李曉明，陳凱，黃占旺，沈勇根*，盧劍青，程宏楨，劉馥源，安兆祥，徐弦

1(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌，330045)2(宜春市林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展管理(油茶)局，江西 宜春，336000)

白玉菇(whiteHypsizygusmarmoreu)是真姬菇的白色品系，又名白玉蕈、白色海鮮菇，屬傘菌目、白蘑科、玉蕈屬[1]，其菇體潔白，質(zhì)地細膩，具有獨特的海蟹味，深受消費者的歡迎[2]。白玉菇營養(yǎng)豐富，含有多種營養(yǎng)成分，其中多糖含量高達7.5%(占干重)，相較于其他藥用真菌如猴頭菇、豬苓等要高很多[3]，藥用價值高；此外，白玉菇子實體中還含有21.8%(占干重)的蛋白質(zhì)和多種微量元素等，王耀松等[4]通過對白玉菇的營養(yǎng)性分析發(fā)現(xiàn)白玉菇蛋白的氨基酸模式與人體氨基酸模式非常接近，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。近年來，隨著人們對蛋白質(zhì)需求量的大幅度增加，植物蛋白以其不含膽固醇且資源豐富、價格低廉的特點，越來越受到人們的關(guān)注[5]，國際上提取和利用植物蛋白已成為研究熱點，而對于白玉菇的研究主要集中在多糖的提取及分析上[3,6]，對于其蛋白質(zhì)的提取及利用還鮮有報道。

蛋白質(zhì)的提取方法主要有堿法提取、酶法提取、有機溶劑提取等，其中堿提法操作簡單，成本低廉，提取率高[7]。因此本實驗采用堿提法從白玉菇中提取蛋白質(zhì)，并通過單因素分析，結(jié)合響應(yīng)面法，確定提取白玉菇蛋白的最佳工藝條件，在此基礎(chǔ)上進一步研究不同pH值對白玉菇蛋白功能特性的影響及氨基酸組成，以期為白玉菇蛋白在食品工業(yè)體系中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮白玉菇，江西星火農(nóng)林科技有限公司提供；魯花壓榨特香菜籽油，購于江西農(nóng)大超市。

濃HCl、硼酸、H3PO4(分析純)，四川西隴化工有限公司；NaOH(分析純)，天津永大化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白(BSA)，上海源葉生物科技有限公司；考馬斯亮藍G-250，上海強順化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA124S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；Q500B高速多功能粉碎機，上海冰都電器有限公司；SCZL-2數(shù)顯控溫磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司； SF-TGL-16G臺式高速離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司；便攜式pH計，上海大普儀器有限公司；T-25 basic高速分散機，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；WFJ 2100可見分光光度計，尤尼科(上海)科學(xué)儀器有限公司；Scientz-10N 冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；L-8800型氨基酸分析儀，日本日立有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

取適量新鮮白玉菇洗凈置于60 ℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，粉碎后過80目篩，制得白玉菇粉，備用。

1.3.2 白玉菇蛋白的提取

白玉菇蛋白的提取參照劉靜等[8]的方法略作修改。

白玉菇粉→加水溶解→調(diào)pH、溫度堿提→離心(3 000 r/min,15 min)→取上清液→測蛋白含量→調(diào)pH至等電點→4℃過夜沉淀→離心(8 000 r/min，10 min)→沉淀水洗調(diào)pH至中性→冷凍干燥→白玉菇蛋白粉

1.3.3 白玉菇蛋白提取率的測定

提取液中蛋白含量的測定采用Bradford法[9]，配制不同濃度梯度的BSA標準品溶液，加入考馬斯亮藍G-250染色，于595 nm處測吸光值，繪制BSA標準曲線，得到方程y=6.77x+0.395 6(R2=0.992 2)。白玉菇蛋白含量測定參照國標GB 5009.5—2016中凱氏定氮法。根據(jù)公式(1)計算白玉菇蛋白提取率:

白玉菇蛋白提取率/%

(1)

1.3.4 單因素試驗

在白玉菇蛋白堿提工藝中，固定提取條件pH為10、提取溫度為50 ℃、料液比為1∶30 (g∶mL)、提取時間為2 h。對4個因素：pH(8、9、10、11、12、13)、提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)、料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50)、提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)分別進行單因素試驗,考察各因素對白玉菇蛋白提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，運用Design-Expert 8.0.6軟件，依據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，以A(pH)、B(提取溫度)、C(料液比)、D(提取時間)為自變量，以白玉菇蛋白提取率為響應(yīng)值，設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。具體的試驗因素、水平及編碼見表1。

表1 試驗因素水平及編碼表Table 1 Experiment factor level and coding table

1.3.6 白玉菇蛋白等電點(pI)的測定

等電點的測定參照孫小斐等[10]的方法略作修改。準確量取25 mL堿提液，加1 mol/L HCl 調(diào)溶液pH至3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0，靜置2 h，以8 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液于595 nm處測吸光值，溶液的吸光值與蛋白含量有關(guān)，上清液吸光值最低的溶液，其pH值即為白玉菇蛋白等電點。

1.3.7 白玉菇蛋白功能特性的測定

1.3.7.1 溶解性(nitrogen solubility index,NSI)的測定

參照LEE等[11]的方法并略作修改。準確稱取0.2 g白玉菇蛋白于20 mL蒸餾水中，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)溶液pH至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，磁力攪拌45 min，以3 000 r/min離心15 min，測上清液蛋白含量。蛋白樣品中的蛋白含量測定參照GB 5009.5—2016中的凱氏定氮法。根據(jù)公式(2)計算白玉菇蛋白的溶解性:

(2)

1.3.7.2 乳化性(emulsifying activity index,EAI)及乳化穩(wěn)定性(emulsifying stability index,ESI)的測定

參照薛蕾等[12]的方法并略作修改。準確稱取0.5 g白玉菇蛋白于25 mL蒸餾水中，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)溶液pH至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，加入等體積25 mL菜籽油，在高速分散機中以9 500 r/min高速攪打2 min，隨后迅速量取30 mL于離心管中，以2 000 r/min離心10 min，測量乳化層的高度及離心管液體總高度，然后再將離心管放入80 ℃水浴30 min，冷卻至室溫后以2 000 r/min離心10 min，測量乳化層的高度。根據(jù)公式(3)、公式(4)計算白玉菇蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性:

(3)

(4)

1.3.7.3 起泡性(foamability,FA)及泡沫穩(wěn)定性(foaming stability,FS)的測定

參照張思思等[13]的方法略作修改。準確稱取0.8 g白玉菇蛋白粉于40 mL蒸餾水中，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH 調(diào)溶液pH至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，在高速分散機中以9 500 r/min高速攪打2 min，隨后迅速將其倒入量筒中，記錄上層泡沫的體積，靜置30 min后，再次記錄上層泡沫的體積。計算白玉菇蛋白的起泡性及泡沫穩(wěn)定性,如公式(5)、(6)所示:

(5)

(6)

1.3.7.4 持水性(water holding capacity，WHC)的測定

參照楊希娟等[14]的方法并略作修改。準確稱取0.25 g白玉菇蛋白粉于預(yù)先稱量過的10 mL離心管中，加入5 mL蒸餾水，充分振蕩搖勻，靜置1 h，以4 000 r/min離心10 min，倒去上清液，測定離心管中殘留物的重量。根據(jù)公式(7)計算白玉菇蛋白的持水性:

(7)

1.3.7.5 持油性(oil holding capacity，OHC)的測定

參照張維農(nóng)等[15]的方法并略作修改。準確稱取0.25 g白玉菇蛋白粉于預(yù)先稱量過的10 mL刻度的離心管中，加入5 mL菜籽油，充分振動搖勻，靜置1 h，以4 000 r/min離心10 min，倒去上清液，測定離心管中殘留物的質(zhì)量。根據(jù)公式(8)計算白玉菇蛋白的持油性:

(8)

1.3.8 氨基酸組成分析

參照GB 5009.124—2016對白玉菇蛋白氨基酸的組成及含量進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 pH對白玉菇蛋白提取率的影響

如圖1所示，蛋白提取率隨pH的升高呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)溶液pH為8～12時，隨著pH的升高，蛋白提取率上升顯著(P<0.05)，這可能是因為蛋白質(zhì)分子間的氫鍵被打破，促進了蛋白質(zhì)分子的溶出，當(dāng)pH為12時，提取率達到最高值為35.83%；當(dāng)溶液pH大于12后，蛋白提取率下降顯著(P<0.05)，這可能是因為強堿溶液較為黏稠不利于蛋白的溶出，且易使蛋白質(zhì)變性。所以選取pH=12進行后續(xù)試驗。

圖1 pH對白玉菇蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of pH on protein extraction rate注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.1.2 提取溫度對白玉菇蛋白提取率的影響

如圖2所示，蛋白提取率隨提取溫度的升高呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)提取溫度為30～60 ℃時，蛋白提取率上升顯著(P<0.05)，這可能是因為溫度的升高使蛋白質(zhì)分子熱運動增加，溶出率增高，當(dāng)提取溫度為60 ℃時，蛋白提取率達到最高值為33.30%；當(dāng)提取溫度大于60 ℃后，蛋白提取率下降顯著(P<0.05)。所以選取提取溫度60 ℃進行后續(xù)試驗。

圖2 提取溫度對蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on protein extraction rate

2.1.3 料液比對白玉菇蛋白提取率的影響

如圖3所示，蛋白提取率隨料液比的增加呈先上升后平緩的趨勢。當(dāng)料液比為(1∶15)～(1∶40)(g∶mL)時，隨著料液比的增加，蛋白提取率增長顯著(P<0.05)；當(dāng)料液比大于1∶40后，白玉菇蛋白提取率雖略有下降，但趨于平緩，下降不顯著(P<0.05)。這可能是因為當(dāng)料液比較小時，菇粉本身溶解不完全，且此時溶液黏性較大，不利于蛋白質(zhì)分子的溶出，當(dāng)料液比增大時，菇粉充分溶解，蛋白提取率增加。所以選取料液比1∶40進行后續(xù)試驗。

圖3 料液比對蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of materials-to-liquid ratio on protein extraction rate

2.1.4 提取時間對白玉菇蛋白提取率的影響

如圖4所示，蛋白提取率隨提取時間的延長呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)提取時間為0.5～2.0 h時，蛋白提取率增長顯著(P<0.05)，這可能是因為隨著提取時間的增加，溶液經(jīng)長時間的攪拌，菇粉細胞壁被充分破壞，蛋白質(zhì)分子更易溶出，當(dāng)提取時間為2.0 h，蛋白提取率最高值為36.08%；當(dāng)提取時間大于2.0 h后，蛋白提取率下降顯著(P<0.05)。所以選取提取時間2.0 h進行后續(xù)試驗。

圖4 提取時間對蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on protein extraction rate

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

以A(pH)、B(提取溫度)、C(料液比)、D(提取時間)4個因素為自變量，以白玉菇蛋白提取率為響應(yīng)值，設(shè)計出4因素3水平共29組響應(yīng)面優(yōu)化試驗，具體試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

2.2.2 二次回歸模型的建立及顯著性分析

運用Design-Expert 8.0.6軟件，對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行回歸擬合，得到以A(pH)、B(提取溫度)、C(料液比)、D(提取時間)為自變量，以白玉菇蛋白提取率Y為響應(yīng)值的二次多項回歸方程:

Y/%=42.74+4.28A+2.22B-0.43C+0.46D-2.34AB+0.035AC-0.60AD-0.063BC-0.92BD-0.68CD-6.16A2-2.39B2-1.33C2-1.62D2

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Regression model variance analysis table

注：*差異顯著(P<0.05)；**差異極顯著(P<0.01)

2.2.3 響應(yīng)面各因素交互作用分析

運用Design-Expert8.0.6軟件，分析響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果，得到響應(yīng)曲面圖5。

圖5 各因素兩兩交互作用對蛋白提取率的影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of the influence of the interaction of various factors on the protein extraction rate

三維曲面圖是對各因素影響蛋白提取率大小最直觀的展示，曲面越陡峭，說明因素對響應(yīng)值的影響越大；曲面越平緩，說明因素對響應(yīng)值的影響越小[16]。綜合觀察圖5，可看出圖5-a、5-b、5-c三圖中曲面較為陡峭，說明pH與提取溫度、料液比、提取時間的交互作用對蛋白提取率的影響較大，而且根據(jù)曲面的陡峭程度，可看出pH值對蛋白提取率的影響最大，其次為提取溫度，提取時間與料液比兩者相差不大且影響較小，與方差分析結(jié)果一致；圖5-d、5-e、5-f三圖曲面平緩，說明提取溫度與料液比、提取溫度與提取時間及料液比與提取時間的交互作用對蛋白提取率的影響較小。

2.2.4 最佳工藝驗證試驗

運用Design-Expert8.0.6軟件，分析響應(yīng)面試驗結(jié)果，得到蛋白提取的最佳工藝參數(shù)為pH 12.15，提取溫度61.5 ℃，料液比1∶39.5 (g∶mL)，提取時間2.08 h，預(yù)測蛋白提取率為43.51%。在實際操作過程中，將最佳工藝參數(shù)控制為pH 12.1，提取溫度61 ℃，料液比1∶40 (g∶mL)，提取時間2 h，重復(fù)3次驗證試驗，得到的蛋白提取率為(43.19±0.22)%，與模型預(yù)測值的相對偏差僅為0.74%，說明該模型能夠較好地預(yù)測白玉菇蛋白提取率。

2.3 白玉菇蛋白等電點

如圖6所示，當(dāng)pH為4.2時，上清液吸光值最低，說明此時蛋白沉淀最多，這是因為當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液pH處于等電點時，蛋白質(zhì)分子表面不帶電荷呈電中性，分子間的斥力減弱，容易受靜電引力影響聚集而產(chǎn)生沉淀[17]，所以pH 4.2為白玉菇蛋白的等電點。

圖6 白玉菇蛋白等電點Fig.6 White Hypsizygus marmoreu protein isoelectric point

2.4 白玉菇蛋白的功能特性

2.4.1 pH對白玉菇蛋白溶解性的影響

蛋白溶解度是指蛋白溶解于水溶液或鹽溶液的能力，是蛋白能夠在食品加工業(yè)應(yīng)用的一個重要因素，利用蛋白的溶解性，可以提高飲料的口感、風(fēng)味和營養(yǎng)價值[18]。如圖7所示，隨著pH逐漸增大，蛋白的溶解度呈先降低后升高的趨勢，當(dāng)pH為4接近pI時，此時蛋白的溶解度最小，僅為4.38%；當(dāng)pH偏離pI后，蛋白溶解度增大，這可能是因為偏離pI后，溶液中分子間作用力增強，凝聚力減小，有利于溶解；pH接近pI時，蛋白質(zhì)分子容易受靜電作用力影響聚集產(chǎn)生沉淀，溶解度減小。

圖7 pH對白玉菇蛋白溶解性的影響Fig.7 Effect of pH on protein solubility of white Hypsizygus marmoreu protein

2.4.2 pH對白玉菇蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

蛋白質(zhì)可作為一種表面活性劑，降低水的表面能，使油和水互溶形成乳化液，這是蛋白質(zhì)的乳化性；乳化穩(wěn)定性指的是乳化液保持穩(wěn)定且不出現(xiàn)明顯的兩項分層的能力[19]。

圖8 pH對白玉菇蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of pH on emulsifying and emulsifying stability of white Hypsizygus marmoreu protein

如圖8所示，隨著pH逐漸增大，蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性都呈先減小后增大的趨勢，當(dāng)pH為4接近pI時，此時蛋白的乳化性最小，僅為46.77%，乳化穩(wěn)定性也最小，為82.76%；但當(dāng)pH偏離pI后，蛋白質(zhì)的乳化性和乳化穩(wěn)定性都有所增加，其中乳化性在堿性環(huán)境下表現(xiàn)更好，而乳化穩(wěn)定性差別不大。這可能是pH接近等電點時，蛋白質(zhì)分子間靜電作用力減弱，分子表面無法形成水化層且容易聚集產(chǎn)生沉淀，使其乳化性和乳化穩(wěn)定性均減弱；當(dāng)pH偏離pI，蛋白溶解度增大，分子間作用力增加，使其乳化能力增強，且在pH顯堿性時，蛋白質(zhì)分子與水分子的結(jié)合能力增強，蛋白的乳化性更高。

2.4.3 pH對白玉菇蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響

蛋白質(zhì)降低了水的表面張力，推動了空氣與水結(jié)合形成氣泡，這就是蛋白的起泡性；泡沫穩(wěn)定性是指保持泡沫穩(wěn)定使得氣-液間液膜中液體不被析出的能力[20]。蛋白質(zhì)的起泡性常用于蛋糕、冰激凌等食品的加工中，較好的起泡能力賦于食品良好的口感和蓬松的結(jié)構(gòu)[21]。

圖9 pH對白玉菇蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of pH on foaming and foam stability of white Hypsizygus marmoreu protein

如圖9所示，隨著pH逐漸增大，蛋白的起泡性呈先減小后增大的趨勢，而蛋白的泡沫穩(wěn)定性卻相反，呈先增大后較小的趨勢。當(dāng)pH為4接近pI時，蛋白的起泡性最小，為33%，而此時泡沫的穩(wěn)定性最高，為69.23%；當(dāng)pH偏離pI時，蛋白的起泡性都有所增大，且在堿性時起泡性更高，而偏離pI后蛋白的泡沫穩(wěn)定性都有所減弱。這可能是因為當(dāng)pH接近pI時，蛋白質(zhì)溶出較多，參與水溶液形成氣泡的蛋白質(zhì)較少，所以起泡性較弱，且在攪打過程中沉淀的蛋白質(zhì)顆粒通過靜電作用與泡沫結(jié)合，增加了泡沫的厚度，從而增加了泡沫的穩(wěn)定性。

2.4.4 白玉菇蛋白的持水性和持油性

蛋白的持水性是指蛋白與水相結(jié)合的能力，與食品加工完成后的儲藏有關(guān)，好的持水性有利于產(chǎn)品外形的穩(wěn)定[21]。蛋白的持油性是指蛋白吸附油脂的能力，常用于肉制品的生產(chǎn)加工中，蛋白吸附油脂能夠防止產(chǎn)品滲油，保持產(chǎn)品良好的口感[22]。經(jīng)過試驗測定，白玉菇蛋白的持水力為4.10 g/g，持油力為4.38 g/g。

2.5 白玉菇蛋白氨基酸組成分析

由于制樣過程采用酸水解，所以白玉菇蛋白中色氨酸未能檢測，其余氨基酸測定結(jié)果見表4。

表4 白玉菇蛋白的氨基酸組成及含量Table 4 Amino acid content of white Hypsizygus marmoreu protein

注：a，必需氨基酸；氨基酸評分(AAS)=[樣品蛋白質(zhì)氨基酸含量(%)∕WHO/FAO標準模式相應(yīng)氨基酸含量(%)]×100

由表4可知，白玉菇蛋白氨基酸種類齊全，富含17種氨基酸，其中含量最高的兩種氨基酸為谷氨酸和天冬氨酸，分別為14.14%和10.43%，2種氨基酸都屬于鮮味氨基酸[23]，這與白玉菇鮮美的風(fēng)味相符合。白玉菇蛋白中必需氨基酸占氨基酸總量的38.12%，接近FAO/WHO提出的理想蛋白質(zhì)必需氨基酸/總氨基酸應(yīng)達40%的要求[24]，說明白玉菇蛋白較為優(yōu)質(zhì)。從氨基酸評分看，蛋氨酸為白玉菇蛋白的第一限制性氨基酸，與王耀松等[4]測定結(jié)果一致，食品生產(chǎn)中可通過與其他蛋白質(zhì)搭配使用，以達到互補效果。綜合分析，白玉菇蛋白是一種優(yōu)良的植物蛋白源，而且豐富的鮮味氨基酸使其具有開發(fā)復(fù)合調(diào)味料的潛力。

3 結(jié)論

本實驗采用堿法提取白玉菇蛋白，并通過響應(yīng)面優(yōu)化得到白玉菇蛋白最適提取工藝，同時研究了不同pH值對白玉菇蛋白功能特性的影響，得出以下結(jié)論：

(1)堿提法中各因素影響白玉菇蛋白提取率的主次順序為pH>提取溫度>提取時間>料液比；白玉菇蛋白堿提的最佳提取工藝為pH 12.1，提取溫度61 ℃，料液比1∶40 (g∶mL)，提取時間2 h，此件下的白玉菇蛋白提取率為(43.19±0.22)%，與預(yù)測值接近，說明響應(yīng)面法能夠有效分析和預(yù)測白玉菇蛋白提取率。

(2)pH值對白玉菇蛋白的功能特性有顯著影響，當(dāng)溶液pH在白玉菇蛋白pI附近時，蛋白的溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性及起泡性均為最小，而此時白玉菇蛋白的泡沫穩(wěn)定性最大，偏離等電點后除泡沫穩(wěn)定性有所下降外，其余各項指標都有所回升。

(3)白玉菇蛋白氨基酸種類齊全，鮮味氨基酸含量豐富，必需氨基酸占氨基酸總量的38.12%，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白，蛋氨酸為其第一限制性氨基酸。