葉肖辰皓，姜珊珊，焉炳飛*，葉 敏*

1煙臺(tái)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，煙臺(tái) 264005；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201

水果和蔬菜富含維生素、無機(jī)鹽和植物纖維，是人體所需維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維的重要來源，也是僅次于糧食的主要農(nóng)產(chǎn)品[1]。新鮮果蔬在貯運(yùn)過程中常常會(huì)因植物病原菌侵染而發(fā)生病變腐爛，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和資源浪費(fèi)[2]。灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)是一種導(dǎo)致草莓、番茄等果蔬采后發(fā)生灰霉病的重要植物病原真菌[3]。長期以來，國內(nèi)外防治果蔬采后灰霉病的主要方法是使用人工合成的化學(xué)殺菌劑，其中常用的化學(xué)殺菌劑有噻菌靈(triabendazole)、甲基硫菌靈(thiophanate-methyl)、異菌脲(iprodione)等[4]。然而，已有足夠的證據(jù)顯示，化學(xué)殺菌劑長期用于果蔬采后抑菌防腐不僅對(duì)人體健康造成較大危害，同時(shí)也增大了致病微生物產(chǎn)生抗性的潛在風(fēng)險(xiǎn)[5]。大量研究結(jié)果表明，某些植物的揮發(fā)油(essential oils)能夠有效控制果蔬的采后病害，從而降低因使用化學(xué)殺菌劑造成的食品安全風(fēng)險(xiǎn)[6]。

柚(Citrusmaxima)是蕓香科柑橘屬喬木的果實(shí)，屬于芳香類水果，主要分布于東南亞及我國的長江以南地區(qū)。我國是世界上名列第二的柚子種植大國，柚子的種植面積和產(chǎn)量僅次于美國[7]。柚皮占柚子重量的三分之一，食用或加工后產(chǎn)生的大量柚皮不僅污染環(huán)境，而且是一種資源浪費(fèi)[8]。有報(bào)道稱柚皮提取物對(duì)多種植物病原菌有顯著的抑菌活性[9]，為了更好地開發(fā)和利用柚皮這一天然的抑菌物質(zhì)資源，本研究以果蔬采后重要致病真菌灰葡萄孢菌作為供試靶標(biāo)，對(duì)柚皮揮發(fā)油的抑菌活性進(jìn)行研究，探討將柚皮揮發(fā)油用于果蔬采后抑菌防腐的可能性。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

氣相色譜儀(Agilent 7890B具FID檢測器，美國Agilent公司)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 7890A/5975，美國Agilent公司)；HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國J&W Scientific 公司)；電子分析天平(AL-104型，瑞士Mettler Toledo儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi R-114，瑞士Buchi公司)；低溫冷卻循環(huán)泵(DLS-5L/25，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；超聲波清洗器(SK8210LHC，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；智能光照培養(yǎng)箱(MGC-300A，上海一恒科技有限公司)；電熱套；水蒸汽蒸餾裝置；微量進(jìn)樣器等。

1.2 試劑

正十三烷、正十六烷、正十八烷(色譜純，美國Sigma-Aldrich公司)；檸檬烯(美國Sigma-Aldrich公司，含量95%)、月桂烯(美國Sigma-Aldrich公司，含量94%)；正己烷(分析純，天津化學(xué)試劑有限公司)；高純氦氣(純度99.999%，昆明梅賽爾氣體有限公司)；葡萄糖(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；瓊脂粉(分析純，北京索萊寶科技有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用柚子為福建平和產(chǎn)琯溪蜜柚，購自昆明市農(nóng)貿(mào)市場，取新鮮柚子將皮剝下備用。本研究使用的灰葡萄孢菌菌種，為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 柚皮揮發(fā)油提取及密度測定

采用水蒸氣同時(shí)蒸餾萃取法提取柚皮揮發(fā)油。現(xiàn)有研究結(jié)果表明[10,11]，采用水蒸氣蒸餾提取植物揮發(fā)油，植物材料與水的料液比大多采用1∶3或1∶4本研究采用1∶3。準(zhǔn)確稱取新鮮柚皮200 g于提取瓶中，加入600 mL蒸餾水，搖勻。將200 mL正己烷裝入溶劑瓶中，分別加熱至沸騰，自水和溶劑回流正常開始計(jì)時(shí)，提取時(shí)間為6、8、10和12 h，提取完成后正己烷經(jīng)無水NaSO4脫水過濾，濾液在40 ℃下減壓除去溶劑得到柚皮揮發(fā)油，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，依據(jù)3次重復(fù)的結(jié)果計(jì)算平均得率。

準(zhǔn)確移取柚皮揮發(fā)油1.0 mL于干燥的稱量瓶中稱重(精確至0.001 g)，計(jì)算揮發(fā)油的密度(g/cm3)。

2.2 柚皮揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-FID分析

色譜柱：HP-5MS 石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國J&W Scientific 公司)；柱箱溫度：初溫40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至250 ℃，保持6 min；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；檢測器溫度260 ℃；載氣為高純氦氣(純度99.999%)，流量1.0 mL/min；燃?xì)鉃闅錃?純度99.9%)，流量：60 mL/min；助燃?xì)鉃闊o水空氣，流量：400 mL/min；進(jìn)樣分流比10∶1；進(jìn)樣量1.0 μL，樣品濃度1.0 mg/mL(溶劑為正己烷)。

2.3 柚皮揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-MS分析

2.3.1 氣相色譜條件

色譜柱：HP-5MS 石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱箱溫度：初溫40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至250 ℃，保持6 min；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；載氣為高純氦氣(純度99.999%)，流量1.0 mL/min；分流比10∶1，進(jìn)樣量1.0 μL，樣品濃度1.0 mg/mL(溶劑為正己烷)。

2.3.2 質(zhì)譜條件

EI離子源，電離能量：70 eV，掃描范圍：50～550 amu，四極桿溫度：150 ℃，離子源溫度：230 ℃，接口溫度：280 ℃，EM電壓：1 450 V，溶劑延遲：6 min。

2.4 柚皮揮發(fā)油及其主要單體化合物抑菌活性測定

2.4.1 培養(yǎng)基的制備

本研究使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL)，高壓濕熱滅菌(121 ℃，30 min)后備用。

2.4.2 揮發(fā)油及其主要單體化合物接觸抑菌活性測定

本研究采用Gogolous等[12]的菌絲生長速率法，測定柚皮揮發(fā)油及其主要單體化合物的抑菌活性。將柚皮揮發(fā)油及其主要單體化合物用適量丙酮溶解，加入與丙酮等量的Tween-80 搖勻后用滅菌蒸餾水配制成系列預(yù)濃度的揮發(fā)油乳濁液，待PDA培養(yǎng)基冷卻至45 ℃時(shí)，將揮發(fā)油乳濁液加至培養(yǎng)基中(揮發(fā)油乳濁液體積與培養(yǎng)基體積比為 1∶9)，充分混勻后移入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿制成含揮發(fā)油及其主要單體化合物62.5、125、250、500、1 000、2 000 μg/mL的PDA含藥平板，空白對(duì)照培養(yǎng)基加入與處理培養(yǎng)基等量的丙酮和Tween-80。

在經(jīng)7天預(yù)培養(yǎng)的病原菌菌落邊沿用內(nèi)徑5 mm打孔器制取菌餅后將菌絲面分別接種到含藥及對(duì)照(含等量溶劑和Tween-80)的PDA培養(yǎng)基平板中心，于25 ℃下黑暗培養(yǎng)1、2、3、4、5和6 天后用十字交叉法分別測量各處理的菌落直徑并計(jì)算其平均值，依據(jù)下列公式計(jì)算各處理對(duì)病原菌菌絲的生長抑制率，每處理重復(fù)3次。

2.4.3 揮發(fā)油及其主要單體化合物熏蒸抑菌活性測定

采用Chutia等[13]的培養(yǎng)皿對(duì)扣熏蒸法，測定柚皮揮發(fā)油及其主要單體化合物的抑菌活性。在經(jīng)7天預(yù)培養(yǎng)的病原菌菌落邊沿用內(nèi)徑5mm打孔器制取菌餅后將菌絲面接種到PDA培養(yǎng)基平板中心。在直徑40 mm的無菌濾紙片上用微量進(jìn)樣器分別準(zhǔn)確滴加濃度為62.5、125、250、500、1 000、2 000 μg/mL的柚皮揮發(fā)油及其主要單體化合物(濃度按培養(yǎng)皿對(duì)扣的凈空體積折算)并置于培養(yǎng)皿蓋中，將接種后的PDA培養(yǎng)基平板倒扣在培養(yǎng)皿蓋上用帕拉膜(Parafilm)密封后25 ℃下黑暗培養(yǎng)，接種后1、2、3、4、5和6天后用十字交叉法分別測量各處理的菌落直徑并計(jì)算其平均值，依據(jù)上列公式計(jì)算各處理的菌絲生長抑制率，每個(gè)處理重復(fù)3次。

2.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS17.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)合Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)進(jìn)行單向ANOVA分析，評(píng)價(jià)處理間的差異顯著性和重復(fù)間的離散度。

3 結(jié)果與分析

3.1 柚皮揮發(fā)油提取時(shí)間與得率

水蒸氣蒸餾不同時(shí)間提取柚皮揮發(fā)油得率和物理性狀結(jié)果，如表1所示。

試驗(yàn)結(jié)果表明，用水蒸氣同時(shí)蒸餾萃取法提取柚皮揮發(fā)油的最佳提取時(shí)間為10 h，得率為0.32%(w/w)，柚皮揮發(fā)油密度為0.66 g/cm3。

表1 不同時(shí)間提取柚皮揮發(fā)油得率

注：得率為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

Note:Values are mean ± standard deviation (n=3).

3.2 柚皮揮發(fā)油化學(xué)成分分析

3.2.1 柚皮揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-MS和GC-FID分析

GC-MS 分析結(jié)果表明，柚皮揮發(fā)油中共有8個(gè)主要化學(xué)成分，占揮發(fā)油總量的99.8%，柚皮揮發(fā)油化學(xué)成分的總離子流圖，詳見圖1。

圖1 柚皮揮發(fā)油GC-MS分析的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of essential oil from C.maxima peel

通過NIST08質(zhì)譜譜庫檢索并結(jié)合GC-FID保留指數(shù)測定鑒定了柚皮揮發(fā)油中8個(gè)主要成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，柚皮揮發(fā)油中所含的8個(gè)主要成分的質(zhì)譜圖，如圖2所示；主要碎片離子數(shù)據(jù)，如表2所示。在GC-MS分析同等的色譜分離條件下，以正十三烷(n-octane)、正十六烷(n-hexadecane)和正十八烷(n-octadecane)為基準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行柚皮揮發(fā)油的GC-FID分析，按8種主要化學(xué)成分的保留時(shí)間，計(jì)算其保留指數(shù)。經(jīng)與相關(guān)文獻(xiàn)[14-16]中揮發(fā)性化學(xué)成分的GC-FID保留指數(shù)比對(duì)，柚皮揮發(fā)油中8中化學(xué)成分的保留指數(shù)分別與相同或相近氣相色譜分析條件下3-methyl-apopinene、α-蒎烯(α-pinene)、月桂烯(myrcene)、檸檬烯(limonene)、α-methyl-α-[4-methyl-3-pentenyl]oxiranemethanol、氧化芳樟醇(linalool oxide)、藍(lán)桉醇(globulol)和香柏酮(nootkatone)的保留指數(shù)相吻合。揮發(fā)油中各個(gè)組分的相對(duì)含量依據(jù)GC-FID的分析結(jié)果，采用歸一化法按峰面積大小進(jìn)行定量。柚皮揮發(fā)油GC-MS分析和GC-FID保留指數(shù)測定的結(jié)果，如表3所示。

圖2 柚皮揮發(fā)油主要成分的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of main chemical compositions in essential oil from C.maxima peel.

表2 柚皮揮發(fā)油主要成分的主要碎片離子數(shù)據(jù)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

峰號(hào)Peak No.化合物Compound主要碎片離子Main fragment ion[m/z (%)]5α-Methyl-α-[4-methyl-3-pentenyl]oxiranemethanol59 (99.9);94 (60.3);43 (52.7);111 (39.8);93 (38.5);55 (36.2);68 (31.8); 67 (25.8);41 (25.6);81 (19.6)6Linalool oxide59 (99.9);43 (66.4);55 (30.2);94 (28.3);68 (26.9);41 (26.2);111 (22.6); 93 (21.5);67 (19.2);81 (16.3)7Globulol43 (99.9);41 (62.3);69 (45.2);81 (43.5);109 (41.2);55 (35.4);95 (34.2);67 (33.3);107 (30.6);93 (30.0)8Nootkatone147 (99.9);121 (77.4);146 (73.5);161 (69.9);41 (68.4);133 (64.5);200 (64.2);203 (59.7);175 (56.7);79 (54.8)

表3 柚皮揮發(fā)油的主要化學(xué)成分

表4 接種后不同時(shí)間柚皮揮發(fā)油對(duì)灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性

注：菌絲生長抑制率數(shù)值之后為±標(biāo)準(zhǔn)差(三次重復(fù))；同列平均值后的字母不同表示經(jīng)S-N-K檢驗(yàn)在P= 0.05水平上差異顯著。

Note:Values are mean ± standard deviation (n=3);Means in the same column followed by the different letter were significant different according to S-N-K test atP= 0.05.

3.3 柚皮揮發(fā)油的抑菌活性

3.3.1 柚皮揮發(fā)油的接觸抑菌活性

接種后不同時(shí)間柚皮揮發(fā)油對(duì)灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如表4所示。

試驗(yàn)結(jié)果表明，柚皮揮發(fā)油對(duì)灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性與處理劑量成正相關(guān)，接種第2天后與時(shí)間成負(fù)相關(guān)，結(jié)果見表4?？傮w來看柚皮揮發(fā)油對(duì)灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性較低，活性最高值為接種后第2天的2 000 μg/mL處理，對(duì)菌絲生長的抑制率為80.74%，其余處理的活性均低于60%。接種第4天后250 μg/mL及以下處理的抑菌活性與空白對(duì)照相比在P<0.05水平上無顯著差異。

3.3.2 柚皮揮發(fā)油的熏蒸抑菌活性

接種后不同時(shí)間柚皮揮發(fā)油對(duì)灰葡萄孢菌的熏蒸抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如表5所示。

表5 接種后不同時(shí)間柚皮揮發(fā)油對(duì)灰葡萄孢菌的熏蒸抑菌活性

注：菌絲生長抑制率數(shù)值之后為±標(biāo)準(zhǔn)差(三次重復(fù))；同列平均值后的字母不同表示經(jīng)S-N-K檢驗(yàn)在P=0.05水平上差異顯著。下同。

Note:Values are mean ± standard deviation (n=3);Means in the same column followed by the different letter were significant different according to S-N-K test atP= 0.05.The same as below.

試驗(yàn)結(jié)果表明，柚皮揮發(fā)油對(duì)灰葡萄孢菌的熏蒸抑菌活性與處理劑量成正相關(guān)，接種第2天后與時(shí)間成負(fù)相關(guān)，結(jié)果見表5?？傮w來看當(dāng)柚皮揮發(fā)油濃度在低于500 μg/mL時(shí)抑菌活性不突出，對(duì)菌絲生長的抑制率大部分均低于50%，但1 000 μg/mL及以上濃度處理則表現(xiàn)出較好的抑菌活性，2 000 μg/mL處理在接種后不同時(shí)間對(duì)菌絲生長的抑制率均為100.00%，與其它各處理在P<0.05水平上均差異顯著。

3.4 柚皮揮發(fā)油中主要單體化合物抑菌活性

柚皮揮發(fā)油中兩種相對(duì)含量較高的化學(xué)成分是檸檬烯(73.68%)和月桂烯(14.64%)，為明確這兩種主要成分的抑菌活性，進(jìn)行了檸檬烯和月桂烯對(duì)灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性和熏蒸活性的測定。

3.4.1 檸檬烯的接觸抑菌活性

接種后不同時(shí)間檸檬烯對(duì)灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如表6所示。

表6 接種后不同時(shí)間檸檬烯對(duì)灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性

試驗(yàn)結(jié)果表明，檸檬烯對(duì)灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性與處理劑量成正相關(guān)，接種第2天后與時(shí)間成負(fù)相關(guān)，結(jié)果見表6?？傮w來看檸檬烯對(duì)灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性較低，活性最高的為接種后第2天的2 000 μg/mL處理，其對(duì)菌絲生長的抑制率也僅為54.11%，其余各處理的抑菌活性均低于50%。125 μg/mL及以下處理的抑菌活性與空白對(duì)照相比，在P<0.05水平上無顯著差異。

3.4.2 檸檬烯的熏蒸抑菌活性

接種后不同時(shí)間檸檬烯對(duì)灰葡萄孢菌的熏蒸抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如表7所示。

試驗(yàn)結(jié)果表明，檸檬烯對(duì)灰葡萄孢菌的熏蒸抑菌活性與處理劑量成正相關(guān)，接種第2天后與時(shí)間成負(fù)相關(guān)，結(jié)果見表7。總體來看當(dāng)檸檬烯濃度在低于500 μg/mL時(shí)抑菌活性較低，對(duì)菌絲生長的抑制率大多低于50%。1 000 μg/mL及以上濃度處理則表現(xiàn)出較好的抑菌活性，2 000 μg/mL處理在接種后不同時(shí)間的菌絲生長抑制率均為100.00%。各處理的抑菌活性與空白對(duì)照相比，在P<0.05水平上均差異顯著。

表7 接種后不同時(shí)間檸檬烯對(duì)灰葡萄孢菌的熏蒸抑菌活性

檸檬烯接觸和熏蒸兩種不同處理方法對(duì)病原菌菌絲生長的抑制活性熏蒸處理的要高于接觸處理的抑制活性。

3.4.3 月桂烯的接觸抑菌活性

月桂烯對(duì)灰葡萄孢菌接種后不同時(shí)間的接觸抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如表8所示。

表8 接種后不同時(shí)間月桂烯對(duì)灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性

試驗(yàn)結(jié)果表明，月桂烯對(duì)灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性與處理劑量成正相關(guān)，接種第2天后與時(shí)間成負(fù)相關(guān)?？傮w來看，月桂烯對(duì)灰葡萄孢菌的接觸抑菌活性比較低，2 000 μg/mL處理2天時(shí)的菌絲生長抑制率也僅為51.02%，其余處理的抑菌率均低于此值。大部分處理的抑菌效果與空白對(duì)照相比，在P<0.05水平上均無顯著差異。

3.4.4 月桂烯的熏蒸抑菌活性

月桂烯對(duì)灰葡萄孢菌接種后不同時(shí)間的熏蒸抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如表9所示。

表9 接種后不同時(shí)間月桂烯對(duì)灰葡萄孢菌的熏蒸抑菌活性

續(xù)表9(Continued Tab.9)

濃度Concentration(μg/mL)菌絲生長抑制率Mycelial growth inhibition (%)1天2天3天4天5天6天50082.43±5.09d53.02±2.93e36.01±1.66d27.32±3.46e19.50±3.19d13.58±3.10c1 000100.00±0.00e64.45±2.30f50.38±2.51e38.23±0.99f26.98±2.00e20.75±0.45d2 000100.00±0.00e100.00±0.00g88.84±1.47f80.00±1.23g70.11±1.35f60.79±0.69eCK0.00a0.00a0.00a0.00a0.00a0.00a

試驗(yàn)結(jié)果表明，月桂烯對(duì)灰葡萄孢菌的熏蒸抑菌活性與處理劑量成正相關(guān)，接種第2天后與時(shí)間成負(fù)相關(guān)?？傮w來看月桂烯濃度在1 000 μg/mL及以下時(shí)抑菌活性較低，對(duì)菌絲生長的抑制率大多低于50%，62.5與125 μg/mL兩個(gè)處理間在P<0.05水平上無顯著差異，但濃度為2 000 μg/mL的處理則表現(xiàn)出較好的抑菌活性。

4 結(jié)論

現(xiàn)有研究結(jié)果表明，植物揮發(fā)油是一個(gè)由多種揮發(fā)性化學(xué)成分組成的復(fù)合體系，其中萜類、酚類、醇類、醛類和芳香化合物是植物揮發(fā)油的重要成分。很多單萜(monoterpene)和倍半萜(sesquiterpene)類化合物在植物與病原菌的互作中，具有較強(qiáng)的生物活性和重要的生態(tài)功能，其中有的化合物在抑制果蔬采后致病微生物方面具有重要的研究價(jià)值。

植物病原菌的侵染和危害，是加速采收后果蔬腐爛最重要的致腐因子，利用植物揮發(fā)油進(jìn)行果蔬采后抑菌防腐，國內(nèi)外學(xué)者做過很多研究[17-19]。Nengguo等[20]認(rèn)為蕓香科有些植物的揮發(fā)油能抑制某些果蔬的采后病害。Nengguo等的研究結(jié)果表明，柑橘揮發(fā)油對(duì)水果的重要致病真菌意大利青霉菌(Penicilliumitalicum)和指狀青霉菌(P.digitatum)具有顯著的抑菌活性。本研究結(jié)果表明，柚皮揮發(fā)油對(duì)果蔬采后重要致病真菌灰葡萄孢菌的菌絲生長具有明顯的抑菌活性。柚子與柑橘同為蕓香科植物，本研究結(jié)果印證了Nengguo Tao等的觀點(diǎn)。

圖3 柚皮揮發(fā)油及其主要化學(xué)成分對(duì)灰葡萄孢菌處理后6天的熏蒸抑菌效果示意圖Fig.3 Antifungal activity of essential oil and its chemical compositions vapour against B.cinerea after 6 days exposure注：A-柚皮揮發(fā)油；B-檸檬烯；C-月桂烯。Note:A-Essential oil from C.maxima peel;B-Limonene;C-Myrcene.

本研究結(jié)果表明，柚皮揮發(fā)油中共有8個(gè)主要化學(xué)成分，其中含量最高的是檸檬烯天開始，柚皮揮發(fā)油和檸檬烯的抑菌效果顯著強(qiáng)于月桂烯。柚皮揮發(fā)油和檸檬烯1 000 μg/mL處理表現(xiàn)出較好的抑菌活性，2 000 μg/mL處理在接種后不同時(shí)間的菌絲生長抑制率均為100.00%，抑菌活性極顯著優(yōu)于同等劑量的月桂烯。因此，可以推測檸檬烯是柚皮揮發(fā)油中的主要抑菌活性成分。柚皮揮發(fā)油、檸檬烯和月桂烯1 000 μg/mL接種后6天對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌活性結(jié)果，如圖3所示。

用同一種有抑菌活性的揮發(fā)性化學(xué)成分熏蒸和接觸處理靶標(biāo)病原菌，不同處理方式間的抑菌活性可能會(huì)有較大差異[10]，本研究的結(jié)果也證明了這種現(xiàn)象。柚皮揮發(fā)油在同等劑量下接觸和熏蒸處理灰葡萄孢菌，其抑菌活性表現(xiàn)出很大差異，熏蒸處理的抑菌活性顯著高于接觸處理，且各處理的抑菌活性與處理時(shí)間成反比(圖4)。關(guān)于同等用藥劑量下為什么熏蒸處理的抑菌活性遠(yuǎn)高于接觸處理，筆者認(rèn)為熏蒸處理揮發(fā)性抑菌活性成分通過空氣與菌體全方位接觸，使藥效得到充分發(fā)揮，而接觸處理菌體僅有接觸培養(yǎng)基的部分才能受藥，藥效不能得到充分發(fā)揮。由于兩種給藥處理方法病原菌受藥的面積相差較大，從而導(dǎo)致抑菌活性出現(xiàn)較大差異。

圖4 柚皮揮發(fā)油不同處理方法對(duì)灰葡萄孢菌的熏蒸抑菌效果(1 000 μg/mL)Fig.4 Antifungal activity of essential oil with different treatment methods against B.cinereaafter 6 days exposure (1 000 μg/mL)

綜上所述，柚皮揮發(fā)油對(duì)灰葡萄孢菌具有顯著的抑菌活性，其主要化學(xué)成分是檸檬烯和月桂烯等8種揮發(fā)性有機(jī)化合物，其中含量最高的是檸檬烯(73.68%)和月桂烯(14.64%)。根據(jù)本研究的結(jié)果推測，檸檬烯是柚皮揮發(fā)油的主要抑菌活性成分。柚皮揮發(fā)油和檸檬烯單體化合物對(duì)灰葡萄孢菌熏蒸處理的抑菌活性顯著高于接觸處理，且各處理的抑菌活性與處理時(shí)間成反比。

致病真菌侵染是導(dǎo)致果蔬采后腐爛的重要因素，探尋可替代化學(xué)合成殺菌劑用于果蔬采后抑菌防腐的天然產(chǎn)物，對(duì)保障食品安全和公眾健康，具有極其重要的意義。我國柚子種植分布廣泛種植面積較大，因此柚皮資源豐富。本研究證明在離體條件下，柚皮揮發(fā)油對(duì)灰葡萄孢菌具有顯著的抑菌活性，下一步可在此基礎(chǔ)上通過深入研究，探討柚皮揮發(fā)油用于番茄灰霉病等由灰葡萄孢菌所致果蔬采后重要病害防控的可能性。