李 萌，王 娟，魏子凱，康佳欣，張 玲，Tabys Dina，劉 寧*，張 爽*

1. 乳品科學(xué)教育部重點實驗室(東北農(nóng)業(yè)大學(xué))，黑龍江 哈爾濱 150030 2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150030

引 言

近年來，羊乳以營養(yǎng)價值高、低致敏性、易消化吸收等特點，深受廣大消費者的青睞。羊乳比牛乳中蛋白質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分的含量更高[1-2]，且現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)證實攝入羊乳可有效改善牛乳蛋白過敏癥狀[3]。因此，為了滿足不能食用牛乳制品的特殊人群營養(yǎng)需求，尤其是患有牛乳蛋白過敏癥的嬰幼兒營養(yǎng)需求，分析羊乳和牛乳之間的差異，對研制更適合嬰幼兒的配方食品具有重要的指導(dǎo)意義。

羊乳和牛乳之間的差異，主要體現(xiàn)在蛋白含量及結(jié)構(gòu)方面[4]。β-酪蛋白是羊乳酪蛋白中含量最多的一種蛋白(約占酪蛋白總量的54.8%)，可在消化過程中被降解成多種具有生物活性的肽段，這些生物活性肽在免疫、營養(yǎng)、消化代謝等方面發(fā)揮著重要的作用[5-6]。羊乳和牛乳β-酪蛋白結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的不同，是造成羊乳和牛乳在結(jié)合鈣的能力、消化吸收能力等方面存在差異的主要原因。

目前對β-酪蛋白的研究多集中于牛乳β-酪蛋白，對羊乳β-酪蛋白結(jié)構(gòu)以及羊乳和牛乳β-酪蛋白結(jié)構(gòu)差異的研究還鮮有報道。因此，本研究采用圓二色光譜和紅外光譜技術(shù)測定羊乳和牛乳β-酪蛋白的結(jié)構(gòu)，利用分光光度法對二者的疏基含量及溶解性進(jìn)行了初步探究，旨在獲得羊乳β-酪蛋白結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)方面的信息，為今后研制出營養(yǎng)價值更高、更適合嬰幼兒的配方食品提供有利的理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料

生鮮山羊乳，采自齊齊哈爾飛鶴牧場；牛乳β-酪蛋白、尿素、Tris購于美國sigma公司；SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其余試劑均購于天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

蛋白質(zhì)純化儀AKTA Exploer(美國GE公司)；LC-MS/MS Thermo Q-Exactive質(zhì)譜儀(美國Thermo Scientific公司)；J-815型圓二色光譜儀(日本Jasco公司)；Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀(美國Thermo Nicolet公司)；DU800紫外可見分光光度計(美國Beckman公司)。

1.3 方法

1.3.1 羊乳β-酪蛋白的制備

(1)羊乳β-酪蛋白的色譜分離

將羊乳樣品離心以除去脂肪，調(diào)節(jié)pH值至4.6，收集酪蛋白沉淀并凍干。取凍干后的酪蛋白沉淀600 mg，溶于30 mL的平衡緩沖液(20 mmol·L-1Tris，3 mol·L-1urea，1%β-巰基乙醇，pH 7.0)，渦旋使其充分溶解后，離心棄去沉淀。將上清液從進(jìn)樣環(huán)打入AKTA Exploer蛋白質(zhì)純化儀中，用0.3 mol·L-1NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫并用自動集樣器收集各個洗脫峰。

(2)羊乳β-酪蛋白SDS-PAGE電泳和純度鑒定

將各個洗脫峰的蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色液染色1 h后進(jìn)行脫色，直至條帶清晰可見。用凝膠成像儀掃描獲得電泳圖片并進(jìn)行分析，根據(jù)Marker的位置和各個樣品的相對分子質(zhì)量確定含有β-酪蛋白的洗脫峰。

(3)羊乳β-酪蛋白的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)鑒定

取10 μL消化后的蛋白溶液樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測。LC-MS/MS參數(shù)：液相色譜：色譜柱C18，Eprogen(5 μm，150 ?)；梯度洗脫0～60 min，100%A；0～60 min，5%～80%B；流動相A：0.1%甲酸的水溶液，B：0.1%甲酸的乙腈溶液；流速400 nL·min-1；柱溫室溫；檢測波長214 nm。質(zhì)譜：正離子模式；掃描范圍50～2 200m/z；毛細(xì)管電壓1 500 V；干燥氣體溫度150 ℃。應(yīng)用Proteome Discoverer 1.4軟件整合的MASCOT對UniProtKB Bovidae蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索、分析和鑒定。

1.3.2 圓二色光譜、紅外光譜分析羊乳和牛乳β-酪蛋白二級結(jié)構(gòu)的差異

(1)圓二色光譜測定羊乳和牛乳β-酪蛋白的二級結(jié)構(gòu)

取羊乳和牛乳β-酪蛋白樣品各1 mg，分別溶于2 mL磷酸鹽緩沖液(0.01 mol·L-1，pH 7.0)，加入石英比色皿置于圓二色光譜儀上進(jìn)行檢測，具體參數(shù)為：樣品池光徑1 mm，步長0.1 nm，掃描范圍190～250 nm，掃描速度120 nm·min-1。用Origin Pro 8.5軟件作圖，并用CD Pro軟件擬合蛋白質(zhì)中二級結(jié)構(gòu)的組成與含量。

(2)紅外光譜測定羊乳和牛乳β-酪蛋白的二級結(jié)構(gòu)

取羊乳和牛乳β-酪蛋白樣品各1 mg，分別與10 mg溴化鉀均勻混合壓片后，置于紅外光譜儀中，在400～4 000 cm-1頻率范圍內(nèi)掃描32次。用Origin Pro 8.5軟件采集譜圖并對特征峰進(jìn)行標(biāo)注，用Peakfit Version 4.12軟件在相應(yīng)譜帶范圍內(nèi)進(jìn)行基線校正，并經(jīng)Savitsk-Golay函數(shù)平滑、去卷積處理，對二階導(dǎo)數(shù)曲線進(jìn)行多次擬合[10]，使擬合殘差達(dá)到理想水平。根據(jù)各二級結(jié)構(gòu)單元對應(yīng)峰的面積，計算蛋白質(zhì)中各二級結(jié)構(gòu)的含量。

1.3.3 羊乳和牛乳β-酪蛋白功能性質(zhì)的測定

(1)羊乳和牛乳β-酪蛋白總疏基和表面疏基含量的測定

使用Ellman’s法測定兩種蛋白的巰基含量[11]。表面巰基含量的測定：取適量兩種蛋白樣品用pH 8.0的Tris-Gly緩沖溶液(含4 mmol·L-1的EDTA)稀釋至100 mL，取5 mL稀釋液，加入0.1 mL的Ellman’s試劑。室溫避光震蕩30 min后，于10 000 r·min-1離心10 min，取上清液并用紫外分光光度計測定其在412 nm處的吸光值，以僅加Ellman’s試劑為空白對照。總巰基含量的測定與測定表面巰基含量方法一致，所使用的緩沖溶液為含4 mmol·L-1EDTA，8 mol·L-1尿素，pH為8.0的Tris-Gly緩沖溶液。

巰基(SH)含量的計算公式如下

式中：A412為樣品在412 nm處的吸光值；D為樣品稀釋倍數(shù)；c為干物質(zhì)濃度，mg·mL-1。

(2)羊乳和牛乳β-酪蛋白溶解性的測定

參照Singh[12]等的方法。在室溫條件下，分別取兩種蛋白溶液樣品(10 mg·mL-1)用磁力攪拌器攪拌1 h，然后調(diào)整pH值并繼續(xù)攪拌30 min，12 000 r·min-1離心20 min。用BCA試劑盒法測定上清液的蛋白濃度，此濃度與總蛋白濃度之比即為該蛋白質(zhì)的溶解度。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與討論

2.1 羊乳β-酪蛋白的制備

2.1.1 羊乳β-酪蛋白的色譜分離純化

對酪蛋白樣品進(jìn)行梯度洗脫的結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，本次純化過程中出現(xiàn)一個較大的穿過峰和三個蛋白洗脫峰，將這三個蛋白洗脫峰分別標(biāo)記為峰Ⅰ、峰Ⅱ和峰Ⅲ。由于酪蛋白樣品含有的未與柱子結(jié)合的蛋白和其他雜質(zhì)的洗脫液會先從柱子流出，因此層析圖中首先出現(xiàn)了一個較大的穿過峰。另外，圖1中三個蛋白洗脫峰沒有發(fā)生重合，說明酪蛋白分離效果較好，且與峰Ⅰ和峰Ⅲ相比，峰Ⅱ的峰型較大，說明其所代表的蛋白質(zhì)所占比例較高。

圖1 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析法純化羊乳β-酪蛋白結(jié)果

Fig.1Purificationofgoatmilkβ-caseinbyDEAE-SepharoseFastFlowanionexchangechromatography

2.1.2 羊乳β-酪蛋白SDS-PAGE電泳和純度鑒定

圖2為各峰洗脫液經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定后的結(jié)果。從圖2可以看出，峰Ⅰ和峰Ⅱ均為單一的蛋白質(zhì)，但峰Ⅱ相對百分含量較大，其純度高達(dá)90%。根據(jù)SDS-PAGE圖譜及β-酪蛋白的相對分子質(zhì)量，可初步判定峰Ⅱ為β-酪蛋白的目標(biāo)峰。

圖2 羊乳β-酪蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果

2.1.3 羊乳β-酪蛋白的LC-MS/MS鑒定

對峰Ⅱ蛋白組分進(jìn)行LC-MS/MS鑒定，結(jié)果顯示在UniProtKB Bovidae數(shù)據(jù)庫中編號為Q95L76的蛋白得分最高，為15 678分，且該蛋白檢測出可信度較高(Score>11)的肽段共11條，這11條肽段的信息匹配表如表1所示。圖3標(biāo)紅部分為該蛋白肽段及碎片離子質(zhì)量數(shù)實測值與理論值相符的肽段序列，序列覆蓋率為53%。因此，根據(jù)SDS-PAGE電泳及質(zhì)譜鑒定結(jié)果，可以確認(rèn)本研究純化所得的峰Ⅱ蛋白組分為羊乳β-酪蛋白。

表1 LC-MS/MS測定羊乳β-酪蛋白的肽段信息匹配表Table 1 Peptides matching table of goat milk β-casein by LC-MS/MS

2.2 圓二色光譜、紅外光譜分析羊乳和牛乳β-酪蛋白二級結(jié)構(gòu)的差異

2.2.1 圓二色光譜測定羊乳和牛乳β-酪蛋白的二級結(jié)構(gòu)

圖4為羊乳和牛乳β-酪蛋白的圓二色光譜譜圖。根據(jù)圖4和相關(guān)參考文獻(xiàn)對蛋白質(zhì)圓二色光譜的峰譜指認(rèn)信息[13]，羊乳和牛乳β-酪蛋白在190 nm左右均出現(xiàn)一個較為明顯的正峰譜帶，此處特征峰為α-螺旋在192 nm與β-折疊在185～200 nm處特征峰的重合峰，說明這兩種蛋白結(jié)構(gòu)中均含有α-螺旋和β-折疊。另外，在200～210 nm之間出現(xiàn)一個明顯的負(fù)峰譜帶，此處特征峰為α-螺旋在208 nm與無規(guī)卷曲在200 nm處特征峰的重合峰，而當(dāng)波長超過206 nm后，兩種蛋白樣品的峰譜譜帶均開始向正峰發(fā)展，這是β-轉(zhuǎn)角在206 nm特征峰的譜帶所造成的結(jié)果，說明這兩種蛋白結(jié)構(gòu)中還存在著大量的β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲。使用CD pro軟件分析兩種蛋白各二級結(jié)構(gòu)的相對百分含量，結(jié)果如表2所示。

圖3 羊乳β-酪蛋白的質(zhì)譜序列覆蓋情況

圖4 羊乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白圓二色光譜圖

表2圓二色光譜測定羊乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白中各二級結(jié)構(gòu)的百分含量

Table2Percentageofsecondarystructureingoatmilkβ-caseinandbovinemilkβ-caseinbyCirculardichroism

羊乳β-酪蛋白/%牛乳β-酪蛋白/%α-螺旋2.7±0.21a4.3±0.13bβ-折疊15.3±0.08a19.5±0.12bβ-轉(zhuǎn)角31.8±0.11a32.4±0.09a無規(guī)卷曲50.2±0.16a43.8±0.14b

注：同列肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(p<0.05)

Note: Difference letters above same column indicate significant difference (p<0.05)

根據(jù)表2可以看出，羊乳β-酪蛋白內(nèi)部α-螺旋、β-折疊含量顯著低于牛乳β-酪蛋白(p<0.05)，無規(guī)卷曲含量則顯著高于牛乳β-酪蛋白(p<0.05)。據(jù)報道，蛋白質(zhì)分子中α-螺旋和β-折疊能夠形成緊密的無空腔結(jié)構(gòu)，而與α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)相比，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的構(gòu)象穩(wěn)定性和緊密程度則相對較差[14]，因此，羊乳β-酪蛋白中較低含量的α-螺旋和β-折疊以及較高含量的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)使其分子的無序性更高，結(jié)構(gòu)更加疏松開放。

2.2.2 紅外光譜測定羊乳和牛乳β-酪蛋白的二級結(jié)構(gòu)

圖5 羊乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白紅外光譜圖

Fig.5Fouriertransformationinfraredspectroscopyspectraofgoatmilkβ-caseinandbovinemilkβ-casein

表3紅外光譜測定羊乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白中各二級結(jié)構(gòu)的百分含量

Table3Percentageofsecondarystructureingoatmilkβ-caseinandbovinemilkβ-caseinbyFouriertransformationinfraredspectroscopy

羊乳β-酪蛋白/%牛乳β-酪蛋白/%α-螺旋12.1±0.14a31.2±0.22bβ-折疊18.9±0.18a28.3±0.13bβ-轉(zhuǎn)角7.8±0.09a8.6±0.11a無規(guī)卷曲52.7±0.16a34.6±0.15b

注：同列肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(p<0.05)

Note: Difference letters above same column indicate significant difference (p<0.05)

圖6 羊乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白酰胺Ⅰ帶高斯曲線擬合圖(a)：羊乳β-酪蛋白酰胺Ⅰ帶高斯曲線擬合圖；(b): 牛乳β-酪蛋白酰胺Ⅰ帶高斯曲線擬合圖

Fig.6GaussiancurvefittingmapofamideⅠbandsofgoatmilkβ-caseinandbovinemilkβ-casein

(a): Gaussian curve fitting map of goat milk β-casein amide Ⅰ band; (b): Gaussian curve fitting map of bovine milk β-casein amide Ⅰ band

2.3 羊乳和牛乳β-酪蛋白功能性質(zhì)的測定

2.3.1 羊乳和牛乳β-酪蛋白總疏基和表面疏基含量的測定

表4為羊乳和牛乳β-酪蛋白總巰基和表面巰基含量。從表4可以看出，兩種蛋白表面巰基含量相似，但羊乳β-酪蛋白總巰基含量顯著低于牛乳β-酪蛋白(p<0.05)，這說明羊乳β-酪蛋白的巰基主要以暴露巰基的形式分布于蛋白質(zhì)分子的表面，其內(nèi)部巰基含量更低。巰基是蛋白質(zhì)中重要的功能基團(tuán)之一，具有較高的生物活性，其可與二硫鍵在巰基/二硫鍵氧化還原酶的催化下進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化，羊乳β-酪蛋白膠束內(nèi)部更低的巰基含量使其內(nèi)部二硫鍵含量更少。

表4 羊乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白總巰基和表面巰基含量Table 4 Total and surface sulfhydryl content of goat milk β-casein and bovine milk β-casein

注：同列肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(p<0.05)

Note: Difference letters in the same column indicate significant difference (p<0.05)

2.3.2 羊乳和牛乳β-酪蛋白溶解性的測定

溶解性可以反映出蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變性和聚集的程度，是蛋白質(zhì)最重要的物理、化學(xué)和功能性質(zhì)之一。羊乳和牛乳β-酪蛋白在不同pH值條件下的溶解性曲線如圖7所示。從圖7可以看出，兩種蛋白的溶解性具有明顯的pH依賴性，且二者等電點(pH為4～5)接近，溶解性曲線均呈現(xiàn)出在接近等電點時溶解性降低，遠(yuǎn)離等電點時溶解性升高的趨勢。

當(dāng)兩種蛋白溶液的pH值在等電點附近時，蛋白分子表面所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，導(dǎo)致蛋白分子與分子間的相互作用力增強，此時羊乳β-酪蛋白比牛乳β-酪蛋白的溶解性低，說明羊乳β-酪蛋白分子表面包含更多的疏水基團(tuán)；當(dāng)兩種蛋白溶液的pH值遠(yuǎn)離等電點時(pH 2～4和pH 6～10)，蛋白分子則處于酸性或堿性的環(huán)境中，此時蛋白質(zhì)分子帶有靜電荷，由于靜電排斥和離子水化作用，蛋白質(zhì)分子之間不易聚集，因此溶解性較高，同時，溶液中離子強度的增大使蛋白表面的電荷發(fā)生堆積，促進(jìn)蛋白結(jié)構(gòu)的展開，且結(jié)合表4可知，羊乳β-酪蛋白包裹在膠束內(nèi)部的巰基含量低于牛乳β-酪蛋白，因此這很好的解釋了羊乳β-酪蛋白在偏離等電點時溶解性更高的原因。

圖7 羊乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白的溶解性-pH曲線

3 結(jié) 論

圓二色光譜和紅外光譜檢測結(jié)果表明：與牛乳β-酪蛋白相比，羊乳β-酪蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的含量更少，無規(guī)卷曲含量更高，羊乳β-酪蛋白分子結(jié)構(gòu)更傾向于無序性，蛋白分子的柔韌性更好。

羊乳β-酪蛋白與牛乳β-酪蛋白表面巰基含量相似，但前者總巰基含量顯著低于后者，羊乳β-酪蛋白內(nèi)部巰基含量更低。

羊乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白在接近等電點(pH為4～5)時，溶解性降低，遠(yuǎn)離等電點溶解性升高。在pH 2～4和pH 6～10時，羊乳β-酪蛋白溶解性高于牛乳β-酪蛋白，而在等電點時前者溶解性低于后者，羊乳β-酪蛋白分子與分子間相互作用力更強，分子表面包含了更多的疏水基團(tuán)。