覃雅慶 沈慧娟 農(nóng)冬梅 周華 康娜

[摘要]目的：探討牙周炎中牙齦卟啉單胞菌LPS（Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharide，Pg.LPS）和人牙周膜成纖維細(xì)胞（human periodontal ligament fibroblast， HPDLF）與正畸炎癥相關(guān)的牙根吸收作用機(jī)制。方法：取4～6代體外培養(yǎng)的HPDLF，MTT法檢測(cè)1～10μg/ml Pg.LPS對(duì)HPDLF增殖活性的影響，再選擇最佳濃度作用于HPDLF，加載0～5g/cm2靜壓力24h，實(shí)驗(yàn)組分為靜壓力組和Pg.LPS+靜壓力組，通過(guò)qRT-PCR和ELISA檢測(cè)HPDLF白細(xì)胞介素17（interleukin 17，IL-17）及白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：①HPDLF增殖在1～4μg/ml Pg.LPS刺激時(shí)隨濃度增加而增加，在5～7μg/ml隨濃度增加而減少，8～10μg/ml細(xì)胞增殖明顯受到抑制;②兩組中IL-17、IL-6的表達(dá)量隨靜壓力值增加而增強(qiáng)，相同力值下對(duì)照組的IL-17、IL-6表達(dá)量高于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：Pg.LPS濃度過(guò)高能抑制HPDLF增殖，而適當(dāng)?shù)臐舛葎t促進(jìn)其增殖;Pg.LPS和靜壓力均能刺激HPDLF產(chǎn)生炎癥相關(guān)因子，參與正畸炎癥相關(guān)牙根吸收發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。

[關(guān)鍵詞]人牙周膜成纖維細(xì)胞;白細(xì)胞介素17;白細(xì)胞介素6;牙齦卟啉單胞菌;脂多糖;靜壓力

[中圖分類號(hào)]R782.2 ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A ? ?[文章編號(hào)]1008-6455（2020）01-0079-05

Effects of Lipopolysaccharides on the Expression of Proinflammatory Factors in Periodontal Fibroblasts Stimulated by Lipopolysaccharides under

Different Static Pressure

QIN Ya-qing，SHEN Hui-jun，NONG Dong-mei，ZHOU Hua，KANG Na

（Department of Orthodontics， Affiliated Stomatological Hospital of Guangxi Medical University Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Rehabilitation and Reconstruction ?Guangxi Clinical Research Center for Craniofacial Deformity ?Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Surgery Disease Treatment，

Nanning 530021，Guangxi，China）

Abstract： Objective To investigate the mechanism of Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharide （Pg.LPS） and human periodontal fibroblast （HPDLF） in orthodontic inflammatory-related root resorption in periodontitis. Methods ?The HPDLF cultured in vitro for 4-6 generations was used to detect the effect of 1-10 μg/ml Pg.LPS on the proliferation of HPDLF by MTT assay. Then choose the optimal concentration stimulate HPDLF and load 0-5 g/cm2 static pressure strength for 24 hours. The experimental group was divided into static pressure group and Pg. LPS + static pressure group. QRT-PCR and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） were used to detect the mRNA and protein expression levels of interleukin-17 and interleukin-6 in HPDLF. Results ①HPDLF proliferation increased with the increase of concentration in 1-4 μg/ml Pg.LPS stimulation， decreased with the increase of concentration in 5-7 μg/ml， and was significantly inhibited cell proliferation in 8-10 μg/ml.② The expressions of interleukin 17 and interleukin 6 in the static pressure group and Pg.LPS + static pressure group increased with the increase of static pressure value， and the expressions of interleukin 17 and interleukin 6 in the static pressure group were higher than those in Pg.LPS + static pressure group under the same force value， and the difference was statistically significant. Conclusion ?Excessive concentration of Pg. LPS inhibited the proliferation of HPDLF， and the appropriate concentration could promote the proliferation of HPDLF. Both Pg. LPS and static pressure can stimulate HPDLF to produce pro-inflammatory factors and participate in the development of orthodontic inflammatory-related root resorption， but Pg. LPS inhibits the secretion of pro-inflammatory factors by static pressure on HPDLF.

Key words： human periodontal ligament fibroblast; interleukin 17; interleukin 6; porphyromonas gingivalis; lipopolysaccharide; static pressure

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）是引起慢性牙周炎的主要病原體，而LPS（Lipopolysaccharide，LPS）是其細(xì)胞壁外層的重要組成部分，可誘導(dǎo)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子如IL-6的表達(dá)以及參與牙周組織的破壞[1]。IL-6被認(rèn)為是經(jīng)典的骨吸收促炎細(xì)胞因子，它不僅可以通過(guò)接觸破骨前體細(xì)胞刺激破骨細(xì)胞的形成，還可以通過(guò)上調(diào)成骨細(xì)胞譜系表達(dá)核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）來(lái)刺激破骨細(xì)胞的形成[2]。IL-17是一種主要由活化的輔助性T細(xì)胞17（TH17）產(chǎn)生的致炎細(xì)胞因子，也是參與破骨細(xì)胞產(chǎn)生的主要分子之一，可增強(qiáng)牙周膜成纖維細(xì)胞RANKL的表達(dá)以破壞骨組織。它還通過(guò)誘導(dǎo)牙周炎患者的成纖維細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，介導(dǎo)牙周組織的破壞，相較于牙周健康者而言牙周炎患者可檢測(cè)到更高水平的IL-17[3-6]。

人牙周膜成纖維細(xì)胞作為牙周膜的重要功能細(xì)胞，調(diào)節(jié)牙周組織穩(wěn)態(tài)，形成膠原結(jié)構(gòu)蛋白，發(fā)揮天然免疫防御的調(diào)節(jié)功能，對(duì)正畸牙移動(dòng)（orthodontic tooth movement，OTM）也起到了重要的中介作用[7]。在對(duì)牙齒施加正畸力后，HPDLF受到壓縮或拉伸的機(jī)械應(yīng)力，通過(guò)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)使細(xì)胞因子和趨化因子的合成增加，特別是前列腺素和白三烯由于誘導(dǎo)的環(huán)氧合酶2（COX2）的活性增加而釋放，其對(duì)HPDLF和成骨細(xì)胞具有自分泌和旁分泌作用，增加可溶性和膜連接的RANKL以及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子如IL-1、IL-6的表達(dá)，這些因子又反過(guò)來(lái)繼續(xù)增強(qiáng)RANKL的表達(dá)和加快基質(zhì)金屬蛋白酶的釋放，影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而誘導(dǎo)OTM[8]。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)證明，在靜壓力下IL-17在HPDLF中主要通過(guò)兩條途徑誘導(dǎo)RANKL產(chǎn)生從而導(dǎo)致破骨細(xì)胞的分化及成熟：一是HPDLF在靜壓力下生成IL-17及其他炎癥相關(guān)因子和IL-17R相連接，直接作用使HPDLF調(diào)節(jié)IL-6、RANKL和其他因子;二是IL-17與IL-17R相連接，刺激HPDLF大量產(chǎn)生IL-6，通過(guò)IL-6這條旁路進(jìn)一步調(diào)節(jié)RANKL等炎癥相關(guān)因子的表達(dá)。往期研究并未完全闡明牙周炎中IL-17的作用機(jī)制，LPS對(duì)HPDLF的作用尚未完全清楚。在正畸力下，促炎細(xì)胞因子與牙周組織骨改建之間的關(guān)系更是鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立體外模擬正畸壓力模型，用LPS模擬牙周炎癥環(huán)境，檢測(cè)不同靜壓力下HPDLF中IL-6、IL-17的表達(dá)水平，探索各因子間的相互作用關(guān)系，為臨床上牙周炎患者在正畸治療過(guò)程中預(yù)防牙根吸收和牙槽骨退縮提供新思路。

1 ?材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象：本實(shí)驗(yàn)所需組織取自筆者醫(yī)院頜面外科門診11～16歲患者因正畸需要而拔除的20顆健康前磨牙（無(wú)牙體牙髓、牙周疾病），均取得患者知情同意，并通過(guò)了倫理委員會(huì)同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料：維森特胎牛血清（澳洲血源）、DMEM培養(yǎng)基，Pg.LPS（Invivogen公司），MTT溶液（vazyme公司），DMSO溶液（Sigma公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、IL-6、IL-17、TNF-α、GAPDH上下游引物（TaKaRa公司），IL-6、IL-17 ELISAkit（武漢華美生物工程有限公司）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HPDLF的培養(yǎng)：用無(wú)菌刀片刮下根中1/3的牙周膜組織，采用組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)細(xì)胞，待HPDLF從組織塊爬出并覆蓋瓶底80%時(shí)傳代培養(yǎng)。取4～6代HPDLF用做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 Pg.LPS刺激下對(duì)HPDLF增殖活性的影響：將4～6代HPDLF制成單細(xì)胞懸液接種于96孔板，滴加配成10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分10組，LPS濃度按1～10 μg/ml逐漸遞增，設(shè)置空白孔（無(wú)細(xì)胞）和對(duì)照孔（無(wú)LPS，有細(xì)胞），置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱孵育24h。采用MTT比色法檢測(cè)吸光值，觀察不同濃度的LPS對(duì)HPDLF的細(xì)胞增殖活性的影響，選取最適宜濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 不同靜壓力下Pg.LPS刺激HPDLF：取4～6代HPDLF制成細(xì)胞懸液，以2ml/皿均勻接種，在CO2溫箱中孵育。次日換液，每孔加入2ml配成10% FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育。2～3d后待HPDLF鋪滿皿底行Pg.LPS刺激與加力處理。用PBS液沖洗2次，每孔滴加1ml配成1% FBS的DMEM培養(yǎng)液沉淀1h，加入4μg/ml Pg.LPS，使用加力附件與圓形蓋玻片放于單層HPDLF上，這時(shí)細(xì)胞的受力分別為0、1、2、3、4、5g/cm2，然后再置入CO2孵箱中孵育24h。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)：收集干預(yù)后的HPDLF，提取總RNA，將其作為模版逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBRGreenI染料法進(jìn)行qRT-PCR，檢測(cè)不同靜壓力作用下，IL-6、IL-17在HPDLF中的mRNA表達(dá)水平。同時(shí)收集上清液，ELISA檢測(cè)不同壓力作用下，LPS刺激HPDLF分泌的IL-6、IL-17的蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x?±s表示，運(yùn)用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)，兩組比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，三組間比較采用單因素方差分析，α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 Pg.LPS刺激下對(duì)HPDLF增殖活性的影響：Pg.LPS刺激24h后，MTT結(jié)果示1～4μg/ml時(shí)OD值持續(xù)升高，HPDLF的增殖能力較對(duì)照組增強(qiáng)，4μg/ml到達(dá)高峰，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），5～7μg/ml中HPDLF細(xì)胞活力逐漸下降，隨著濃度的進(jìn)一步增大，HPDLF細(xì)胞活力受到抑制，8～10μg/ml組中HPDLF細(xì)胞活力明顯被抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。MTT檢測(cè)結(jié)果可得出，適宜濃度的Pg.LPS對(duì)HPDLF增殖活性有促進(jìn)作用，但濃度過(guò)高則抑制其活性。

2.2 不同靜壓力下Pg.LPS刺激HPDLF IL-6和IL-17 mRNA的表達(dá)水平：qRT-PCR檢測(cè)IL-6、IL-17 mRNA的表達(dá)水平顯示，靜壓力組中，1～5g/cm2組的IL-6、IL-17的mRNA表達(dá)水平相較于空白對(duì)照組顯著升高（P<0.01），IL-6、IL-17的mRNA表達(dá)量隨力的大小增加而增加，4g/cm2達(dá)到最大，隨后開始下降。而經(jīng)4μg/ml Pg.LPS刺激HPDLF 24h后，在Pg.LPS+靜壓力組內(nèi)，1～5g/cm2組中的IL-6、IL-17的mRNA表達(dá)水平相較于Pg.LPS未加力對(duì)照組顯著升高（P<0.01），IL-6、IL-17的mRNA表達(dá)量隨力的大小增加而增加，3g/cm2達(dá)到最大，隨后開始下降。在相同力值下，Pg.LPS+靜壓力組中IL-6、IL-17 mRNA表達(dá)水平與靜壓力組相比較顯著降低（P<0.05）（見(jiàn)表2～3、圖2～3）。

2.3 不同靜壓力下Pg.LPS刺激HPDLF時(shí)IL-6和IL-17蛋白的表達(dá)水平：通過(guò)ELISA檢測(cè)IL-6和IL-17的蛋白表達(dá)水平，靜壓力組中，1～5g/cm2組的IL-6和IL-17的蛋白表達(dá)水平相較于空白對(duì)照組顯著升高（P<0.01），IL-6和IL-17的蛋白表達(dá)量隨力的大小增加而增加，4g/cm2達(dá)到最大，隨后開始下降。而經(jīng)4μg/ml Pg.LPS刺激HPDLF 24h后，在Pg.LPS+靜壓力組內(nèi)，1～5g/cm2組中IL-6和IL-17的蛋白表達(dá)水平相較于Pg.LPS未加力對(duì)照組顯著升高（P<0.01），IL-6和IL-17的蛋白表達(dá)量隨力的大小增加而增加，3g/cm2達(dá)到最大，隨后開始下降。

在相同力值下，Pg.LPS+靜壓力組相對(duì)于靜壓力組的IL-6蛋白表達(dá)水平降低，4g/cm2組中的差異具有顯著性;而IL-17的蛋白表達(dá)水平降低，在0～5g/cm2組的差異均具有顯著性（P<0.05）（見(jiàn)表4～5、圖4～5）。

3 ? 討論

正畸治療對(duì)牙齒應(yīng)用機(jī)械力使牙周膜和牙槽骨重塑，從而轉(zhuǎn)變?yōu)镺TM，機(jī)械力被轉(zhuǎn)換為負(fù)責(zé)基因轉(zhuǎn)錄物變化的生物信號(hào)，這些信號(hào)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)有不同的影響[9]。有研究證實(shí)，在機(jī)械力誘導(dǎo)下牙周組織及炎性細(xì)胞通過(guò)Wnt/β-catenin pathway、MAPKs pathway等多種傳導(dǎo)途徑來(lái)釋放IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥相關(guān)因子誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表達(dá)RANKL，在巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M -CSF）存在的前提下與核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）結(jié)合，啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，上調(diào)RANKL及下調(diào)骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）來(lái)促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和成熟，形成骨吸收[7-8，10]。

對(duì)于不同濃度LPS對(duì)HPDLF的增殖活性影響測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)采用了MTT比色法，結(jié)果提示：LPS可影響HPDLF的增殖活性，低濃度時(shí)其增殖加快，若作用時(shí)間長(zhǎng)時(shí)則會(huì)表現(xiàn)毒性作用，抑制其生長(zhǎng);高濃度LPS對(duì)細(xì)胞有毒性作用，可抑制增殖，且刺激時(shí)間越久抑制率越高。低濃度LPS可促進(jìn)HPDLF的增殖。一是直接作用，可能因LPS影響細(xì)胞內(nèi)外Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[11]，也可能是由于LPS激活了細(xì)胞內(nèi)ephrin/Eph等信號(hào)通路而促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)[12];二是間接作用，LPS通過(guò)刺激細(xì)胞產(chǎn)生生物活性因子而刺激細(xì)胞增殖。但隨作用時(shí)間的增加，細(xì)胞耐受性下降，細(xì)胞過(guò)度成熟，產(chǎn)能減少，胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶等多種酶分泌增加，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，然后表現(xiàn)為細(xì)胞的毒性作用[13]。高濃度LPS抑制細(xì)胞增殖可能與細(xì)胞釋放的CTOkins或介質(zhì)有關(guān)[14]。

先前實(shí)驗(yàn)中靜壓力作用下HPDLF能產(chǎn)生IL-17及其余炎癥相關(guān)因子，本實(shí)驗(yàn)靜壓力組證明其最佳力值為4g/cm2，此時(shí)各炎癥相關(guān)因子最易分泌。Pg.LPS+靜壓力組與對(duì)照組或空白組分泌量相比差異均有顯著性。然而相同力值下與靜壓力組比較，各炎癥相關(guān)因子分泌水平均降低，和之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同：患有牙周炎的大鼠注射LPS后，IL-17、IL-6等分泌水平高于正畸加力組[15-16]。分析該結(jié)果的可能原因是：一是由于該實(shí)驗(yàn)不同于先前細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的LPS濃度，低濃度下未引起炎癥反應(yīng)，因此，低濃度LPS可能抑制HPDLF的炎癥相關(guān)因子分泌;二是作用時(shí)間不夠，LPS尚未發(fā)揮作用。值得注意的是，在Pg.LPS+靜壓力組中，最適靜壓力值降低，說(shuō)明在Pg.LPS作用下HPDLF能承受的力值有所降低，這類似于臨床上對(duì)牙周炎患者的正畸治療中進(jìn)行輕度和持續(xù)的正畸治療的需要。

本實(shí)驗(yàn)探究了Pg.LPS與靜壓力聯(lián)合作用于HPDLF產(chǎn)生的IL-17、IL-6的表達(dá)水平和影響，這從一種獨(dú)創(chuàng)性角度來(lái)了解骨改建和骨吸收的機(jī)理和機(jī)制。然而，由于該實(shí)驗(yàn)未在不同時(shí)間點(diǎn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)對(duì)照，未從時(shí)間方面來(lái)考慮，所以該實(shí)驗(yàn)設(shè)置24h或許并非Pg.LPS刺激HPDLF最適時(shí)間，后期實(shí)驗(yàn)中應(yīng)調(diào)整以不同濃度LPS作用不同時(shí)間點(diǎn)，以期得到更全面的結(jié)果，IL-17和其他炎癥相關(guān)因子的機(jī)理和機(jī)制研究仍需進(jìn)一步探索。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Hayata M，Watanabe N，Kamio N，et al.Cynaropicrin from Cynara scolymus L.suppresses Porphyromonas gingivalis LPS-induced production of inflammatory cytokines in human gingival fibroblasts and RANKL-induced osteoclast differentiation in RAW264.7 cells[J].J Nat Med，2019，73（1）：114-123.

[2]Wu Q，Zhou X，Huang D，et al.IL-6 enhances osteocyte-mediated osteoclastogenesis by promoting jak2 and rankl activity in vitro[J].Cell Physiol Biochem，2017，41（4）：1360-1369.

[3]Wang ZX，Yang L，Tan JY，et al.Effects of T helper 1 cells and T helper 17 cells secreting cytokines on rat models of experimental periodontitis[J].Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi，2017，52（12）：740-747.

[4]Chen XT，Tan JY，Lei LH，et al.Cytokine levels in plasma and gingival crevicular fluid in chronic periodontitis[J].Am J Dent，2015，28（1）：9-12.

[5]Kim HR，Kim KW，Kim BM，et al.N-acetyl-l-cysteine controls osteoclastogenesis through regulating Th17 differentiation and RANKL in rheumatoid arthritis[J].Korean J Intern Med，2019，34（1）：210-219.

[6]黃瑩，馬哲.IL-17與牙周炎和冠心病相關(guān)性綜述[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志，2018，32（4）：237-241.

[7]Schroder A，Bauer K，Spanier G，et al.Expression kinetics of human periodontal ligament fibroblasts in the early phases of orthodontic tooth movement[J].J Orofac Orthop，2018，79（5）：337-351.

[8]Meikle MC.The tissue，cellular，and molecular regulation of orthodontic tooth movement：100 years after Carl Sandstedt[J].Eur J Orthod，2006， 28（3）：221-240.

[9]Fleissig O，Reichenberg E，Tal M，et al.Morphologic and gene expression analysis of periodontal ligament fibroblasts subjected to pressure[J].Am J Orthod Dentofacial Orthop，2018，154（5）：664-676.

[10]Padisar P，Hashemi R，Naseh M，et al.Assessment of tumor necrosis factor alpha （TNFalpha） and interleukin 6 level in gingival crevicular fluid during orthodontic tooth movement：a randomized split-mouth clinical trial[J]. Electron Physician，2018，10（8）：7146-7154.

[11]Azenabor AA，Kennedy P，York J.Free intracellular Ca2+ regulates bacterial lipopolysaccharide induction of iNOS in human macrophages[J].Immunobiology， 2009，214（2）：143-152.

[12]Li M，Zhang C，Jin L，et al.Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide regulates ephrin/Eph signalling in human periodontal ligament fibroblasts[J].J Periodontal Res，2017，52（5）：913-921.

[13]Zhou J，Windsor LJ.Heterogeneity in the collagen-degrading ability of Porphyromonas gingivalis-stimulated human gingival fibroblasts[J].J Periodontal Res，2007，42（1）：77-84.

[14]Lertchirakarn V，Aguilar P.Effects of lipopolysaccharide on the proliferation and osteogenic differentiation of stem cells from the apical papilla[J].J Endod，2017，43（11）：1835-1840.

[15]陳莉，李小彤，范曉川，等.正畸力誘導(dǎo)下白介素17在大鼠不同狀態(tài)牙周組織中的表達(dá)[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2015，50（10）：619-623.

[16]米叢波，潘旭，錢雅婧，等.正畸力作用下炎性牙周組織中白介素-8的表達(dá)[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2011，20（7）：1134-1138.

[收稿日期]2019-03-28

本文引用格式：覃雅慶，沈慧娟，農(nóng)冬梅，等.不同靜壓力下脂多糖刺激牙周膜成纖維細(xì)胞對(duì)炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2020，29（1）：79-83.