欒兆進(jìn) 范曉梅 宋慧子 栗瑞蘭 張 通 張家新*

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018； 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010110)

附睪緊貼睪丸的上端和后緣，可分為頭、體、尾三部分，精子離開睪丸進(jìn)入附睪，在附睪轉(zhuǎn)運(yùn)過程中對(duì)精子的成熟起著關(guān)鍵作用[1]。精子在通過附睪腔時(shí)，與附睪上皮細(xì)胞合成分泌的蛋白相互作用來獲得運(yùn)動(dòng)和受精的能力[2-6]。上皮細(xì)胞表達(dá)受激素和其他生物信號(hào)的調(diào)節(jié)，細(xì)胞體外培養(yǎng)是基因功能驗(yàn)證、調(diào)控機(jī)制和信號(hào)通路研究等相關(guān)試驗(yàn)的必要基礎(chǔ)。許多功能基因在不同動(dòng)物附睪中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式[7-9]。附睪頭、體和尾部3個(gè)解剖區(qū)域的上皮細(xì)胞具有不同的生理功能和獨(dú)特的蛋白質(zhì)組，不同蛋白表達(dá)受到特定的轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)的調(diào)控以協(xié)調(diào)功能的區(qū)域特異性[6]。

附睪對(duì)雄激素具有高度依賴性，雄激素在維持附睪結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用，與雄激素結(jié)合蛋白(ABP)結(jié)合的睪酮可通過受體介導(dǎo)被附睪初始段和頭部上皮細(xì)胞攝取[2]。氫化可的松可作用于糖皮質(zhì)激素受體(GR)、核受體和免疫細(xì)胞部分基因的轉(zhuǎn)錄因子等多種受體[10-11]，在體外培養(yǎng)細(xì)胞中的作用不盡相同：研究表明氫化可的松能夠抑制體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞[12]和成纖維細(xì)胞[13]增殖；對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞[14]、皮膚角質(zhì)細(xì)胞[15]、角膜緣干細(xì)胞[16]和成熟脂肪細(xì)胞[17]的體外增殖有明顯的促進(jìn)作用,該激素已被用于人[6]和大鼠[18]附睪上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開始重視對(duì)附睪功能的探究，但多利用附睪組織而非分離的上皮細(xì)胞進(jìn)行基礎(chǔ)研究，上述2 種激素對(duì)山羊附睪頭部上皮細(xì)胞的增殖機(jī)理以及二者間是否存在互作的研究尚未見報(bào)道。本研究擬通過向體外細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的睪酮和氫化可的松，研究睪酮和氫化可的松對(duì)山羊附睪上皮細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)一步探究睪酮和氫化可的松之間是否存在互作及其可能機(jī)制，旨在為山羊附睪上皮細(xì)胞增殖機(jī)理和附睪功能的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2016年6—10月在內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，將10～12月齡被覆完整白膜的內(nèi)蒙古絨山羊睪丸在超凈臺(tái)內(nèi)劃開白膜取出附睪頭部組織，用于細(xì)胞體外培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)儀器及主要試劑

NANODROP 2000紫外分光光度儀(Thermo)；MX3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Agilent)；酶標(biāo)儀(Bio-Tek)；Imager A2 顯微鏡(蔡司)。

活性炭過濾胎牛血清 (Biological Industries)；睪酮(T6147，Sigma)；氫化可的松(H0888，Sigma)；CCK-8(TransGen Biotech)；雄激素受體拮抗劑Enzalutamide (EY0026，Amquar)；M-PERTMMammalian Protein Extraction Reagent (78503，Thermo)；TRIzol(TIANGEN)試劑盒；PrimeScript TMRT Master Mix kit(Tarkara)；TaqPCR Mastermix kit(TIANGEN)，ELISA 試劑盒(上海寶曼生物有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1附睪頭部上皮細(xì)胞培養(yǎng)

10～12月齡被覆完整白膜的絨山羊睪丸在超凈臺(tái)內(nèi)劃開白膜取附睪頭部組織，剪碎(大小1～3 mm) 呈糊狀混合物，移入0.25% 胰酶中，37 ℃水浴震蕩消化50 min，血清終止消化，再用0.1% 膠原酶Ⅳ(含CaCl20.36 mmol/L)震蕩消化60 min，依次用100和200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，濾過液加入等體積RPMI 1640培養(yǎng)基(100 mL/L胎牛血清、5 μg/mL 轉(zhuǎn)鐵蛋白、50 U/mL青霉素和50 μg/mL鏈霉素)，1 000 r/min離心5 min，去上清，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2睪酮和氫化可的松對(duì)附睪頭部上皮細(xì)胞增殖的影響

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2代附睪頭部上皮細(xì)胞，用不含睪酮和氫化可的松的培養(yǎng)基制成適當(dāng)密度的細(xì)胞懸液，以每孔100 μL細(xì)胞懸液(約含2 500個(gè)細(xì)胞)接種于96孔板， 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁，分別換不同濃度睪酮(0、50、100、200、1 000 nmol/L以及100 nmol/L睪酮 + AR阻斷劑Enzalutamide，0.7%乙醇陰性對(duì)照組)或氫化可的松(0、20、200、2 000、20 000 nmol/L和0.7% 乙醇陰性對(duì)照組)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)基每24 h換1次，以不含細(xì)胞的培養(yǎng)基做空白對(duì)照孔。利用CCK法檢測(cè)附睪頭部上皮細(xì)胞增殖[19]，第5天(細(xì)胞處于增殖期)時(shí)每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值。

1.3.3附睪頭部上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線制作

將第2代附睪頭部上皮細(xì)胞用不含氫化可的松和睪酮的培養(yǎng)基制成適當(dāng)密度的細(xì)胞懸液，以每孔100 μL細(xì)胞懸液(約含2 500個(gè)細(xì)胞)接種于96孔板，以不含細(xì)胞的培養(yǎng)基做空白對(duì)照孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁，分別換不同濃度激素的培養(yǎng)基(0、100 nmol/L睪酮、200 nmol/L氫化可的松、100 nmol/L睪酮+200 nmol/L氫化可的松)繼續(xù)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1、2、3、4、5和6 d后，每孔加入10 μL CCK-8溶液， 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)，所有培養(yǎng)基每24 h換1次。

1.3.4睪酮/氫化可的松對(duì)雄激素受體(Androgen receptor，AR)的影響

用不添加激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液后接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別換添加了100 nmol/L睪酮、200 nmol/L氫化可的松和100 nmol/L睪酮+200 nmol/L氫化可的松的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用于實(shí)時(shí)熒光定量法和ELISA法檢測(cè)AR表達(dá)量，以不添加激素的培養(yǎng)基處理的細(xì)胞作對(duì)照組。

1.3.5總RNA的提取、cDNA的合成及PCR擴(kuò)增(RT-PCR)

參照TRIzol(TIANGEN)試劑盒操作說明，分別提取添加100 nmol/L睪酮、200 nmol/L氫化可的松、100 nmol/L睪酮+200 nmol/L氫化可的松和不添加激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的第①代附睪頭部上皮細(xì)胞總RNA；1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性；使用PrimeScript TMRT Master Mix kit(Tarkara)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；使用TaqPCR Mastermix kit(TIANGEN)試劑盒對(duì)AR基因和管家基因β-actin進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，循環(huán)條件為：預(yù)變性(95 ℃、5 min)，變性(95 ℃、30 s)，退火(62 ℃、30 s)，延伸(72 ℃、30 s)，35個(gè)循環(huán)后總延伸(72 ℃、10 min)；1% 瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增條帶大小和亮度進(jìn)行檢測(cè)分析。引物序列和PCR退火溫度見表1。

表1 AR和β-actin基因引物Table 1 Primers used for AR and β-actin

1.3.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Tarkara)對(duì)添加100 nmol/L睪酮、200 nmol/L氫化可的松、100 nmol/L睪酮+200 nmol/L氫化可的松和不添加激素培養(yǎng)基培養(yǎng)于6孔板中的細(xì)胞AR基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算分析數(shù)據(jù)。反應(yīng)條件如下：95 ℃、10 min，95 ℃、30 s，62 ℃、30 s， 72 ℃、30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL，包含10 μL SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)、1 μL cDNA、1 μL上下游引物、0.4 μL ROX、6.6 μL ddH2O(滅菌蒸餾水)。

1.3.7ELISA法檢測(cè)附睪頭部上皮細(xì)胞AR蛋白

將添加100 nmol/L睪酮、200 nmol/L氫化可的松、100 nmol/L睪酮+200 nmol/L氫化可的松和不添加激素培養(yǎng)基培養(yǎng)于6孔板中的細(xì)胞去除培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次。150 μL蛋白提取劑添加1.5 μL PMSF，加入6孔板，輕晃10 min，移入1.5 mL離心管，14 000 r/min離心10 min，上清液用于ELISA法檢測(cè)AR蛋白。嚴(yán)格按照山羊AR ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行，AR標(biāo)準(zhǔn)品濃度為：0、50、100、200、400、800 pg/mL。由于ELISA試劑盒測(cè)定AR濃度范圍有限，試驗(yàn)樣本均稀釋5倍。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)采用SAS 9.0軟件中的ANAVO對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan法對(duì)不同濃度睪酮和氫化可的松作用于細(xì)胞增殖以及AR基因mRNA和AR蛋白表達(dá)量的主效應(yīng)進(jìn)行比較，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 睪酮對(duì)附睪上皮細(xì)胞增殖的影響

向細(xì)胞培養(yǎng)基中分別添加不同濃度睪酮、睪酮以及AR阻斷劑Enzalutamide，并以0.7%乙醇作為陰性對(duì)照組，分為7個(gè)組檢測(cè)睪酮對(duì)附睪頭部上皮細(xì)胞增殖的影響。由圖1可知，低濃度睪酮可明顯促進(jìn)附睪頭部上皮細(xì)胞的增殖，其中，100 nmol/L睪酮組的促細(xì)胞增殖效應(yīng)最佳，比對(duì)照組提高68.2%，差異極顯著(P<0.01)；高濃度睪酮(1 000 nmol/L)對(duì)細(xì)胞增殖無顯著促進(jìn)作用，并與0 nmol/L對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，表明睪酮對(duì)附睪頭部上皮細(xì)胞增殖具有一定的促進(jìn)效應(yīng)，且該效應(yīng)呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。100 nmol/L睪酮 + Enzalutamide處理組的細(xì)胞增殖與不含睪酮的對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05)，但與100 nmol/L睪酮組差異極顯著(P<0.01)。0 nmol/L對(duì)照組與0.7%乙醇陰性對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

Ⅰ，0 nmol/L T；NC，陰性對(duì)照； Ⅱ，50 nmol/L T；Ⅲ，100 nmol/L T；Ⅳ，200 nmol/L T；Ⅴ，1 000 nmol/L T；Ⅵ，100 nmol/L T+雄激素受體阻斷劑(Enzalutamide). **，差異極顯著(P<0.01)，與Ⅰ組相比；##：Ⅲ組與Ⅵ組差異極顯著(P<0.01)。Ⅰ，0 nmol/L T; NC, negative control; Ⅱ，50 nmol/L T；Ⅲ，100 nmol/L T；Ⅳ，200 nmol/L T；Ⅴ，1 000 nmol/L T；Ⅵ，100 nmol/L T+enzalutamide. **，extreme difference (P<0.01) compared with group Ⅰ; ##, extreme differences (P<0.01) between group Ⅲ and groupⅥ.圖1 睪酮對(duì)附睪上皮細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of testosterone (T) on proliferation of epididymal epithelial cells

2.2 氫化可的松對(duì)附睪上皮細(xì)胞增殖的影響

通過向細(xì)胞培養(yǎng)基中分別添加濃度為0、20、200、2 000、20 000 nmol/L氫化可的松以及0.7%乙醇陰性對(duì)照組，分為6個(gè)組檢測(cè)氫化可的松對(duì)附睪頭部上皮細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果由圖2可知，與0 nmol/L 對(duì)照組相比，培養(yǎng)基中含200和2 000 nmol/L 氫化可的松可顯著的促進(jìn)附睪頭部上皮細(xì)胞增殖(P<0.05)，其中，200 nmol/L時(shí)促增殖效果最佳，比對(duì)照組提高25.3%。0 nmol/L對(duì)照組與0.7%乙醇陰性對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。

Ⅰ，0 nmol/L H； NC，陰性對(duì)照；Ⅱ，20 nmol/L H；Ⅲ，200 nmol/L H；Ⅳ，2 000 nmol/L H；Ⅴ，20 000 nmol/L H。圖2 氫化可的松對(duì)附睪上皮細(xì)胞增殖的影響 Fig.2 Effects of hydrocortisone (H)on proliferation of epididymal epithelial cells

2.3 睪酮和氫化可的松對(duì)附睪上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

為研究細(xì)胞培養(yǎng)基中同時(shí)添加睪酮和氫化可的松時(shí)是否可以對(duì)附睪上皮細(xì)胞增殖呈現(xiàn)出協(xié)同或拮抗效應(yīng)，根據(jù)上述試驗(yàn)獲得的培養(yǎng)液中所需睪酮和氫化可的松的最佳促增殖濃度依次檢測(cè)了對(duì)照組、睪酮組、氫化可的松組和睪酮+氫化可的松組的生長(zhǎng)曲線(圖3)。結(jié)果表明各組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均近似“S”型，細(xì)胞培養(yǎng)的3～5 d均為細(xì)胞指數(shù)增長(zhǎng)期；細(xì)胞培養(yǎng)的前4天，睪酮組和氫化可的松組的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)與對(duì)照組相比差異均無顯著性 (P>0.05)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到第5、第6天時(shí)，睪酮組和氫化可的松組的細(xì)胞增殖顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；睪酮+氫化可的松組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線從第3天開始即顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且第6天的細(xì)胞生長(zhǎng)與對(duì)照組有極顯著差異(P<0.01)。

圖3 睪酮和氫化可的松對(duì)附睪上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Interaction of testosterone (T) and hydrocortisone (H) on the growth curve of epididymal epithelial cells

2.4 睪酮和氫化可的松對(duì)AR表達(dá)量的影響

RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖4顯示，引物特異性好，擴(kuò)增的目的條帶單一，且大小與設(shè)計(jì)一致，不同處理組的條帶亮度有所不同，睪酮+氫化可的松組亮度最佳，睪酮組與氫化可的松組亮度區(qū)別不大，對(duì)照組亮度最弱。qRT-PCR定量結(jié)果見圖5(a)，由添加了100 nmol/L睪酮的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞的ARmRNA表達(dá)量較對(duì)照組有顯著增加(P<0.05)，當(dāng)培養(yǎng)基中只添加200 nmol/L氫化可的松時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞中ARmRNA表達(dá)量也較對(duì)照組有顯著增加(P<0.05)，而當(dāng)100 nmol/L睪酮與200 nmol/L氫化可的松共存時(shí)，ARmRNA表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，約是對(duì)照組的2.1倍。RT-PCR與qRT-PCR結(jié)果相一致，說明試驗(yàn)數(shù)據(jù)可信。

ELISA 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞AR蛋白水平，結(jié)果見圖5(b)，培養(yǎng)基中只添加100 nmol/L睪酮或只添加200 nmol/L氫化可的松時(shí)，細(xì)胞中的AR蛋白表達(dá)量較對(duì)照組有顯著的上調(diào)(P<0.05)，當(dāng)睪酮與氫化可的松同時(shí)存在時(shí)，AR蛋白的表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，約是對(duì)照組的1.3倍。

圖4 不同處理中AR 基因RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Detection of AR gene expressions after different treatments by RT-PCR

M，DNA分子量標(biāo)記；1，100 nmol/L T+200 nmol/L H；2，200 nmol/L T；3，100 nmol/L H；4，對(duì)照組。M, DNA marker; 1, 100 nmol/L T+200 nmol/L H; 2, 200 nmol/L T; 3, 100 nmol/L H; 4, control group.圖5 睪酮和氫化可的松對(duì)AR基因表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of testosterone(T)and hydrocortisone(H) on the expression quantity of AR gene

3 討論與結(jié)論

雄激素可直接或被轉(zhuǎn)化為二氫睪酮(DHT)與AR結(jié)合，由AR介導(dǎo)，調(diào)節(jié)敏感基因的表達(dá)，還可經(jīng)由膜相關(guān)AR激活多種信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)發(fā)揮生理效應(yīng)[20-21]。雄激素調(diào)控附睪特異性表達(dá)且與精子成熟相關(guān)的部分基因，如β-防御素18、19、20、39、41、42[22]，谷胱甘肽過氧化物酶5[23]，脂質(zhì)運(yùn)載蛋白5[24]和富含半胱氨酸的分泌蛋白1[25]。雄激素可以通過AR來誘導(dǎo)激活與前列腺基質(zhì)細(xì)胞[26]、卵巢顆粒細(xì)胞[27]、前列腺癌細(xì)胞[28-29]和乳腺癌細(xì)胞[30]的增殖和存活相關(guān)的基因表達(dá)。本試驗(yàn)研究了培養(yǎng)液中含有不同水平的睪酮對(duì)附睪頭部上皮細(xì)胞增殖產(chǎn)生的作用，結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的睪酮對(duì)附睪頭部上皮細(xì)胞有顯著的促增殖效應(yīng)，且呈明顯的劑量依賴性，該效應(yīng)可以被AR阻斷劑阻斷，說明睪酮可以通過AR發(fā)揮對(duì)附睪頭部上皮細(xì)胞促增殖作用，但是過高濃度睪酮(1 000 nmol/L)對(duì)細(xì)胞增殖無促進(jìn)作用。此結(jié)論與王越[27]在卵巢顆粒細(xì)胞上的研究基本相符。

氫化可的松作為機(jī)體內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素具有多種生理和藥理作用，并作用于多種受體[10-11]。研究表明，軟骨細(xì)胞的增殖能力[12]和成纖維細(xì)胞增殖及分泌膠原的過程均受到氫化可的松的抑制[13]。Bjornson等[31]在臨床醫(yī)學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)血液中含有氫化可的松可以引起嗜酸性粒細(xì)胞的減少，并同時(shí)增多中性粒細(xì)胞。相關(guān)研究表明，氫化可的松可以明顯提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞[14]、角膜緣干細(xì)胞[16]及脂肪細(xì)胞[17]的體外增殖能力，并可抑制脂肪干細(xì)胞的脂肪分化，具有分解脂肪的活性[32]。氫化可的松還可促進(jìn)小鼠β細(xì)胞的增殖[33]。該激素誘導(dǎo)細(xì)胞表面受體發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機(jī)制不同可能導(dǎo)致了其在細(xì)胞增殖方面表現(xiàn)出不同效應(yīng)。本試驗(yàn)研究了不同濃度氫化可的松對(duì)附睪上皮細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示氫化可的松對(duì)附睪頭部上皮細(xì)胞增殖起到一定的促進(jìn)作用，且呈現(xiàn)出濃度依賴性，200 nmol/L為該激素的最佳促細(xì)胞增殖作用濃度。此結(jié)論與衛(wèi)俊霞等[13]在皮膚成纖維細(xì)胞上的研究基本一致。

睪酮通過結(jié)合激活A(yù)R發(fā)揮功能，使AR識(shí)別并固定到目的DNA序列上以調(diào)控基因的表達(dá)[23-24]。Pearl等[34]研究發(fā)現(xiàn)GR可通過地塞米松的誘導(dǎo)與距離AR基因啟動(dòng)子上游小于10 KB的區(qū)域相結(jié)合，并顯著上調(diào)AR基因表達(dá)量，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)敲除GR基因可顯著下調(diào)AR基因表達(dá)量，該試驗(yàn)表明GR對(duì)AR的上調(diào)是必需的。同為糖皮質(zhì)激素的氫化可的松同樣可通過GR發(fā)揮效應(yīng)[35]，并可上調(diào)GR表達(dá)量[36]，固推測(cè)其可能通過誘導(dǎo)GR而導(dǎo)致AR基因上調(diào)。為了探究睪酮和氫化可的松同時(shí)存在時(shí)是否具有互作關(guān)系，本試驗(yàn)對(duì)對(duì)照組、睪酮組、氫化可的松組、睪酮+氫化可的松組中的附睪頭部上皮細(xì)胞測(cè)定的增殖曲線結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，睪酮和氫化可的松在細(xì)胞培養(yǎng)到第5天和第6天時(shí)均可顯著的促進(jìn)細(xì)胞增殖，而當(dāng)這兩種激素共同存在時(shí)對(duì)促進(jìn)細(xì)胞增殖方面表現(xiàn)出顯著的協(xié)同效應(yīng)。為了探究該協(xié)同效應(yīng)機(jī)制，進(jìn)一步對(duì)不同激素作用后附睪頭部上皮細(xì)胞的AR基因表達(dá)量進(jìn)行了相對(duì)定量及ELISA檢測(cè)。本研究中氫化可的松可顯著上調(diào)附睪頭部上皮細(xì)胞AR基因表達(dá)量，這與地塞米松可上調(diào)AR基因表達(dá)[34]的結(jié)果一致，而睪酮也可顯著上調(diào)AR基因表達(dá)量，當(dāng)氫化可的松和睪酮二者共存時(shí)AR基因表達(dá)量極顯著上調(diào)，該結(jié)果表明睪酮可明顯協(xié)同與氫化可的松作用于附睪頭部上皮細(xì)胞AR基因表達(dá)量的增加，并與睪酮和氫化可的松共存時(shí)對(duì)附睪頭上皮細(xì)胞增殖的顯著協(xié)同作用相一致。因此，該協(xié)同作用可能是由于氫化可的松對(duì)AR基因表達(dá)量的上調(diào)，增強(qiáng)了睪酮通過AR來促進(jìn)細(xì)胞增殖的效應(yīng)，即表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)，此結(jié)果為進(jìn)一步研究甾體類激素對(duì)山羊附睪功能調(diào)節(jié)提供理論依據(jù)。

綜上所述，睪酮和氫化可的松在不同程度上影響著山羊附睪頭部上皮細(xì)胞的增殖能力，二者對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)效應(yīng)均呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，當(dāng)二者共存時(shí)可顯著的協(xié)同作用于細(xì)胞增殖。睪酮通過AR發(fā)揮促細(xì)胞增殖效應(yīng)，睪酮與氫化可的松協(xié)同促進(jìn)AR表達(dá)，初步說明兩種激素協(xié)同促細(xì)胞增殖效應(yīng)可能與AR相關(guān)，但協(xié)同作用的調(diào)控機(jī)制仍需做進(jìn)一步的探究。