更加穩(wěn)定和持久的基因沉默效果[7]，本課題采用shTNF-α pDNA，特異性沉默TNF-α表達(dá).TT和TTC分別與shTNF-α pDNA按照質(zhì)量比20∶1自組裝形成納米粒(TT-shTNF-α pDNA和TTC-shTNF-α pDNA)，與TT-shTNF-α pDNA相比，TTC-shTNF-α pDNA粒徑更小，pH穩(wěn)定性更好，細(xì)胞攝取量更多，基因沉默效果更強(qiáng).

文獻(xiàn)[29]報(bào)道小腸是藥物口服吸收的主要場(chǎng)所，小腸上皮細(xì)胞在藥物吸收中起重要作用.其中回腸段絨毛豐富，消化酶含量相對(duì)較少，上皮細(xì)胞緊密連接的致密性相對(duì)較弱且含有派氏結(jié)，派氏結(jié)可吞噬腸腔內(nèi)物質(zhì)，經(jīng)免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和呈遞進(jìn)入血液循環(huán)[30-31].納米粒可能經(jīng)小腸正常上皮組織吸收或被位于派氏結(jié)袋形囊腔中的巨噬細(xì)胞吸收，進(jìn)入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)，隨巨噬細(xì)胞遞送pDNA至炎癥部位.后期可考察TTC-shTNF-α pDNA的體外細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)一步闡明納米?？诜笪改c道的吸收部位；口服遞送TTC-shTNF-α pDNA治療小鼠急性肝損傷模型，進(jìn)一步驗(yàn)證牛磺酸基團(tuán)的功效以及TTC-shTNF-α pDNA的體內(nèi)基因沉默功效.