吳學(xué)進(jìn),王明月,李春麗,張振山,李萍萍,龐朝海
(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 分析測(cè)試中心 海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 ???571101)
砂仁是姜科豆蔻屬多年生草本植物,系四大南藥之一,為中國(guó)傳統(tǒng)大宗常用藥材,具有治療脾胃及妊娠安胎功效。隨著其在消化系統(tǒng)、鎮(zhèn)痛抗炎及代謝疾病等方面的療效越來越受到人們的關(guān)注,砂仁的人工種植規(guī)模也逐步擴(kuò)大[1]。植物源中藥材農(nóng)藥殘留可能來自人工種植過程病蟲害防治所用農(nóng)藥殘留,或由種植環(huán)境水土中殘留農(nóng)藥污染等。砂仁人工種植產(chǎn)品也面臨同樣的農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題,因此建立砂仁中農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法對(duì)于保障砂仁及其中藥制品的產(chǎn)品質(zhì)量安全,降低人民群眾的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)具有現(xiàn)實(shí)意義。
目前,多組分農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法(GC)[2]、液相色譜法(LC)[3]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[4]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[5]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[6]等。其中GC-MS/MS具有靈敏度高、選擇性好、高通量、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),且采用的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)不僅解決了氣相色譜法和液相色譜法在檢測(cè)器靈敏度及確證檢測(cè)技術(shù)上存在的不足,還可有效消除GC-MS選擇離子掃描(SIM)中存在的離子信息少、定性不準(zhǔn)的問題,且儀器價(jià)格也較LC-MS/MS低,因此已成為復(fù)雜基質(zhì)樣品中多農(nóng)藥殘留篩查分析的理想技術(shù)。
有機(jī)磷類農(nóng)藥因具有廣譜、高效、降解快等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于蔬菜、水果病蟲害防治。但此類農(nóng)藥殘留可通過食物鏈在人體內(nèi)積累,具有神經(jīng)毒性,可造成神經(jīng)系統(tǒng)紊亂,還會(huì)引起染色體畸變,導(dǎo)致癌變或畸形[7]。QuEChERS方法是近年發(fā)展迅速的一種農(nóng)藥多組分殘留檢測(cè)前處理方法,該法因快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)、高效、安全等優(yōu)點(diǎn)而廣泛用于農(nóng)藥多殘留快速檢測(cè)。QuEChERS結(jié)合GC、LC、GC-MS、GC-MS/MS、LC-MS/MS對(duì)水果蔬菜中的有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留檢測(cè)已有大量報(bào)道,但應(yīng)用于中藥材中有機(jī)磷農(nóng)殘檢測(cè)的報(bào)道較少[8-9]。
本研究以1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸乙腈提取,優(yōu)化了QuEChERS凈化體系,建立了QuEChERS/氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)同時(shí)檢測(cè)砂仁中28種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的分析方法。方法操作簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高、重復(fù)性好,適用于砂仁中的多種有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留的快速、高效、準(zhǔn)確定性與定量分析。
Agilent 7890A氣相色譜-7000A串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司);陶瓷均質(zhì)子(美國(guó)Agilent公司,貨號(hào):5982-9313);MS 3 basic型振蕩器(德國(guó)IKA公司);Mettler Toledo電子分析天平(瑞典梅特勒-托利多公司);TTL-DCII型氮吹儀(北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司);LXJ-Ⅱ型B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);XW-80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器有限公司)。
乙腈、乙酸、乙酸乙酯(色譜純,美國(guó)Fisher公司);乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和十八烷基硅膠鍵合相(C18)購(gòu)于美國(guó)Agilent公司;石墨化炭黑(GCB)、氯化鈉、無水硫酸鎂(分析純,廣州化學(xué)試劑有限公司);28種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自天津農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L)。
實(shí)驗(yàn)所用12個(gè)砂仁樣品購(gòu)自海南、廣東、廣西、云南的中藥材市場(chǎng),經(jīng)廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院王定勇教授鑒定為姜科,豆蔻屬多年生草本植物砂仁的干燥果實(shí)。
混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:將28種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品隨機(jī)分成3組,然后精確吸取1.0 mL于10.0 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容,配成3組100 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。于-18 ℃冰箱中避光密封儲(chǔ)存?zhèn)溆?有效期6個(gè)月)。
混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備中間液:準(zhǔn)確吸取上述3組混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1.0 mL于10.0 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容,配成10.0 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備中間液。于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存(有效期1個(gè)月)。
混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:準(zhǔn)確吸取一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備中間液于10.0 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容,分別配成0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存(有效期1周)。
基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:準(zhǔn)確吸取2.0 mL凈化后的基質(zhì)空白溶液于15 mL塑料具塞離心管中,在40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?,加?.0 mL相應(yīng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液復(fù)溶,過微孔濾膜(有機(jī)相,13 mm × 0.22 μm),配成0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。
制備:12個(gè)砂仁樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎,過50目篩,密封袋封裝,置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>
提?。悍Q取5.00 g(精確至0.01 g)樣品置于50 mL具塞塑料離心管中(內(nèi)有一個(gè)陶瓷均質(zhì)子),加入10.0 mL超純水,振蕩渦旋1.0 min后靜置20 min,讓樣品充分潤(rùn)濕;再加入10.0 mL含1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸乙腈溶液,以1 800 r/min振蕩渦旋勻質(zhì)2 min;加入4.0 g NaCl渦旋1 min,然后以4 000 r/min離心5 min。
凈化:移取6.0 mL提取上層有機(jī)液于15 mL具塞塑料離心管中(內(nèi)含900 mg MgSO4+150 mg PSA+100 mg C18+25 mg GCB)中,渦旋混勻1 min,以5 000 r/min離心5 min;準(zhǔn)確吸取所得凈化上清液2.0 mL轉(zhuǎn)移至15 mL具塞塑料離心管中,于40 ℃水浴氮?dú)獯蹈珊蠹尤?.0 mL乙酸乙酯復(fù)溶,過有機(jī)相微孔濾膜(13 mm×0.22 μm)后上機(jī)檢測(cè)。
色譜條件:采用HP-5 MS型色譜(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美國(guó)Agilent公司);程序升溫:初始柱溫70 ℃,保持1 min,以25 ℃/min升至150 ℃,保持3 min;再以15 ℃/min升至200 ℃,保持3 min;最后以20 ℃/min升至270 ℃,保持3 min;總運(yùn)行時(shí)間20 min。載氣為高純He(純度≥99.999%),流速1.0 mL/min;猝滅氣為氦氣,流速為2.25 mL/min;進(jìn)樣體積1.0 μL;進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣。
質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源,電離能量70 eV;離子源溫度250 ℃;傳輸線溫度280 ℃;四極桿溫度150 ℃;溶劑延遲3.6 min;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。28種有機(jī)磷農(nóng)藥的保留時(shí)間、離子對(duì)、碰撞能量等相關(guān)參數(shù)見表1。
表1 28 種有機(jī)磷農(nóng)藥的GC-MS/MS分析參數(shù)
以砂仁為基質(zhì),將1.0 μg/kg的28種有機(jī)磷農(nóng)藥基質(zhì)工作混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在質(zhì)荷比(m/z)40~500范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描模式(Full scan)掃描。通過NIST譜庫(kù)檢索確定每種農(nóng)藥的保留時(shí)間,再根據(jù)每種農(nóng)藥化合物的一級(jí)譜圖選取相對(duì)強(qiáng)度高、特征性強(qiáng)的離子作為母離子;然后對(duì)母離子采用產(chǎn)物離子掃描模式(Product scan)獲得二次碎裂產(chǎn)生的子離子。通過優(yōu)化碰撞能量對(duì)母離子進(jìn)行碰撞解離,選擇豐度值大、特征性強(qiáng)、靈敏度高的兩對(duì)離子對(duì)分別作為該化合物的定量離子對(duì)和定性離子對(duì),在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)下測(cè)定,圖1為砂仁空白基質(zhì)中加標(biāo)量為1.0 mg/kg的28種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的總離子流(TIC)色譜圖。由圖可知,20 min 內(nèi)即可完成對(duì)上述28種有機(jī)磷農(nóng)藥待測(cè)物的分析。
圖1 28種有機(jī)磷農(nóng)藥砂仁基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(1.0 mg/kg)的總離子流色譜圖
本課題組前期研究比較了丙酮、乙腈和乙酸乙酯提取楊桃基質(zhì)中氧樂果等37種農(nóng)藥的回收率[10]。結(jié)果顯示,以丙酮為提取溶劑時(shí),氧樂果等37種農(nóng)藥的回收率較高,但提取出較多的色素等干擾成分,增加了基質(zhì)效應(yīng)和儀器維護(hù)成本;以乙酸乙酯為提取劑時(shí),37種農(nóng)藥的回收率為60%~120%;以乙腈為提取溶劑時(shí),農(nóng)藥的回收率為70%~120%且提取出的色素等干擾成分比丙酮少。此外,還發(fā)現(xiàn)在乙腈中加入1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸,可提高對(duì)堿性敏感農(nóng)藥(如乙酰甲胺磷)的回收率。故本研究也選用1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸乙腈為提取溶劑,具體操作為:在樣品提取前加入10 mL超純水,待樣品成分潤(rùn)濕,振蕩渦旋1.0 min后靜置20 min,以提高樣品的分散程度;再加入10.0 mL含1%乙酸的乙腈溶液,同時(shí)加入4.0 g氯化鈉進(jìn)行鹽析,以提高萃取效率。
砂仁是姜科植物果實(shí),除富含乙酰龍腦酯、樟腦等揮發(fā)性成分外,也含有色素、脂肪酸、多糖、鞣質(zhì)等成分,這些成分易在進(jìn)樣口、襯管等進(jìn)樣系統(tǒng)的前端部位富集,不僅會(huì)降低檢測(cè)靈敏度,還會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng);既增加了儀器維護(hù)的頻率和成本,又影響目標(biāo)農(nóng)藥檢測(cè)準(zhǔn)確度,因此砂仁提取液在上樣檢測(cè)前需凈化處理。
農(nóng)藥殘留檢測(cè)中常用的凈化劑有PSA、C18、GCB,其中PSA通過極性作用吸附樣品中有機(jī)酸、脂肪酸和糖等干擾物;在硅膠上鍵合了十八烷基官能團(tuán)的C18,通過非極性相互作用,對(duì)極性較弱的脂肪酸、揮發(fā)油、色素等大分子基質(zhì)干擾物具有較好的吸附效果;GCB具有片層結(jié)構(gòu),除對(duì)色素、甾醇、芳香烴的吸附能力較好[11]外,還對(duì)平面結(jié)構(gòu)及對(duì)稱性結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥化合物也具有較強(qiáng)的吸附作用,但過量的GCB會(huì)導(dǎo)致部分農(nóng)藥的回收率偏低[12-13]。本實(shí)驗(yàn)選擇無水硫酸鎂用作除水劑,PSA吸附砂仁中的有機(jī)酸、鞣質(zhì)等極性成分,C18去除砂仁中脂肪酸、色素以及一些非極性成分,GCB去除砂仁中的色素和極性干擾成分,在前期研究[14]基礎(chǔ)上,確定MgSO4、PSA和C18的用量分別為900、150、100 mg,再通過調(diào)整GCB用量(0、25、50、100 mg)來考察凈化效果。結(jié)果顯示,大部分有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率為80.0~110%,但隨著凈化體系中GCB用量由25 mg增至100 mg,三唑磷、喹硫磷、亞胺硫磷、伏殺硫磷和蠅毒磷的回收率均呈遞減趨勢(shì),其中三唑磷、喹硫膦的回收率分別由94.6%和95.9%降至84.5%和81.5%,亞胺硫磷由87.4%降至69.6%;而對(duì)于具有平面結(jié)構(gòu)的伏殺硫磷和蠅毒膦,兩者的回收率降低更為明顯,分別由89.3%和90.9%降至54.2%和33.1%;由此可知,GCB對(duì)三唑磷、喹硫磷有弱吸附作用,對(duì)亞胺硫磷有較強(qiáng)吸附作用,對(duì)伏殺硫磷和蠅毒磷具有強(qiáng)吸附作用。雖然GCB對(duì)部分有機(jī)磷農(nóng)藥有吸附作用,但不加GCB時(shí),凈化液中砂仁香味稍濃,表明芳香物含量更高,綜合考慮回收率及GCB對(duì)芳香物的吸附作用,最終確定凈化方案為MgSO4900 mg+PSA 150 mg+C18100 mg+GCB 25 mg。
基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect,ME,%)是指樣品分析液中除目標(biāo)分析物以外的其他組分,在實(shí)際檢測(cè)時(shí)影響分析液的響應(yīng)值,從而影響目標(biāo)檢測(cè)物定量分析的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性[15]的現(xiàn)象?;|(zhì)效應(yīng)可通過ME(%)=100% ×(B-A)/A來考察,其中A為純?nèi)軇┲写郎y(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品的平均響應(yīng)值,B為空白基質(zhì)中相同濃度的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品溶液的平均響應(yīng)值。ME>0為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng);ME<0為基質(zhì)抑制效應(yīng)。當(dāng)|ME|≤20%,認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)弱,可以忽略;若其值在20%~50%之間,則表明有中等基質(zhì)效應(yīng);若|ME|>50%,則表明基質(zhì)效應(yīng)很強(qiáng)[16-17]?;|(zhì)效應(yīng)是殘留檢測(cè)中普遍存在的現(xiàn)象,GC-MS/MS檢測(cè)方法,更多體現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[18],這可能是由于在GC-MS/MS系統(tǒng)中,基質(zhì)的存在減少了色譜系統(tǒng)活性位點(diǎn)與待測(cè)目標(biāo)化合物作用的機(jī)會(huì),讓更多的待測(cè)物進(jìn)入色譜柱,使其檢測(cè)信號(hào)增強(qiáng)[19]所致。本研究比較了同為0.5 μg/mL的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液與砂仁基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值(表2)。結(jié)果表明:28種有機(jī)磷農(nóng)藥砂仁基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值明顯高于純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液,均顯示為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),其中治螟磷等18種有機(jī)磷農(nóng)藥在砂仁基質(zhì)中表現(xiàn)為中等基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),而甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧樂果、久效磷、樂果、甲基對(duì)硫磷、殺螟硫磷、硫環(huán)磷、亞胺硫磷、蠅毒磷10種有機(jī)磷農(nóng)藥在砂仁基質(zhì)中表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),尤其是乙酰甲胺磷和氧樂果的ME值分別高達(dá)284%和116%。為提高分析準(zhǔn)確度,實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液來消除和減弱基質(zhì)效應(yīng)的影響。
2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限配制質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,在優(yōu)化條件下上機(jī)檢測(cè),以待測(cè)化合物定量離子對(duì)的峰面積(y)為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度(x,mg/L)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,28種有機(jī)磷農(nóng)藥在0.05~1.00 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r2≥0.99)。分別以3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10)計(jì)算方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ),結(jié)果見表2。由表2可知,28種農(nóng)藥的LOD為0.005~0.010 mg/kg,LOQ為0.017~0.033 mg/kg。
2.5.2 精密度與回收率取5.00 g空白砂仁樣品,分別加入一定量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行0.2、0.40、1.0 mg/kg 3個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次,計(jì)算28種有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果如表2所示,28種農(nóng)藥的平均回收率為82.1%~104%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不大于15%。
表2 28 種有機(jī)磷農(nóng)藥在砂仁中的基質(zhì)效應(yīng)、平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限和定量下限
(續(xù)表2)
PesticideMatrixeffects/%Spikes level(mg/kg)Average recovery/%RSD/%Regression equationr2LOD(mg/kg)LOQ(mg/kg)Parathion37.80.2,0.4,1.0102,100,98.44.6,7.7,11y=8.43×104x-3.46×1030.996 30.0100.033Isocarbophos49.00.2,0.4,1.0101,97.5,92.76.2,5.6,9.6y=2.26×104x-6.99×1020.997 50.0070.024Isofenphos methyl27.60.2,0.4,1.0103,97.1,99.25.7,6.4,13y=7.06×104x-1.80×1030.997 80.0100.033Terbufos sulfone29.10.2,0.4,1.0104,99.1,99.96.4,3.9,8.0y=1.66×105x-3.88×1020.998 20.0060.020Phosfolan56.70.2,0.4,1.0102,98.3,90.85.0,5.3,8.8y=4.93×104x-1.46×1030.997 90.0060.020Quinalphos27.60.2,0.4,1.0103,98.6,99.55.5,4.9,12y=1.63×105x-3.63×1030.998 10.0060.020Phenthoate29.20.2,0.4,1.0103,97.1,98.36.3,6.6,13y=9.32×104x-2.80×1030.997 10.0060.020Methidathion45.00.2,0.4,1.0104,98.1,96.66.3,3.6,11y=2.54×105x-6.21×1030.998 30.0080.027Profenophos39.40.2,0.4,1.0103,98.1,95.28.2,7.4,13y=1.92×104x-4.41×1020.998 50.0080.027Triazophos40.20.2,0.4,1.0103,99.4,93.27.1,4.7,13y=6.25×104x-1.42×1030.998 50.0060.020Phosmet59.10.2,0.4,1.0102,99.9,91.86.7,5.7,15y=2.93×105x-7.22×1030.999 00.0100.033Phosalone38.60.2,0.4,1.0104,99.6,97.17.5,5.6,14y=1.48×105x-3.38×1030.998 80.0070.024Coumaphos56.80.2,0.4,1.0104,101,93.25.7,4.8,14y=3.07×104x-5.94×1020.999 50.0050.017
應(yīng)用本方法對(duì)海南、廣東、云南、廣西采集的12批次樣品進(jìn)行檢測(cè),均未檢出28種有機(jī)磷農(nóng)藥,其原因可能為收集的樣品多來源于當(dāng)?shù)厮幉姆N植基地,散戶藥材較少,而中藥材種植基地在栽培技術(shù)及農(nóng)藥噴施管理方面也更加規(guī)范。
本文通過優(yōu)化QuEChERS前處理方法,建立了氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定砂仁中28種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的分析方法,涵蓋了《中國(guó)藥典》2015年版“0212藥材和飲片檢定通則”規(guī)定的19種有機(jī)磷農(nóng)藥中的16種,方法可在20 min內(nèi)完成檢測(cè),具有操作簡(jiǎn)單、快捷、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),適用于砂仁中28種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。該方法的建立,不僅對(duì)砂仁中農(nóng)藥殘留具有一定應(yīng)用價(jià)值,還可為姜科同屬或其他中藥材中的農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供技術(shù)參考,為保障我國(guó)中藥材的質(zhì)量安全提供技術(shù)支持。