安雪姣 潘章源 趙生國 李春艷 田志龍 狄 冉 劉秋月 胡文萍 王翔宇 張效生 張金龍 蔡 原* 儲明星*

(1.中國農業(yè)科學院 北京畜牧獸醫(yī)研究所/農業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193； 2.甘肅農業(yè)大學 動物科學技術學院，蘭州 730070；3.臨沂大學 農林科學學院，山東 臨沂 276005；4.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381)

動物的季節(jié)性繁殖是由內分泌系統(tǒng)和中樞神經系統(tǒng)調控的復雜生理過程, 主要依靠下丘腦—垂體—性腺軸(HPG)的相互調節(jié)來實現(xiàn)[1]。研究發(fā)現(xiàn)編碼RFamide家族神經肽類的基因KiSS-1與RFRP-3可能是動物季節(jié)性繁殖活動的重要調控因子。KiSS-1基因是Lee等[2]從人黑色素瘤細胞中分離得到，其翻譯產物Kisspeptin是由145個氨基酸組成的親水性蛋白，具有分泌神經肽的特點[3]；KiSS-1/GPR54 系統(tǒng)對哺乳動物的繁殖起中樞調控作用，它通過調節(jié)下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)的釋放，來影響促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)的分泌[4-5]。Kisspeptin通過下丘腦通路激活GnRH 神經元來促進促性腺激素的分泌[6]，也可誘導體外培養(yǎng)的大鼠下丘腦中GnRH 的釋放[7]。Kisspeptin直接作用于下丘腦—垂體—性腺軸，能促進GnRH 釋放和LH含量上升，從而調控綿羊的季節(jié)性繁殖[8-9]。RFRP是在2000年從鵪鶉大腦中提取出來的可抑制垂體GnRH分泌的十二肽，并命名為促性腺激素抑制激素(GnIH)[10]。在哺乳動物中RFRP基因由2 條編碼生物活性的短肽RF酰胺相關肽-1(RFRP-1)和RF酰胺相關肽-3 (RFRP-3)，其中，RFRP-3 對生殖系統(tǒng)的調控有抑制作用[11]。小鼠的RFRP-3細胞纖維體與大部分GnRH 細胞直接接觸,對GnRH神經元有直接的抑制作用[12-13]。在哺乳動物中, RFRP-3也能抑制LH的合成與分泌。雖然KiSS-1和RFRP-3都是RFamide家族神經肽，但它們在動物季節(jié)性發(fā)情中的作用卻相反，并且相互協(xié)調共同控制動物的季節(jié)性繁殖活動[14]。目前，對于不同繁殖狀態(tài)下小尾寒羊下丘腦—垂體—卵巢生殖軸上各組織表達規(guī)律的研究很少。本研究以常年發(fā)情的小尾寒羊為研究對象，分別采集其卵泡期和黃體期生殖軸上的10 種組織，用熒光定量PCR方法檢測KiSS-1和RFRP-3在不同繁殖狀態(tài)下小尾寒羊不同組織中的表達差異，初步分析這2個基因在小尾寒羊發(fā)情狀態(tài)轉換中的作用，有助于進一步揭示綿羊季節(jié)性發(fā)情分子調控機制。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品及主要試劑

隨機選擇來自山東鄆城的身體健康、營養(yǎng)狀況良好、體重一致的2～3歲經產空懷小尾寒羊母羊6只， 飼養(yǎng)于天津市畜牧獸醫(yī)研究所試驗羊場，保證所有羊只的飼養(yǎng)管理方式、飼料配方和環(huán)境一致。放置孕酮陰道栓(CIDR)并注射5～6 mL維生素AD以保護陰道內膜。放栓12 d后撤栓，撤栓當天記為1 d， 撤栓時刻記為0 h。撤栓后用腹腔鏡觀察卵泡發(fā)育和排卵情況來確定卵泡期采樣時間，用公羊試情確定母羊發(fā)情狀態(tài)及時間。連續(xù)試驗2個情期后在撤栓后45 h(卵泡期)和10 d(黃體期)進行屠宰，每個時期各3只，屠宰后迅速采集下丘腦、垂體、松果體、大腦、小腦、卵巢、子宮、輸卵管、腎臟、腎上腺共10種組織。分別裝入2 mL的RNase-Free凍存管中，并立即放入液氮中，帶回實驗室轉移到-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

動物組織總RNA提取試劑盒(天根生化有限公司，北京)，反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit，TaKaRa公司，大連)，熒光定量染料(SYBR?Premix ExTaqTMⅡ，TaKaRa公司，大連)，EP管、96孔板、槍頭等耗材均為RNase-Free產品。

1.2 總RNA提取

利用Trizol(Invitrogen，美國)和動物組織總RNA提取試劑盒(天根，北京)提取各組織總RNA。用NanoDrop2000檢測所提取RNA的濃度和OD值(A260/A280為1.8～2.1)，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，檢測合格后暫存于-80 ℃冰箱。

1.3 定量引物設計

根據(jù)GenBank公布的綿羊KiSS-1和RFRP-3基因mRNA序列(登錄號分別為：NM_001306104.1和NM_001127268.1)，利用Primer Premier 5.0軟件進行跨外顯子引物設計，以β-actin(登錄號：NM_001009784)為內參基因。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。引物具體信息見表1。

表1 熒光定量引物信息Table1 Information of primers for Real-time PCR

1.4 cDNA合成

使用反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)反轉錄合成cDNA，反應總體積為20 μL。反應條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。全程在冰上操作。反轉錄產物進行5倍稀釋后，用內參基因β-actin進行PCR檢測，符合標準后-20 ℃保存。

1.5 實時熒光定量PCR

1.5.1標準曲線建立

取每個組織的cDNA樣品2 μL混勻，按1∶2濃度梯度稀釋，分別獲得8個濃度梯度(1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128)的cDNA樣品。用這些cDNA作為模板對目的基因和內參基因進行熒光定量PCR，以濃度梯度的對數(shù)值(10為底數(shù))為橫坐標，以檢測所得Ct值為縱坐標，繪制目的基因和內參基因標準曲線，確保引物擴增效率為95%～105%。

1.5.2實時熒光定量PCR體系和程序

利用羅氏480Ⅱ型熒光定量PCR儀檢測不同時期小尾寒羊在繁殖相關組織中KiSS-1和RFRP-3基因的表達，β-actin作為內參基因，每個樣品做3個重復。反應體系總體積為20.0 μL，其中SYBR Premix ExTaqⅡ 2.0 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2.0 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL。qPCR程序：95 ℃預變性5 s，95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s，45個循環(huán)。

1.5.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用2-ΔΔCt法[15, 16]計算目的基因的相對表達量，用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0進行單因素方差分析， 最終結果用平均值±標準誤(X±SEM)來表示。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取及cDNA合成

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，發(fā)現(xiàn)RNA電泳條帶明亮清晰、完整、無拖尾(圖1)。用Nanodrop 2000檢測各組織RNA的提取結果，發(fā)現(xiàn)濃度均在100 mg/μL以上，A260/A280均為1.80～2.10。 經反轉錄合成的cDNA通過β-actin內參基因檢測后發(fā)現(xiàn)，產物干凈單一，表明RNA沒有基因組DNA污染(圖2)。說明提取的RNA和反轉錄后的cDNA可用于后續(xù)的熒光定量PCR反應。

2.2 KiSS-1和RFRP-3在不同時期小尾寒羊各組織中的表達

使用熒光定量PCR技術對卵泡期和黃體期的小尾寒羊10 種組織KiSS-1和RFRP-3基因的表達水平進行了研究，結果見圖3和圖4。

KiSS-1基因在2個時期小尾寒羊的10種組織均有一定表達，但在卵泡期子宮中的表達量很低。黃體期和卵泡期下丘腦KiSS-1基因表達量顯著高于其他組織(P< 0.05)；卵泡期下丘腦和松 果體KiSS-1基因表達量顯著高于黃體期(P<0.05)。

RFRP-3基因在2個時期小尾寒羊的10種組織中均有一定表達，但在黃體期子宮及卵泡期垂體和松果體中表達量很低。黃體期和卵泡期下丘腦和卵巢RFRP-3基因的表達量顯著高于其他組織(P<0.05)；卵泡期RFRP-3基因在下丘腦和卵巢之間表達差異顯著(P<0.05)；黃體期卵巢RFRP-3基因表達量顯著高于卵泡期(P<0.05)。

1～8：大腦、小腦、下丘腦、垂體、松果體、子宮、卵巢和輸卵管。M：DL2000 DNA分子標記。1-8，brain, cerebellum, hypothalamus, pituitary, pineal body, uterus, ovary and oviduct. M，DL2000 DNA Marker.圖1 小尾寒羊 RNA電泳檢測Fig.1 Electrophoresis of the RNA in Small Tail Han sheep

1～10：大腦、小腦、下丘腦、垂體、松果體、子宮、卵巢、輸卵管、腎臟和腎上腺。M：DL2000 DNA分子標記。1-10：Brain, cerebellum, hypothalamus, pituitary, pineal body, uterus, ovary, oviduct, kidney and adrenal gland. M：DL2000 DNA Marker.圖2 小尾寒羊10種組織中β-actin持家基因RT-PCR擴增產物Fig.2 RT-PCR amplification products of housekeeping gene β-actin in Small Tail Han sheep 10 different tissues

*表示差異顯著(P<0.05)，下同。* represents significant difference at P<0.05. The same below.圖3 KiSS-1基因在小尾寒羊不同時期各組織中的表達Fig.3 Expression of KiSS-1 gene in Small Tail Han sheep at different periods

圖4 RFRP-3基因在小尾寒羊不同時期各組織中的表達Fig.4 Expression of RFRP-3 gene in Small Tail Han sheep at different periods

3 討 論

3.1 KiSS-1基因表達

KiSS-1基因在動物季節(jié)性發(fā)情調控中起著關鍵的作用，在阿勒泰羊下丘腦、垂體、卵巢和甲狀腺等組織中均檢測到了KiSS-1基因的表達，其中下丘腦的表達量最高[17]。在濟寧青山羊和遼寧絨山羊下丘腦、垂體、松果體、腎、卵巢、脂肪和甲狀腺等組織中均檢測到了KiSS-1基因的表達，下丘腦與垂體的表達量顯著高于卵巢(P<0.01)[18]。梅山豬和長大二元母豬下丘腦KiSS-1基因的表達量極顯著高于垂體和卵巢(P<0.01)[19]。在初情期母豬下丘腦中成功克隆KiSS-1基因并檢測到該部位有高水平表達[20]。本研究對KiSS-1基因在小尾寒羊上的表達情況進行了研究，在下丘腦、垂體、卵巢、松果體等組織中均檢測到了KiSS-1基因的表達，下丘腦中的表達量顯著高于其他組織(P<0.05)，這與已有研究結果一致。但是，本研究中小尾寒羊垂體和卵巢中KiSS-1基因的表達量很低，與黃冬維等[18]和朱碧泉等[19]的研究結果不同，可能是由于不同物種在垂體中的表達存在差異所致。

哺乳動物促性腺激素的釋放完全依賴于GnRH的分泌，在繁殖季節(jié)或者發(fā)情期綿羊下丘腦的GnRH 神經元會急劇增加[21]，而Kisspeptin的繁殖激活功能主要作用在GnRH神經元上。動物下丘腦弓狀核以及視前區(qū)的KiSS-1神經元軸突末梢可直接投射到GnRH 神經元胞體上，建立突觸連接[22-23]，并且其受體GPR54 在大多數(shù)GnRH 神經元上表達[24]。因此，Kisspeptin 被認為是GnRH 最有力的激活者。研究發(fā)現(xiàn)小尾寒羊下丘腦KiSS-1基因的表達量在不同的發(fā)情階段存在顯著差異，其中發(fā)情盛期最高，極顯著高于發(fā)情前期、后期和間情期(P<0.01)[25]。發(fā)情啟動后阿勒泰羊下丘腦中KiSS-1基因的表達量逐漸下降，其中發(fā)情盛期高于發(fā)情末期，都顯著高于間情期(P<0.05)，極顯著高于乏情期(P<0.01)[17]。季節(jié)性繁殖動物綿羊在短日照時(發(fā)情)KiSS-1基因mRNA表達量高于長日照時(休情)，其KiSS-1基因主要在情期表達[26-29]。Abadeh母山羊在繁殖季節(jié)卵泡期下丘腦上的Kisspeptin神經元明顯多于黃體期和休情季節(jié)[30]。與本研究發(fā)現(xiàn)小尾寒羊下丘腦卵泡期表達量顯著高于黃體期的結果一致。

松果體是動物機體“生物鐘”的調控中心，能將晝夜明暗循環(huán)和季節(jié)性溫度變化等周期信號轉導成激素信號, 從而調整機體的生理機能[31]，其中褪黑素是松果體中最重要的產物。褪黑素可能通過Kisspeptin和RF 酰胺相關肽參與調控動物的季節(jié)性繁殖[32]。在發(fā)情期前對母鹿埋植褪黑素，可使其體內 FSH的濃度提高，促進卵泡的發(fā)育；同時能顯著提高LH的濃度，進一步促進排卵，從而達到使母鹿超排的效果[33]。本研究中卵泡期小尾寒羊松果體KiSS-1的表達量顯著高于黃體期。上述結果表明Kisspeptin 在小尾寒羊卵泡期和黃體期中的差異可能是由于褪黑素分泌模式的改變而引起的，并且松果體分泌的褪黑素對短日照繁殖動物的生殖活動起促進作用，通過Kisspeptin參與調控黃體期到卵泡期的發(fā)情狀態(tài)轉換。

3.2 RFRP-3基因表達

RFRP-3基因在母豬子宮、卵巢及眼等組織中度表達，在下丘腦高表達[34]。RFRP-3基因在母綿羊下丘腦等中樞神經系統(tǒng)和卵巢等生殖系統(tǒng)的表達量較高[35]。在幼齡綿羊延髓、眼、卵巢、子宮、下丘腦等組織中均檢測到了RFRP-3基因的表達，其中延髓表達量最高，眼、卵巢、脊髓、子宮和下丘腦等組織次之，內臟組織最低[36]。天府肉鵝和新西蘭白兔GnIH 前體基因主要表達于下丘腦[37-38]。濟寧青山羊和遼寧絨山羊RFRP基因主要在下丘腦、大腦皮層、小腦和卵巢中表達[18]。本研究用熒光定量PCR的方法檢測到RFRP-3基因在小尾寒羊下丘腦、卵巢、腎臟、大腦、小腦、腎上腺、輸卵管中均表達，且在下丘腦和卵巢中高表達。不同物種之間RFRP-3基因的表達存在一定的差異，這可能是由于物種的特異性引起的。但是RFRP-3基因在小尾寒羊下丘腦和卵巢中高表達說明該基因在綿羊發(fā)情和繁殖中都發(fā)揮著重要作用。

不同動物RFRP-3基因在季節(jié)性繁殖中的作用有所不同。注射RFRP-3可以抑制綿羊GnRH神經元的活性[39]；在褪黑素的控制下RFRP-3可以促進敘利亞倉鼠GnRH的釋放[40]。RFRP-3基因在處于長光照(16L∶8D)綿羊下丘腦的表達要高于短光照的綿羊[41]。繁殖期的綿羊RFRP-3基因在PVN和DMH中的表達量下降，與GnRH神經元接觸的細胞數(shù)量也減少[42]；同時發(fā)現(xiàn)，長日照下的季節(jié)性繁殖綿羊與短日照的個體相比其RFRP的表達和投射增加[41]；Abadeh母山羊在繁殖季節(jié)卵泡期下丘腦中的RFRP神經元明顯低于黃體期和休情季節(jié)[30]。這些研究結果支持了本試驗中小尾寒羊下丘腦RFRP-3基因表達量黃體期高于卵泡期的研究結果，表明RFRP-3基因對綿羊的生殖活動起抑制作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)RFRP-3基因在小尾寒羊卵巢中表達很高，黃體期顯著高于卵泡期(P<0.05)。豬RFRP-3主要在發(fā)情前期和發(fā)情期的顆粒細胞以及發(fā)情后期和間情期的黃體細胞中表達[35]。研究表明RFRP-3基因在卵巢水平發(fā)揮局部作用，因為該基因在人的顆粒細胞中表達，同時能夠減少促性腺激素的釋放和孕激素的合成[43-44]。小鼠卵巢中的RFRP-3與GnRH的表達密切相關， GnRH-RFRP-3系統(tǒng)對整個排卵周期中的卵泡發(fā)育和閉鎖起著重要作用[45]；RFRP-3在一定程度上影響促卵泡素的分泌與合成，參與調控卵泡的發(fā)育和閉鎖[46]。本研究中RFRP-3基因在黃體期顯著高于卵泡期，說明該基因在調控發(fā)情的時候主要在卵巢中實現(xiàn)功能，可能直接作用于卵泡的發(fā)育和閉鎖。但其在卵巢中具體的功能和調節(jié)機制還需進一步研究。

4 結 論

KiSS-1基因在小尾寒羊卵泡期下丘腦和松果體的表達量均顯著高于黃體期，提示其可能在小尾寒羊黃體期到卵泡期發(fā)情狀態(tài)轉換中起促進作用。RFRP-3基因在黃體期下丘腦表達量高于卵泡期，說明其可能在小尾寒羊發(fā)情狀態(tài)轉換中起抑制作用。RFRP-3基因在不同時期卵巢差異表達的研究結果暗示，RFRP-3基因在調控發(fā)情的時候主要在卵巢中實現(xiàn)功能，可能直接作用于卵泡的發(fā)育和閉鎖。本試驗結果為深入研究KiSS-1和RFRP-3基因在綿羊季節(jié)性發(fā)情方面的作用奠定了基礎。