江虹，龐向東，向杰

(長(zhǎng)江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，重慶, 408100)

食品添加劑已成為現(xiàn)代食品工業(yè)的重要組成部分，是食品工業(yè)技術(shù)進(jìn)步和科技創(chuàng)新的重要推動(dòng)力。山梨酸(sorbic acid)和苯甲酸(benzoic acid)均為食品添加劑，是目前食品業(yè)應(yīng)用最為廣泛的防腐劑。在食品生產(chǎn)、加工及儲(chǔ)藏過(guò)程中，為了防止微生物的生長(zhǎng)、繁殖，延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，常加入山梨酸或苯甲酸或二者的混合物。而其中的山梨酸是國(guó)際公認(rèn)的具有低毒及高效抗菌性能的防腐劑，其抑菌效果優(yōu)于苯甲酸，毒性只有苯甲酸的1/4，目前，山梨酸是食品業(yè)發(fā)展?jié)摿ο鄬?duì)較好的一種防腐劑。盡管如此，當(dāng)過(guò)量攝入山梨酸時(shí)也會(huì)引起某些較嚴(yán)重的副作用(如對(duì)皮膚、黏膜的刺激性和接觸性皮炎等)，給人們的健康造成一定危害，為此，世界各國(guó)對(duì)食品中山梨酸的含量均做出了嚴(yán)格限定，我國(guó)食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB2760 規(guī)定飲料中山梨酸的最大使用量為0.5 g/kg，糕點(diǎn)中山梨酸的最大使用量為1.0 g/kg。鑒于此，研究食品中山梨酸含量的檢測(cè)方法有著重要意義。近年，國(guó)內(nèi)外對(duì)山梨酸的檢測(cè)方法主要有：高效液相色譜法[1-5], 氣相色譜法[6-7]，氣-質(zhì)聯(lián)用法[8-11]、液-質(zhì)聯(lián)用法[12-17]、電化學(xué)法[18-19]和紫外-可見(jiàn)分光光度法[20-23]等。前4 種方法有高的準(zhǔn)確度，但分析成本較高，前處理工作也較繁雜；電化學(xué)法條件要求較為苛刻；紫外-可見(jiàn)分光光度法簡(jiǎn)便、快速，長(zhǎng)期以來(lái)深受分析工作者的喜愛(ài)，但他的靈敏度通常不高，選擇性欠佳，尤其是用于食品分析時(shí)，更需考慮選擇性這一重要條件。在食品生產(chǎn)中，為了延長(zhǎng)保質(zhì)期，可能不止添加一種防腐劑，苯甲酸和山梨酸是最常用的2種防腐劑，可能共存于某食品中(苯甲酸可能干擾山梨酸的測(cè)定)，這樣一來(lái)，要想單獨(dú)測(cè)定某一物質(zhì)，就得采用分離、掩蔽等其他措施，使操作復(fù)雜化。本工作通過(guò)試驗(yàn)找到了一種不需分離苯甲酸即可直接測(cè)定山梨酸的方法，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本方法以三苯甲烷染料堿性紫作探針，在紫外光區(qū)及一定酸性條件下，采用單波長(zhǎng)、雙波長(zhǎng)或三波長(zhǎng)紫外吸收光譜法來(lái)研究食品中山梨酸的檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)表明，在某一酸度和某一波長(zhǎng)下，共存的苯甲酸不會(huì)干擾山梨酸的測(cè)定，從而實(shí)現(xiàn)不用分離苯甲酸就可直接測(cè)定山梨酸的目的。本方法有較高的靈敏度，是文獻(xiàn)[23] 的1.7～7.6 倍，且簡(jiǎn)便、快速，適于飲料及糕點(diǎn)中山梨酸的定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

堿性紫(basic violet，BSV,99%)，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)：99.9%，上海吉至生化科技有限公司；HCl(AR級(jí))，重慶川東(化工)集團(tuán)有限公司；山梨酸(SBA,99.8%)，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；苯甲酸(BZA,≥99%)，成都化夏化學(xué)試劑有限公司；水,超純水;糕點(diǎn)(蛋糕1#、2#)，飲料(葡萄汁3#、尖叫4#、可口可樂(lè)5#、營(yíng)養(yǎng)快線6#)，市售。

堿性紫溶液：1.00×10-3mol/L 水溶液；山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取適量山梨酸(精確至±0.000 1 g)于小燒杯中，加少許無(wú)水乙醇，攪拌，使其溶解，再用水定容，貯備液為1.00×10-3mol/L，操作液為1.00×10-4mol/L。苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取適量苯甲酸(精確至±0.000 1 g)于小燒杯中，加少許無(wú)水乙醇，待其溶解后，用水定容，配成貯備液為1.00×10-3mol/L，操作液為1.00×10-4mol/L；三羥甲基氨基甲烷溶液：0.20 mol/L 水溶液；HCl溶液：0.10 mol/L 水溶液；Tris-HCl 溶液：pH 3.0～9.2(用pH 計(jì)測(cè)定HCl 和Tris 的混合液)。

1.2 儀器與設(shè)備

EL104型電子天平，上海精密儀器儀表有限公司；pHS-3C 精密酸度計(jì)，上海虹益儀器儀表有限公司；KQ-200VDE 超聲波清洗機(jī),昆山市超聲儀器有限公司；TD5A-WS型離心機(jī),湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；U-3010型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),日本日立公司。

1.3 樣品處理

1.3.1 糕點(diǎn)

準(zhǔn)確稱取粉碎、混勻后的1# 和2# 樣品各25～30 g(精確至±0.000 1 g)，加適量水，攪拌，40 ℃ 水浴超聲提取20～30 min，于4 000 r/min 離心分離5～10 min，清液用水定容至100 mL，搖勻，待用。

1.3.2 非乳飲料

準(zhǔn)確移取3#～5# 飲料樣品各10 mL，于40 ℃水浴超聲20～30 min，取出冷至室溫后用水定容至100 mL，搖勻，待用。

1.3.3 乳飲料

準(zhǔn)確移取6# 樣品10.00 mL于小燒杯中，加20 mL 無(wú)水乙醇(沉淀蛋白質(zhì))，攪拌5 min，超聲提取20～30 min，4 500 r/min 離心分離5～10 min，清液移入100 mL 容量瓶中，用水定容，待用。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

于10 mL 比色管中，準(zhǔn)確依次加入一定量的山梨酸標(biāo)準(zhǔn)操作液、1.00 mL pH 3.25 Tris-HCl 溶液及1.50 mL 堿性紫溶液，用水稀至刻度，搖勻，15 min 后，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上，掃描吸收光譜(以試劑空白作參比)，分別在紫外區(qū)測(cè)定254 nm、305 nm 及223 nm 處的吸光度A。

2 結(jié)果與分析

2.1 SBA-BSV 與BZA-BSV 的吸收光譜特征比較

圖1是山梨酸-堿性紫體系與可能共存的苯甲酸-堿性紫體系的紫外吸收光譜圖，表1 是兩體系的吸收光譜特征比較。由圖1可知，堿性紫溶液在紫外光區(qū)吸收信號(hào)較弱(在可見(jiàn)光區(qū)有很強(qiáng)的吸收信號(hào))，他們的吸收峰分別位于594 nm、306 nm 及223 nm，如曲線1所示。山梨酸溶液自身和苯甲酸溶液自身在可見(jiàn)光區(qū)幾乎無(wú)吸收，在紫外光區(qū)有較強(qiáng)吸收，最大吸收峰分別位于的256 nm 和226 nm，如曲線2和曲線3 所示。當(dāng)在山梨酸的酸性溶液(pH 3.25 Tris-HCl 溶液)中加入一定濃度的堿性紫溶液后，在可見(jiàn)光區(qū)出現(xiàn)2個(gè)吸收強(qiáng)度不大的吸收峰(峰位見(jiàn)表1)，在紫外光區(qū)則出現(xiàn)3個(gè)具有較強(qiáng)吸光度的吸收峰，分別位于254 nm(紫移340 nm)、305 nm(紫移289 nm)和223 nm(紫移371 nm)，曲線5～10所示，且在這3個(gè)峰處，隨著山梨酸濃度的增大，吸光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，山梨酸在一定濃度范圍內(nèi)，其濃度與體系的吸光強(qiáng)度A呈線性關(guān)系，并服從朗伯-比爾定律。而可能與山梨酸-堿性紫體系共存的苯甲酸-堿性紫體系在同條件下的紫外光區(qū)的吸收光譜見(jiàn)曲線4，可知，在山梨酸-堿性紫體系的3個(gè)特征吸收峰(254 nm、305 nm 和223 nm)處，苯甲酸-堿性紫體系的吸收強(qiáng)度很弱，借此可以直接測(cè)定山梨酸，共存的苯甲酸不干擾。兩體系的其他吸收特征見(jiàn)表1。

由上可知，在紫外光區(qū)及pH 3.25 Tris-HCl 介質(zhì)存在下，山梨酸-堿性紫體系在紫外光區(qū)的254 nm、305 nm 及223 nm處，有較強(qiáng)的吸光強(qiáng)度，并遵從朗伯-比爾定律，而同條件下的苯甲酸-堿性紫體系在紫外光區(qū)的254 nm、305 nm 及223 nm處的吸收很弱。故在這3 個(gè)波長(zhǎng)處，可以不經(jīng)分離，直接定量檢測(cè)與苯甲酸共存的山梨酸。

1-2.00×10-5 mol/L 堿性紫, 水作參比; 2-1.00×10-5 mol/L苯甲酸, 水作參比; 3-1.00×10-5 mol/L 山梨酸, 水作參比;4-1.00×10-5 mol/L 苯甲酸-1.50×10-4 mol/L 堿性紫,試劑空白作參比；5～10-(0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20)×10-5 mol/L山梨酸-1.50×10-4mol/L堿性紫，試劑空白作參比；pH3.25圖1 山梨酸-堿性紫體系及苯甲酸-堿性紫體系的吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of sorbic acid-basic violet systems and benzoic acid-basic violet systems

表1 山梨酸-堿性紫體系與苯甲酸-堿性紫體系吸收光譜特征Table 1 Absorption spectrum characteristics of sorbic acid- basic violet system and benzoic acid- basic violet system

注：—表示無(wú)

若要提高方法的靈敏度，可在254 nm、305 nm 及223 nm處，采用雙波長(zhǎng)或三波長(zhǎng)吸收光譜法來(lái)定量檢測(cè)有苯甲酸共存時(shí)的山梨酸(依據(jù)吸光度的加和性)，其靈敏度可提高到1.5～4.4 倍。

2.2 反應(yīng)條件

2.2.1 溶液酸度及用量的選擇

室溫下，以254 nm為例，考察了山梨酸-堿性紫體系及可能與之共存的苯甲酸-堿性紫體系在同條件下，不同pH值的Tris-HCl 溶液在254 nm處對(duì)不同體系締合物吸光度A的影響，見(jiàn)圖2。由圖2可知，山梨酸-堿性紫體系在pH 3.25 Tris-HCl 條件下，有相對(duì)較強(qiáng)的吸光度，此時(shí)靈敏度也相對(duì)較大。而苯甲酸-堿性紫體系在254 nm處，當(dāng)pH在3.5～9.2時(shí)，酸度對(duì)體系負(fù)吸光度有較大影響，只有當(dāng)pH<3.5時(shí)，體系基本不受酸度的影響(締合物的吸收強(qiáng)度十分微弱)，故在pH<3.5的條件下測(cè)定山梨酸，共存的苯甲酸不會(huì)干擾測(cè)定。由此說(shuō)明，嚴(yán)格控制溶液的酸度(pH <3.5)，即可實(shí)現(xiàn)不分離苯甲酸而直接定量檢測(cè)山梨酸的目的。

隨即又考察了254 nm 處，pH 3.25 Tris-HCl 溶液用量0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL時(shí)對(duì)山梨酸-堿性紫體系吸光度的影響，結(jié)果表明，用量為1.00 mL 時(shí)，體系有相對(duì)較大的吸光度，靈敏度也相對(duì)較高。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)用pH 3.25 Tris-HCl 溶液1.00 mL。

圖2 Tris-HCl溶液 pH 對(duì)締合物A的影響Fig.2 Effect of Tris-HCl solution pH on association A

圖3 BSV溶液濃度對(duì)締合物A的影響Fig.3 Effect of BSV solution concentration on association A

2.2.2 堿性紫溶液濃度的選擇

室溫下，考察了254 nm、305 nm 及223 nm 處堿性紫溶液用量為0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 mL 時(shí)對(duì)山梨酸-堿性紫體系生成的締合物吸光度A的影響，見(jiàn)圖3?？芍?，在這三波長(zhǎng)處，堿性紫溶液用量為1.50 mL 時(shí)，吸光度相對(duì)較大，即堿性紫溶液濃度為1.50×10-4mol/L 時(shí)，體系有相對(duì)較高的靈敏度。當(dāng)堿性紫溶液用量大于1.50 mL 時(shí)，因用量過(guò)大而使自身聚集作用增強(qiáng)，從而導(dǎo)致吸光強(qiáng)度降低；當(dāng)堿性紫溶液用量小于1.50 mL 時(shí)，因用量不夠，使山梨酸反應(yīng)不完全，致使吸光度有所降低。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)用1.50 mL 堿性紫溶液。由圖3 還可看出，以254 nm 作為單波長(zhǎng)法的測(cè)定波長(zhǎng)時(shí)，靈敏度相對(duì)最高，其次是223 nm。若采用雙波長(zhǎng)(254 nm+305 nm 或254 nm+223 nm)法或三波長(zhǎng)(254 nm+305 nm+223 nm)法測(cè)定，靈敏度均較單波長(zhǎng)法高(見(jiàn)表2)。

2.2.3 試劑加入順序的選擇

室溫下，以雙波長(zhǎng)(254 nm+305 nm)法為例，考察1.00 mL 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)操作液、1.50 mL 堿性紫溶液及1.00 mL pH 3.25 Tris-HCl溶液在不同加入順序時(shí)對(duì)山梨酸-堿性紫體系締合物吸光度A的影響，結(jié)果表明，這幾種物質(zhì)的先后加入順序?qū)w系靈敏度有一定影響。實(shí)驗(yàn)表明，靈敏度相對(duì)較高時(shí)的加入順序?yàn)椋荷嚼嫠崛芤?、Tris-HCl溶液、堿性紫溶液。后續(xù)實(shí)驗(yàn)按物質(zhì)的最佳加入順序進(jìn)行。

2.2.4 反應(yīng)速度及締合物的穩(wěn)定性

室溫下，考察了254 nm、305 nm 及223 nm 處，山梨酸與堿性紫溶液的反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系締合物A的影響。實(shí)驗(yàn)顯示，在這3 個(gè)波長(zhǎng)處，反應(yīng)在15 min 內(nèi)均可進(jìn)行完全，15 min 時(shí)，吸光度達(dá)最大，之后至80 min 內(nèi)，吸光度基本不變，80 min 后，吸光度逐漸下降。這些現(xiàn)象表明，締合物的穩(wěn)定時(shí)間約為1 h。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選在締合物的穩(wěn)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。

2.3 山梨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法的靈敏度

準(zhǔn)確移取山梨酸標(biāo)準(zhǔn)操作液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL 于10 mL比色管中，再加入前述選定條件的其他試劑溶液，配制山梨酸的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，掃描吸收光譜，在254 nm、305 nm及223 nm處，作單波長(zhǎng)法、雙波長(zhǎng)法及三波長(zhǎng)法測(cè)定時(shí)的各標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖4。方法的靈敏度及其他相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表2。從表可知，用單波長(zhǎng)法、雙波長(zhǎng)法及三波長(zhǎng)法測(cè)定的靈敏度順序?yàn)椋喝ㄩL(zhǎng)法>雙波長(zhǎng)法>單波長(zhǎng)法。

圖4 山梨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of sorbic acid

2.4 干擾試驗(yàn)

表2 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)Table 2 Related parameters of standard curves of sorbic acid

2.5 樣品分析

取1#～6# 待測(cè)液各2.00 mL，按實(shí)驗(yàn)方法配制溶液后，以雙波長(zhǎng)(254 nm+305 nm)法為例測(cè)定各樣液及原始樣品中山梨酸的含量。

加標(biāo)回收試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取已粉碎、混勻的1#和2#樣品各25～30 g(精準(zhǔn)至±0.000 1 g)，各稱取3份，分別加入5.00、10.00、20.00 mL 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)操作液，后續(xù)操作同1.3.1項(xiàng)中樣品的處理方法(3 種加標(biāo)水平各平行處理5份)，最后用水定容至100 mL，待測(cè)。另準(zhǔn)確移取3#、4# 和5# 飲料樣各10.00 mL(各3份)，分別加入5.00、15.00、30.00 mL 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)操作液，后續(xù)操作同1.3.2 項(xiàng)中樣品的處理方法(3 種加標(biāo)水平各平行處理5 份)，最后用水定容至100 mL，待測(cè)。另準(zhǔn)確移取6# 樣品10.00 mL 3 份，分別加入5.00、15.00、30.00 mL 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)操作液，后續(xù)操作同1.3.3 項(xiàng)中樣品的處理方法(3 種加標(biāo)水平各平行處理5 份)，最后用水定容至100 mL，待測(cè)。取各定容液適量，以雙波長(zhǎng)(254 nm+305 nm)法為例，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)其含量，并計(jì)算回收率。

樣品測(cè)定結(jié)果及回收試驗(yàn)見(jiàn)表3。

表3 飲料及糕點(diǎn)中山梨酸的分析結(jié)果及回收試驗(yàn)Table 3 Analysis results and recovery test of sorbic acid in beverages and pastries

注：ND 為未檢出；樣品含量<檢出限的按檢出限的1/2 計(jì)算回收率

3 結(jié)論

山梨酸-堿性紫體系的單波長(zhǎng)法、雙波長(zhǎng)法及三波長(zhǎng)法均可在苯甲酸共存的條件下定量檢測(cè)山梨酸，方法有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度，且簡(jiǎn)便、快速，樣品處理簡(jiǎn)單。該體系適于市售飲料及糕點(diǎn)中山梨酸的快速定量測(cè)定。