蘇東民，趙曉琳，林江濤

1(河南工業(yè)大學(xué)，河南 鄭州，450000)2(河南省鐵路食品安全管理工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州， 451460)

我國是以面制食品為主食的國家，小麥粉是最重要的食品原料之一。由于受氣候、土壤、種植及儲存環(huán)境影響，小麥易受到微生物的污染，受污染嚴重時小麥粉會影響食品的安全品質(zhì)。我國規(guī)定小麥粉中致病菌以蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus，B.cereus)、大腸桿菌等作為參考菌群，食品中的B.cereus超過103CFU/g就會產(chǎn)生致嘔吐型毒素和致腹瀉型毒素[1]，因此B.cereus的超標常導(dǎo)致食源性疾病爆發(fā)。根據(jù)對中國食源性疾病爆發(fā)的監(jiān)測資料分析，由B.cereus引起的疾病占所有微生物食源性病例的8.6%，排在第4位。B.cereus是一種革蘭氏陽性細菌，分布廣，存在于土壤、水、空氣以及動物腸道。它產(chǎn)生的芽孢生命力強，可耐低溫，耐高溫，耐強酸強堿[2-4]。2018年，我國山東省某面粉生產(chǎn)廠家因小麥粉中B.cereus含量高達105CFU/g，嚴重超標，對企業(yè)造成巨大損失。目前，我國國家標準還未對小麥粉中的B.cereus進行限定，但許多企業(yè)標準和地方標準已有相關(guān)規(guī)定，如香港微生物含量指引中指出：B.cereus數(shù)小于103CFU/g為滿意等級；有報告顯示[5]：在歐洲小麥粉中B.cereus數(shù)大于102CFU/g為不合格。

國內(nèi)外關(guān)于食品中B.cereus的殺滅技術(shù)有電子束輻照，脈沖電場，超高壓[6]，紫外，微波輻照等。微波滅菌技術(shù)具有殺菌速度快，殺菌效果好，不污染食品和環(huán)境等優(yōu)點[7]。郭全友等、KIM 等[8-9]的研究發(fā)現(xiàn)微波處理可以有效殺滅B.cereus，另外有許多研究將微波技術(shù)應(yīng)用于干燥[10]、殺蟲[11]、保鮮[12]、毒素脫除[13]等方面，但將微波技術(shù)應(yīng)用于小麥或小麥粉滅菌的研究較少。采用微波滅菌技術(shù)對小麥進行滅菌需要較大功率和較長時間，小麥表皮極易焦糊，而且會在小麥制粉時造成二次污染。本文將以小麥粉作為滅菌對象，利用微波技術(shù)對小麥粉進行處理以降低小麥粉中B.cereus含量。通過正交試驗對微波殺菌條件進行優(yōu)化。探究微波處理對小麥粉中B.cereus的殺菌效果，為提高食品安全，解決由于小麥微生物感染而導(dǎo)致的面制食品安全問題提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4種不同產(chǎn)地的小麥(臨沭縣、郯城縣、相邸鎮(zhèn)、壯崗鎮(zhèn))，山東玉皇糧油食品有限公司；甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂基礎(chǔ)(MYP)、多粘菌素B、50%卵黃液、營養(yǎng)瓊脂基礎(chǔ)、胰酪胨大豆羊血瓊脂、溶菌酶營養(yǎng)肉湯、硫酸錳營養(yǎng)瓊脂基礎(chǔ)，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；NaCl、H2O2，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

P70F23P-G5(S0)微波爐，格蘭仕微波爐電器制造有限公司；SW-CJ-2D，凈化工作臺，上海蘇凈實業(yè)有限公司；DY04-13-44-00立式壓力蒸汽滅菌器，上海東亞壓力容器制造有限公司；SPX-100 B-Z生化培養(yǎng)箱，上海迅博實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SHZ-B水浴恒溫振蕩器，上海迅博實醫(yī)療生物儀器股份有限公司；BXS-1顯微鏡，上海炳宇光學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 選擇研究對象

采用粉碎機對4種小麥進行粉碎后，測定樣品菌落總數(shù)及B.cereus含量。其中產(chǎn)自臨沭縣的小麥樣品微生物水平最高，故以此作為研究對象。

1.3.2 樣品制備

將選定的小麥樣品按照AACC26-21方法進行制粉，出粉率為69.8%，B.cereus初始含量為1.6×104CFU/g，將小麥粉放入冷柜短暫儲藏，及時進行處理、檢測。

1.3.3 小麥粉水分調(diào)節(jié)

將小麥粉樣品放置于恒溫恒濕箱，溫度(30±1)℃，濕度60 %，平衡水分24 h。將原始小麥粉與調(diào)節(jié)水分后的小麥粉混配得到水分為13%、14%、15%、16%、17%的小麥粉樣品。

1.3.4B.cereus計數(shù)

按照GB 4789.14—2014《食品微生物學(xué)檢驗蠟樣芽孢桿菌的檢驗》平板計數(shù)法計數(shù)。

1.3.5 微波處理小麥粉方法

將40 g不同水分含量的小麥粉平鋪于20 cm×20 cm的專用托盤，設(shè)置微波功率和微波時間進行處理。

1.3.6 殺滅率的計算

分別對處理后小麥粉中B.cereus進行計數(shù)，計算殺滅率，計算如公式(1)，并以殺滅率作為滅菌效果的評價標準。

(1)

式中：I，小麥粉初始B.cereus含量，CFU/g；T，小麥粉經(jīng)微波處理后B.cereus含量，CFU/g；K，殺滅率，%。

1.3.7 微波處理后小麥粉中B.cereus生長趨勢的評價

將處理后各樣品置于(25±1) ℃下儲存，分別在第0、2、4、8、12天對各樣品中B.cereus進行計數(shù)，觀察不同條件下微波處理對小麥粉中B.cereus生長趨勢的影響。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.6進行圖表繪制，采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行正交優(yōu)化、方差分析和多重比較。實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，采用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)微波處理設(shè)備設(shè)置微波處理功率。經(jīng)過分析樣品厚度對滅菌率的影響，發(fā)現(xiàn)厚度越小殺滅率越高，故在此研究中將樣品厚度固定為0.1 g/cm2。在此基礎(chǔ)上，分別探討處理時間、微波功率、樣品水分含量對小麥粉中B.cereus殺滅率及生長趨勢的影響，優(yōu)化滅菌條件。

2.1 微波處理對B.cereus殺滅率的影響

2.1.1 樣品水分含量對B.cereus殺滅率的影響

分別將含水質(zhì)量分數(shù)為13 %～17 % 的小麥粉均勻平鋪于托盤，料層厚度0.1 g/cm2，設(shè)置處理時間6.5 min，微波功率700 W進行微波處理。小麥粉的水分含量顯著影響其介電常數(shù)[14-15]，且介電常數(shù)越大，微波對食品產(chǎn)生的熱效應(yīng)及非熱效應(yīng)越強。由圖1可知，隨樣品水分含量增加，處理后的小麥粉中B.cereus含量先降低后增加，殺滅率先升高后降低。樣品水分含量15%時，B.cereus含量低于1×102CFU/g，殺菌率最高，達到96.81%。

防樣品水分含量升高，小麥粉中B.cereus含量先降低后升高的原因是樣品水分含量增加改善了小麥粉的介電性質(zhì)，提高了微波滅菌效率，造成B.cereus含量降低。另一方面，B.cereus常以營養(yǎng)細胞和芽孢的形式存在，芽孢能在80 ℃左右的高溫和適宜濕度下活化萌發(fā)[16-18]。因此，高水分含量的樣品與含水質(zhì)量分數(shù)為14%、15%的小麥粉相比B.cereus含量略有升高，微波滅菌效率降低。

圖1 水分含量對B.cereus殺滅率的影響Fig.1 The effect of moisture content on the sterilization rate of B.cereus注：圖中不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 微波功率對B.cereus殺滅率的影響

將含水質(zhì)量分數(shù)為12 %的小麥粉均勻平鋪于托盤，料層厚度固定為0.1 g/cm2，固定處理時間7.5 min分別設(shè)置微波功率120、280、462、581、700 W進行微波處理。當功率低于462 W時，微波處理會造成小麥粉中B.cereus含量顯著(P<0.05)高于原始含量，B.cereus殺滅率為負值，如圖2所示。當功率高于462 W時，B.cereus含量顯著降低，殺滅率隨微波功率增加大幅度提高。微波功率700 W時，微波對B.cereus的殺滅率能夠達到99%以上。

低功率處理后B.cereus含量高于原始含量是由于溫和的微波處理能夠促進B.cereus芽孢的萌發(fā)，導(dǎo)致小麥粉中B.cereus含量增加。VALERO、SONI、陳未等[19-22]的研究發(fā)現(xiàn),B.cereus的芽孢在高溫、紫外等條件下能夠被迫萌發(fā)；并且萌發(fā)后的芽孢會失去休眠芽孢的極端抗性，相對容易被殺死，對常規(guī)滅菌方法的抵抗力明顯降低。而高功率的微波處理能使芽孢提前完成萌發(fā)并失去抗性，在相同的處理時間內(nèi)大幅降低小麥粉中B.cereus含量。這對工業(yè)微波滅菌參數(shù)的選擇有重要價值。

圖2 微波功率對B.cereus殺滅率的影響Fig.2 The effect of microwave power on the sterilization rate of B.cereus

2.1.3 處理時間對B.cereus殺滅率的影響

將含水質(zhì)量分數(shù)為12%的小麥粉均勻平鋪于托盤，料層厚度0.1 g/cm2，設(shè)置微波功率700 W，分別處理3.5、4.5、5.5、6.5、7.5 min。隨處理時間增加，B.cereus含量逐漸降低，殺菌率逐漸提高，如圖3所示,經(jīng)短時間微波處理的小麥粉中B.cereus含量緩慢下降，差異不顯著，處理時間5.5 min時小麥粉中B.cereus含量急劇下降，殺菌率大幅提升。7.5 min時滅菌率最高，達到99 %以上。

因為短時間內(nèi)微波滅菌還處于滅菌初期，盡管部分B.cereus被殺滅，但多數(shù)B.cereus芽孢正在萌發(fā)，故B.cereus含量沒有顯著降低，滅菌率沒有顯著提高。處理時間5.5 min時，B.cereus含量銳減是由于初期芽孢萌發(fā)完成，B.cereus較容易被殺滅。

圖3 微波時間對B.cereus殺滅率的影響Fig.3 Effect of microwave time on the sterilization rate of B.cereus

2.2 微波處理對小麥粉中B.cereus生長趨勢的影響

2.2.1 樣品水分含量對小麥粉中B.cereus生長趨勢的影響

由圖4可知，對不同水分含量的小麥粉進行微波處理后，小麥粉中B.cereus含量均隨儲存時間波動較大。含水質(zhì)量分數(shù)15%的樣品經(jīng)微波處理后12 d內(nèi)，B.cereus含量維持在較低水平下；隨儲存時間延長，含水質(zhì)量分數(shù)14%的樣品中B.cereus含量先有小幅度增加后降低，并且在第12天時B.cereus含量也能夠達到較低水平；小麥粉含水質(zhì)量分數(shù)為13%、16%、17%時，B.cereus含量較高，但均低于原始樣品中B.cereus含量。

含水質(zhì)量分數(shù)17%的小麥粉樣品中B.cereus生長活力大，不屬于衰亡期菌種，在儲存期間B.cereus含量快速上升，這種情況會對食品安全造成極大隱患。而隨著樣品水分含量降低，微波處理后小麥粉中B.cereus的繁殖速度變緩，這一方面是由于樣品中B.cereus初始含量降低，另一方面是由于B.cereus受到不同程度的損傷。

圖4 水分含量對B.cereus生長趨勢的影響Fig.4 Effect of moisture content on the growthtrend of B.cereus

2.2.2 微波功率對小麥粉中B.cereus生長趨勢的影響

在不同功率下對小麥粉進行微波處理后，小麥粉中B.cereus含量均隨儲存時間先升高后降低，并且在第8天時達到峰值，如圖5所示。在儲存12 d內(nèi)，低功率120、280 W微波處理后小麥粉B.cereus含量均顯著高于原粉，462 W微波處理后小麥粉B.cereus含量與原粉無顯著差異；微波處理功率581 W、700 W的樣品中B.cereus含量顯著(P<0.05)低于原粉，并維持在較低水平下。

經(jīng)低功率微波處理后，小麥粉中B.cereus顯示出較高的繁殖能力，這說明低功率微波處理并不能對B.cereus造成嚴重損傷。700 W微波處理后，小麥粉中B.cereus含量在儲存前期有明顯升高，這由于700 W微波處理后，小麥粉中極少部分抗性較強的B.cereus存活，并具有較強繁殖能力，8 d后開始衰敗。

圖5 微波功率對B.cereus生長趨勢的影響Fig.5 Effect of microwave power on the growth trend of B.cereus

2.2.3 處理時間對小麥粉中B.cereus生長趨勢的影響

對小麥粉微波處理不同時間后，樣品中B.cereus含量隨儲存時間變化較小，如圖6所示。在儲存時間12 d內(nèi)，短時間微波處理后小麥粉中B.cereus含量與原粉中B.cereus含量無顯著差異，均維持在較高水平下；微波處理時間5.5、6.5、7.5 min的樣品中B.cereus含量顯著低于原粉，均維持在較低水平下，并且小麥粉經(jīng)微波處理時間越長，B.cereus含量越低。

圖6 微波時間對B.cereus生長趨勢的影響Fig.6 The effect of microwave time on the growth trend of B.cereus

2.3 正交試驗結(jié)果及分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，運用正交試驗，考察樣品水分含量、微波功率、微波時間對小麥粉中B.cereus殺滅率的影響，進行3因素3水平試驗。3個因素分別以A、B、C表征，采用L9(33)正交試驗，評選出最佳綜合條件。表1為因素水平表。

表2極差分析結(jié)果和表3方差分析結(jié)果綜合表明，3個因素對殺菌率的影響程度為微波功率>微波時間>水分含量(質(zhì)量分數(shù))，微波功率和微波時間對殺滅率影響極顯著，而水分含量對殺滅率影響相對不顯著。各因素最優(yōu)水平組合為A3B3C2，即處理時

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Table of factors of orthogonal test

間7.5 min，微波功率700 W，樣品含水質(zhì)量分數(shù)15%。在正交試驗的9個處理中，滅菌率最高的處理組合為A3B3C1，即處理時間7.5 min，微波功率700 W，樣品含水質(zhì)量分數(shù)14%。對這兩個組合進行驗證試驗，結(jié)果表明兩組合之間沒有顯著性差異。

表2 正交試驗結(jié)果分析表Table 2 Analysis table of orthogonal test results

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Anova table of orthogonal test results

3 結(jié)論與展望

改變微波條件進行單因素試驗可以發(fā)現(xiàn)，面粉初始水分含量過低或過高都會降低微波處理對B.cereus的殺滅效率；低功率的微波處理能夠使小麥粉中B.cereus孢子活化萌發(fā)，微波功率達581 W以上，能夠顯著降低小麥粉中B.cereus含量，提高殺滅率；隨處理時間延長，B.cereus含量降低，殺滅率升高。不同的微波處理條件導(dǎo)致B.cereus生長趨勢不同，較優(yōu)的微波滅菌條件能使B.cereus含量維持在較低水平。微波處理對B.cereus的最優(yōu)殺滅工藝為：微波時間7.5 min、微波處理功率700 W、樣品水分含量15%。

微波技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品滅菌，只有把握微波處理后微生物的生長趨勢，才能正確選擇滅菌條件。然而，許多研究也表明，對小麥粉進行過度的微波處理會導(dǎo)致其面筋、粉質(zhì)、糊化等特性改變[23-24]，面制品品質(zhì)降低，因此需要在保證食品原料品質(zhì)的基礎(chǔ)上盡可能地達到微波處理的目的