梁劍鋒，李亞，梁燕妮，卓梅芳，楊韶平

(梧州學(xué)院 化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院，廣西 梧州， 543002)

苯并(a)芘，是一種常見高活性間接致癌物，被國際衛(wèi)生組織列為Ⅰ類致癌物質(zhì)[1-4]。近兩年食品安全抽檢結(jié)果顯示，我們?nèi)粘Ｊ秤玫挠椭缁ㄉ?、芝麻油、棉籽油、菜籽油、葵花籽油等都存在苯并芘超?biāo)現(xiàn)象。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道[5-10]，食用油脂受到苯并(a)芘污染主要有以下3個(gè)途徑：(1)油料、成品在生產(chǎn)過程中接觸食品加工機(jī)械潤滑油；(2)油料在干燥環(huán)節(jié)接觸瀝青；(3)油料在存儲(chǔ)過程中發(fā)生了霉變而產(chǎn)生苯并(a)芘，隨后在加工過程中帶入食用油脂產(chǎn)品。因此，研究食用油脂中苯并(a)芘快速檢測方法，對了解并控制其對食用油脂污染及保障公眾食品安全具有十分重要的意義。

目前，食品中苯并(a)芘的檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、免疫學(xué)法、薄層色譜法、熒光分光光度法等[11-15]。采用國標(biāo)方法GB 5009.27—2016對食用油脂進(jìn)行前處理并檢測其苯并(a)芘含量時(shí)，由于實(shí)驗(yàn)過程需要苯并(a)芘分子印跡柱凈化﹑氮吹儀濃縮等手工操作步驟，而且由于使用二氯甲烷高毒害性有機(jī)試劑作為溶劑，導(dǎo)致操作分析時(shí)間過長且消耗大量有毒有害有機(jī)溶劑[16]。近年來，在線凈化與超高速液相色譜儀聯(lián)用技術(shù)已在食品安全檢測分析中得到應(yīng)用[17-20]，該技術(shù)具有凈化與檢測一體化、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。本研究建立在線凈化與超高速液相色譜儀聯(lián)用并應(yīng)用于食用油脂中苯并(a)芘檢測，其原理為通過2個(gè)不同色譜柱聯(lián)用，分別完成對食用油脂的凈化與檢測工作，整個(gè)試驗(yàn)無需使用高毒性有機(jī)試劑與價(jià)格昂貴的固相小柱，樣品提取過程方便快捷，具有經(jīng)濟(jì)、高效、對環(huán)境友好、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市場上售賣的豬油、土榨花生油、茶籽油、大豆油、調(diào)和油；正己烷、二氯甲烷、乙腈、異丙醇(色譜級)，德國CNW公司； 苯并(a)芘專用 SPE 印跡柱(500 mg，6 mL)，博納艾杰爾科技有限公司；濃度苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液(20±0.038)μg/mL)：農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所。

1.2 儀器

XS105du 電子天平，瑞士梅特勒公司； ST16R離心機(jī)，美國熱電公司；J2正壓固相萃取，北京普利泰科儀器有限公司；1290 Infinity液相色譜儀(包括2個(gè)高壓二元泵、一個(gè)六通閥)，美國安捷倫科技有限公司；Kromasil 反C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)柱，瑞典阿克蘇諾貝爾公司；ChromSpher Pi色譜柱(80 mm×3.0 mm,5 μm)，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 雙柱在線凈化檢測原理

雙柱在線凈化檢測系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了樣品在線凈化與檢測的自動(dòng)一體化，其運(yùn)行步驟：第1步中的，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣后，進(jìn)入第1根色譜柱進(jìn)行初步的分離與富集，將樣品中大部分非目標(biāo)物質(zhì)、雜質(zhì)分離，然后將樣品(500 μL)中的目標(biāo)物苯并(a)芘分析物在色譜柱上進(jìn)行富集，其間分離出來的雜質(zhì)組分不進(jìn)入檢測器，而是經(jīng)閥門直接進(jìn)入廢液池；第2步,進(jìn)樣一段時(shí)間后，系統(tǒng)中六通閥進(jìn)行切換，將第1根色譜柱流出的組分進(jìn)入第2根色譜柱進(jìn)行分離、檢測，同時(shí)由于系統(tǒng)流動(dòng)相的變化，在第1根色譜柱上富集的苯并(a)芘進(jìn)行洗脫進(jìn)入第2根色譜柱分析，并在第2根色譜柱進(jìn)一的分離后進(jìn)入熒光檢測器檢測含量。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用正己烷-異丙醇(體積比1∶1)將(20±0.038)μg/mL苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至50 ng/mL的苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液，然后再用正己烷-異丙醇(體積比1∶1)逐級稀釋濃度為1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、20 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4.2 樣品前處理方法

稱取均勻樣品2.50 g置于15 mL離心管中，加入正己烷-異丙醇溶液(體積比1∶1)并至5.00 mL，搖勻，用渦旋器混合1.0 min，然后放入設(shè)置條件為4 000 r/min、4 ℃冷凍離心機(jī)離心4 min，取出后吸取溶液的上清液，用0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾，濾液待測。

1.4.3 色譜條件

系統(tǒng)中第1根色譜柱(Kromasil 反C18柱)色譜條件：流動(dòng)相，乙腈-水(體積比80∶20)，流速：1.0 mL/min，柱溫40 ℃；第2根色譜柱(ChromSpher Pi)色譜條件：流動(dòng)相，異丙醇-乙腈(體積比65∶35)，流速：1.2 mL/min。柱溫40 ℃；檢測器：FLD(熒光)檢測器；發(fā)射波長：406 nm；激發(fā)波長：384 nm。進(jìn)樣量500 μL(500 μL定量環(huán))。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)中六通閥切換時(shí)間考察

第1根色譜柱采用Kromasil反C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)柱，其負(fù)責(zé)分離樣品中的雜質(zhì)和富集苯并(a)芘。通過流動(dòng)相比例變化將第1根色譜柱富集的樣品中的苯并(a)芘洗脫至第2根色譜柱進(jìn)行分離、檢測，第2根色譜柱采用苯并芘分析專用色譜柱安捷倫ChromSpher Pi柱。當(dāng)?shù)?根色譜柱以乙腈-水(體積比80∶20)為流動(dòng)相時(shí)，樣品與苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所得色譜圖見圖1。

圖1 第1根色譜柱系統(tǒng)中樣品與苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Standard solution chromatogram of sample and benzo(a) pyrene in the first column system

由圖1可見，樣品中非目標(biāo)物質(zhì)在3 min內(nèi)流出第1根色譜柱，樣品中目標(biāo)分析物苯并(a)芘流出的時(shí)間約為3.3 min后，在第1根色譜柱中待分析物與基體雜質(zhì)基本能夠分離。因此在線凈化系統(tǒng)中六通閥切換到第2根色譜柱時(shí)間確定為3.5 min。如切換系統(tǒng)早于3.5 min，則導(dǎo)致進(jìn)入第2根色譜柱的非目標(biāo)物較多，從而引起檢測結(jié)果偏高；而如果將閥門切換時(shí)間確定在3.5 min之后，樣品中目標(biāo)物苯并(a)芘流入廢液池，導(dǎo)致方法的回收率降低、結(jié)果偏低。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍的測定

以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)熒光峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而得到線性回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)和范圍。該試驗(yàn)方法的苯并(a)芘在1.0～20.0 ng/mL(濃度范圍與國標(biāo)方法一致)時(shí)樣品濃度與響應(yīng)值之間呈線性關(guān)系，其線性回歸方程為Y=1.872 8X-0.038 5，相關(guān)系數(shù)r2為0.999 6，具有良好線性關(guān)系。

2.2.2 檢出限的測定

準(zhǔn)確稱取樣品2.50 g，加入0.10 mL的1.3配制的質(zhì)量濃度為50 ng/mL的苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液。按照1.4的前處理方法處理樣品，即為其檢出限，信噪比S/N=4.5。

檢出限為各化合物的3倍信噪比即(S/N=3)即被定為最低檢出限(LOD)，測得數(shù)據(jù)顯示，檢出限苯并(a)芘信噪比S/N>3，可以確定方法的檢出限在0.08 μg/kg，優(yōu)于國家標(biāo)準(zhǔn)中0.1 μg/kg要求。

2.2.3 樣品的測定

從市場上購買5份動(dòng)植物油脂樣品，分別采用雙柱在線凈化檢測系統(tǒng)和國標(biāo)GB 5009.27—2016進(jìn)行測定，每份樣品重復(fù)測定6次，2種方法檢測結(jié)果分別見表1。

表1 實(shí)際樣品檢測結(jié)果(n=6)Table 1 Test results of actual samples

從以上5份實(shí)際樣品檢測結(jié)果中，考察在線凈化系統(tǒng)與國標(biāo)方法2種方法在分析結(jié)果、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)等，本文雙柱在線凈化檢測系統(tǒng)在檢測結(jié)果、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)與國標(biāo)方法測定方法相近。

2.2.4 方法回收率與精密度

對市場上購買的常見5種動(dòng)植物油脂中添加苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行1、5、10 μg/kg三個(gè)水平添加，每個(gè)添加水平測定6次，分別采用雙柱在線凈化檢測系統(tǒng)與國標(biāo)GB 5009.27—2016方法測定并計(jì)算回收率和精密度，試驗(yàn)結(jié)果見表2、表3。

表2 本文試驗(yàn)方法的回收率、精密度測定結(jié)果(n=6)Table 2 The results of recovery and precision measurementof the test method in this paper

從以上測定結(jié)果可以看出，雙柱在線凈化系統(tǒng)方法回收率均在82.0%～91.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.89%～4.29%，與國標(biāo)方法的回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差接近，雙柱在線凈化系統(tǒng)試驗(yàn)結(jié)果符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中回收率和精密度的要求，滿足含量在μg/kg級別的動(dòng)植物油脂檢測要求[21]，表明該方法適用于動(dòng)植物油脂中苯并(a)芘的檢測。

表3 國標(biāo)GB 5009.27—2016方法的回收率、精密度測定結(jié)果(n=6)Table 3 The results of recovery and precision of GB 5009.27—2016 method

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用雙柱在線凈化分析系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)分析樣品高度自動(dòng)化，樣品加入正己烷、異丙醇溶劑提取、過濾后可直接進(jìn)樣分析，系統(tǒng)首先利用第1根色譜柱對樣品進(jìn)行凈化與苯并(a)芘目標(biāo)物質(zhì)富集，經(jīng)過3.5 min后利用六通閥將組分切換到系統(tǒng)中的第2根色譜柱，目標(biāo)物進(jìn)一步得到分離與檢測，整個(gè)試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了凈化與檢測一體化，自動(dòng)化程度高，無需使用有毒有機(jī)溶劑，對操作者與環(huán)境友好。雙柱在線凈化分析系統(tǒng)在精密度、回收率等指標(biāo)與國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 5009.27—2016接近，檢出限優(yōu)于國家標(biāo)準(zhǔn)，本系統(tǒng)可應(yīng)用于常見動(dòng)植物油脂如豬油、土榨花生油、茶籽油、大豆油、調(diào)和油等易受苯并(a)芘污染的樣品快速檢測。