王青霞，李建穎，程 瑤，白金金，羅雨家，高偉健

天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院 天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家級(jí)食品與藥品實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，天津 300134

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)為茄科枸杞屬[1]，其果實(shí)中富含花青素[2,3]，花青素在自然界中與糖以糖苷鍵的形式結(jié)合形成花色苷，賦予自然界五彩斑斕的顏色[4]?；ㄉ疹?lèi)化合物能夠以完整的糖苷形式從消化道內(nèi)進(jìn)入血漿[5,6]，且具有抗氧化活性[7,8]。

花色苷的傳統(tǒng)提取方法有溶劑萃取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、酶法等[9]。其共同點(diǎn)是方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，提取時(shí)間長(zhǎng)，提取率低。隨著儀器技術(shù)的進(jìn)步，高效溶劑萃取法因其萃取時(shí)間短、效率高、對(duì)有效成分破壞少而深受歡迎，但其在花色苷提取上的應(yīng)用鮮少[10]。高效溶劑萃取技術(shù)是利用隨溫度變化的情況下，擴(kuò)散度隨溫度的升高而增加、粘度隨溫度的升高而降低、表面張力隨溫度升高而降低、溶解度隨溫度升高而升高，從而加速溶解過(guò)程；同時(shí)在高壓下使溶劑保持液態(tài)并快速充滿(mǎn)萃取罐。本研究采用高效溶劑萃取法，旨在尋求高效、適用于黑果枸杞花色苷的提取方法。

黑果枸杞顏色的變化是由多種復(fù)雜的因素造成的，花色苷的種類(lèi)和含量不同會(huì)影響其顏色穩(wěn)定性?；ㄉ诊@色是因?yàn)槠渑浠幸粋€(gè)π-電子共軛體系(發(fā)色團(tuán))，可吸收特定波長(zhǎng)的光而被激發(fā)顯色，配基上的羥基和甲氧基(助色團(tuán))本身無(wú)色，但與發(fā)色團(tuán)相互作用，從而影響顏色[11]。黑果枸杞中的花色苷不穩(wěn)定，極易受到溫度、pH等因素的影響[12,13]，多數(shù)穩(wěn)定性研究都是以花色苷的含量為指標(biāo)，而在實(shí)際的加工與儲(chǔ)存過(guò)程中，顏色通常被視為一個(gè)重要的質(zhì)量指標(biāo)，為了將這一指標(biāo)更加精準(zhǔn)化和數(shù)字化，采用分光測(cè)色計(jì)測(cè)定顏色數(shù)值的變化，為進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果枸杞干果(產(chǎn)自寧夏)；純水(實(shí)驗(yàn)室自制)；無(wú)水乙醇(德國(guó)默克公司)；鹽酸、磷酸氫二鈉、檸檬酸(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；氯化鉀(天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；冰乙酸(天津大學(xué)科威公司)；無(wú)水乙酸鈉、硅藻土(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

HPSE Gemini型高效溶劑萃取儀(北京萊伯泰科公司)；DK-8AS型電熱恒溫水浴鍋(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；AX224ZH型分析天平(奧豪斯儀器有限公司)；ST3100型pH計(jì)(奧豪斯儀器有限公司)；UV-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；DH-101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；RV10DIGITAL型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)IKA公司)；VaCo2-Ⅱ型真空冷凍干燥機(jī)(德國(guó)ZIRBUS公司)；CM-5型分光測(cè)色計(jì)(柯尼卡美能達(dá)公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

將黑果枸杞置于37 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中，烘干24 h，粉碎，過(guò)60目篩，冷藏備用。

pH 1.0的緩沖溶液配制：0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl=25∶67，V/V，用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定，并調(diào)整至1.0。pH 4.5的緩沖溶液配制[14]：0.2 mol/L NaAc∶0.2 mol/L HAc=1∶1，V/V，用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定，并調(diào)整至4.5。

pH 2.5的緩沖溶液配制：0.2 mol/L Na2HPO4∶0.1 mol/L 檸檬酸=13∶180；pH 4.0的緩沖溶液配制：0.2 mol/L Na2HPO4∶0.1 mol/L 檸檬酸=77∶123；pH 6.0的緩沖溶液配制：0.2 mol/L Na2HPO4∶0.1 mol/L 檸檬酸=84∶49；pH 8.0的緩沖溶液配制：0.2 mol/L Na2HPO4∶0.1 mol/L 檸檬酸=390∶11；V/V，用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定并調(diào)整。

1.2.2 總花色苷提取得率測(cè)定

采用pH示差法測(cè)定總花色苷的含量，測(cè)量提取液的體積V，取兩份1 mL提取液于具塞試管中，并分別用pH 1.0和pH 4.5緩沖液梯度稀釋100倍，混勻，于40 ℃恒溫水浴鍋中平衡40 min，以提取溶劑作對(duì)照進(jìn)行相應(yīng)處理。待平衡結(jié)束后，分別測(cè)其在530 nm和700 nm下的吸光度。原pH示差法以矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)，但研究表明黑果枸杞中不含矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷，錦葵色素-3-葡萄糖苷含量較高，因此，以錦葵色素-3-葡萄糖苷作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照[15]，調(diào)整pH示差法計(jì)算公式為[16]：

總花色苷提取率(%)=([A530-A700]pH1.0-[A530-A700]pH4.5×Mw×DF×V/ε×L×m)×100%

式中：A530波長(zhǎng)為530 nm處的吸光度；A700波長(zhǎng)為700 nm處的吸光度；Mw錦葵色素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量，493.2 g/mol；DF稀釋倍數(shù)，100；V提取液的體積；ε摩爾消光系數(shù)，29 600 L/(mol·cm)；L光程厘米數(shù)，1 cm；m原料的質(zhì)量，5.0 g。

1.2.3 總花色苷提取工藝

高效溶劑萃取儀運(yùn)行前連接氮?dú)猓獨(dú)廨敵鰤毫?.8 MPa，進(jìn)行密封性測(cè)試，稱(chēng)取5.0 g黑果枸杞粉，稱(chēng)取12.0 g硅藻土，將黑果枸杞粉與硅藻土混合均勻，裝入34 mL萃取罐中，壓實(shí)；以水和乙醇為萃取溶劑，設(shè)置溫度、乙醇濃度(乙醇與水的比例)、時(shí)間、壓力和循環(huán)次數(shù)等條件后開(kāi)始運(yùn)行，靜態(tài)萃取過(guò)程可連續(xù)進(jìn)行多次，注入溶劑與沖洗所用溶劑總體積隨著循環(huán)次數(shù)的增加而增加。

靜態(tài)萃取過(guò)程：黑果枸杞萃取罐→注入溶劑→升溫升壓→靜態(tài)萃取→沖洗萃取后基質(zhì)(沖洗體積為罐體體積60%)→吹掃樣品

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 靜態(tài)萃取溫度對(duì)提取效果的影響

固定乙醇濃度70%，靜態(tài)萃取壓力8 MPa，靜態(tài)萃取時(shí)間4 min，循環(huán)次數(shù)2次，分別考察靜態(tài)萃取溫度為35、40、45、50、55 ℃對(duì)提取效果的影響。

1.2.4.2 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

固定靜態(tài)萃取溫度50 ℃，靜態(tài)萃取壓力8 MPa，靜態(tài)萃取時(shí)間4 min，循環(huán)次數(shù)2次，分別考察乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%對(duì)提取效果的影響。

1.2.4.3 靜態(tài)萃取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

固定乙醇濃度70%，靜態(tài)萃取溫度50 ℃，靜態(tài)萃取壓力8 MPa，循環(huán)次數(shù)2次，分別考察靜態(tài)萃取時(shí)間為2、3、4、5、6 min對(duì)提取效果的影響。

1.2.4.4 靜態(tài)萃取壓力對(duì)提取效果的影響

固定乙醇濃度70%，靜態(tài)萃取溫度50 ℃，靜態(tài)萃取時(shí)間4 min，循環(huán)次數(shù)2次，由于儀器限制壓力范圍，分別考察靜態(tài)萃取壓力為6、7、8、9、10 MPa對(duì)提取效果的影響。

1.2.4.5 循環(huán)次數(shù)對(duì)提取效果的影響

固定乙醇濃度70%，靜態(tài)萃取溫度50 ℃，靜態(tài)萃取壓力8 MPa，靜態(tài)萃取時(shí)間4 min，分別考察循環(huán)次數(shù)為1、2、3、4、5次對(duì)提取效果的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken設(shè)計(jì)方案，通過(guò)方差分析與模型建立，確定最優(yōu)提取條件。選擇靜態(tài)萃取溫度、乙醇濃度和靜態(tài)萃取時(shí)間三個(gè)因素，以花色苷提取得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)[17,18]。因素水平表見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平

1.2.6 顏色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按最佳提取條件提取得到黑果枸杞提取液，設(shè)置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀溫度為45 ℃，將提取液濃縮至近干，轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機(jī)專(zhuān)用物料盤(pán)中，-80 ℃下預(yù)凍24 h，真空冷凍干燥48 h，得到黑果枸杞提取物。稱(chēng)取2.5 g黑果枸杞提取物用純水或緩沖液定容至250 mL，分別考察溫度(4、20、40 ℃)、pH(2.5、4.0、6.0、8.0)對(duì)其顏色穩(wěn)定性的影響。

使用分光測(cè)色計(jì)測(cè)定顏色，光源為D65，觀測(cè)角度10°。采用液體測(cè)量模式，儀器需用純水進(jìn)行校正，每組樣品測(cè)兩次，求平均值。其中L*代表亮度，純水L*值為100，a*值為正代表紅色，為負(fù)代表綠色，b*值為正代表黃色，為負(fù)代表藍(lán)色，△E*值表示顏色的變化程度[19]。本實(shí)驗(yàn)以純水做空白校正和對(duì)照，測(cè)定樣品的L*、a*、b*、△E*值，當(dāng)△E*的變化值大于3.5時(shí)肉眼可見(jiàn)[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 靜態(tài)萃取溫度對(duì)提取效果的影響

靜態(tài)萃取溫度對(duì)提取效果的影響如圖1所示。隨著溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，花色苷溶出到溶劑中，進(jìn)而使得花色苷提取得率升高，但當(dāng)溫度達(dá)到45 ℃后，隨著溫度的升高，花色苷提取得率反而下降，是由于花色苷易受到溫度的影響，溫度升高會(huì)使花色苷結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而使得花色苷提取得率降低，因此選取45 ℃為最佳靜態(tài)萃取溫度。

圖1 靜態(tài)萃取溫度對(duì)提取效果的影響Fig.1 Effect of static extraction temperature on extraction

2.1.2 靜態(tài)萃取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

不同的靜態(tài)萃取時(shí)間對(duì)提取效果的影響如圖2所示。隨著靜態(tài)萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，花色苷提取得率呈上升趨勢(shì)，但靜態(tài)萃取時(shí)間超過(guò)4 min，花色苷提取得率呈下降趨勢(shì)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，花色苷受溫度影響的時(shí)間也隨之加長(zhǎng)，導(dǎo)致花色苷提取得率下降，因此最佳靜態(tài)萃取時(shí)間為4 min。

圖2 靜態(tài)萃取時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.2 Effect of static extraction time on extraction

2.1.3 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

不同乙醇濃度對(duì)黑果枸杞花色苷提取的影響如圖3所示。根據(jù)相似相溶原理，隨著乙醇濃度的升高，花色苷提取得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明黑果枸杞中花色苷的極性強(qiáng)于乙醇，比水的極性弱，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，利于花色苷的溶出，因此最佳乙醇濃度為60%。

圖3 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction

2.1.4 靜態(tài)萃取壓力對(duì)提取效果的影響

靜態(tài)萃取壓力對(duì)黑果枸杞提取效果的影響如圖4所示。隨著壓力的升高，花色苷提取得率略微上升，說(shuō)明壓力的增大能夠加速溶質(zhì)的傳質(zhì)速率，加快花色苷的溶出，從而提高提取效率，但當(dāng)壓力超過(guò)8 MPa后，壓力升高，花色苷提取得率略微下降，說(shuō)明在此高壓狀態(tài)下，花色苷結(jié)構(gòu)會(huì)遭到一定程度的破壞，因此采用壓力8 MPa。

2.1.5 循環(huán)次數(shù)對(duì)提取效果的影響

循環(huán)次數(shù)對(duì)黑果枸杞提取效果的影響如圖5所示。隨著循壞次數(shù)的增加，黑果枸杞中的花色苷溶出至溶劑中，但循壞次數(shù)超過(guò)3次后花色苷提取得率呈下降趨勢(shì)，原因是升溫升壓的時(shí)間不可忽略，并

圖4 靜態(tài)萃取壓力對(duì)提取效果的影響Fig.4 Effect of static extraction pressure on extraction

且循環(huán)次數(shù)增加導(dǎo)致溶劑體積增加，因而提取液中花色苷濃度降低，花色苷分子之間的共軛作用減弱，花色苷會(huì)發(fā)生部分降解，因此循環(huán)2次最佳。

圖5 循環(huán)次數(shù)對(duì)提取效果的影響Fig.5 Effect of the number of cycles on extraction

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2(Continued Tab.2)

序號(hào)No.A 靜態(tài)萃取溫度Static extraction temperature(℃)B 乙醇濃度Ethanol concentration(%)C 單次萃取時(shí)間A single extraction time(min)花色苷提取得率Anthocyanin extraction rate(%)120-1-11.802130002.070140002.031151-101.8551610-11.81517-1101.868

2.2.2 方差分析

運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行方差分析，顯著性結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型的方差分析

注：**表示在1‰水平顯著；*表示在5%水平顯著。

Note:**indicates significant at 1‰ level;*means significant at the 5% level.

經(jīng)回歸擬合，得到花色苷提取得率與各因素變量二次多元回歸模型為：

Y=2.05-0.028A-0.016B+0.021C-0.051AB-0.028AC-0.006 6BC-0.13A2-0.11B2-0.10C2

由回歸方程可反映出各因素對(duì)提取液花色苷提取得率的影響程度，分析一次項(xiàng)系數(shù)可得到，影響提取液花色苷提取得率的因素主次順序?yàn)椋篈(靜態(tài)萃取溫度)>C(靜態(tài)萃取時(shí)間)>B(乙醇濃度)。該模型P<0.000 1，表明該模型是有意義的，失擬項(xiàng)P=0.416>0.05不顯著，模型R2=98.22%，表明此模型擬合程度好，使用該回歸方程來(lái)預(yù)測(cè)真實(shí)情況是可行的。

圖6 溫度與乙醇濃度對(duì)花色苷提取得率的交互作用Fig.6 Effect of interaction between temperature and ethanol concentration on the anthocyanin extraction rate

圖7 溫度與靜態(tài)萃取時(shí)間對(duì)花色苷提取得率的交互作用Fig.7 Effect of interaction between temperature and static extraction time on the anthocyanin extraction rate

圖8 乙醇濃度與靜態(tài)萃取時(shí)間對(duì)花色苷提取得率的交互作用Fig.8 Effect of interaction between ethanol concentration and static extraction time on the anthocyanin extraction rate

圖6所示為固定靜態(tài)萃取時(shí)間為零水平，溫度與乙醇濃度對(duì)花色苷提取得率的交互作用，隨著溫度的升高和乙醇濃度的增大，花色苷提取得率都呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。圖7所示為固定乙醇濃度為零水平，隨著溫度的升高以及靜態(tài)萃取時(shí)間的延

長(zhǎng)，花色苷提取得率也呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。圖8所示為固定溫度為零水平，隨著乙醇濃度的增大與靜態(tài)萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，花色苷提取得率也呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。兩因素的交互作用對(duì)花色苷提取得率的影響整體趨勢(shì)與單因素實(shí)驗(yàn)基本相符。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)回歸方程求解，在試驗(yàn)范圍內(nèi)最佳提取條件為：溫度48.15 ℃，乙醇濃度58.95%，提取時(shí)間4.02 min，在此條件下提取液的花色苷理論提取得率為1.989%?？紤]到實(shí)際，將其校正為溫度48 ℃，乙醇濃度60%，提取時(shí)間4 min。在此條件下進(jìn)行三組平行試驗(yàn)，提取得到的總花色苷的提取得率為1.973%±0.015%，結(jié)果與預(yù)測(cè)值基本相符，證明了該模型的有效性。

2.3 顏色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 溫度對(duì)顏色穩(wěn)定性的影響

由圖9可以看出，當(dāng)黑果枸杞花色苷溶液保存溫度為20 ℃時(shí)，隨著時(shí)間的推移，a*值變大，向紅色方向移動(dòng)，b*值波動(dòng)較小，且處于藍(lán)色方向，△E*值波動(dòng)幅度最大，且2天后△E*值的變化值大于3.5，可通過(guò)肉眼觀察到顏色的變化；當(dāng)保存溫度為40 ℃時(shí)，a*值變小，紅色變淡，但幅度較小，b*值由負(fù)方向漸漸向正方向移動(dòng)，藍(lán)色漸漸變?yōu)辄S色，△E*值的變化值4天后超過(guò)3.5，顏色變化肉眼可見(jiàn)。當(dāng)保存溫度為4 ℃時(shí)，a*、b*和△E*值相對(duì)穩(wěn)定，10天內(nèi)顏色變化不明顯，表明4 ℃利于黑果枸杞花色苷溶液的保存。

圖9 溫度對(duì)黑果枸杞花色苷顏色穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of temperature on the color stability of anthocyanins from L.ruthenicum

2.3.2 pH對(duì)顏色穩(wěn)定性的影響

由圖10可以看出，當(dāng)黑果枸杞花色苷溶液pH值為2.5時(shí)，a*值較大且非常穩(wěn)定，溶液顏色偏紅，b*值與△E*值也較穩(wěn)定；當(dāng)溶液pH值為4.0時(shí)，a*值變小，紅色變淡，b*值由負(fù)方向漸漸向正方向移動(dòng)，藍(lán)色漸變?yōu)辄S色，△E*值的變化值2天后超過(guò)3.5，顏色變化肉眼可見(jiàn)；當(dāng)溶液pH值為6.0時(shí)，a*值大幅減小，紅色變淺，9天后b*值向正方向過(guò)渡，變?yōu)辄S色，△E*在前2 h變化極大，肉眼可觀察到顏色變化；當(dāng)溶液pH值為8.0時(shí)，a*值由正方向變?yōu)樨?fù)方向，說(shuō)明紅色漸漸向綠色方向過(guò)渡，b*值由負(fù)方向漸漸向正方向移動(dòng)，藍(lán)色漸變?yōu)辄S色，△E*值變化迅速，肉眼可見(jiàn)顏色變化。表明堿性條件下不利于黑果枸杞花色苷溶液的保存，溶液pH值為2.5時(shí)其穩(wěn)定性最好，利于保存。

圖10 pH對(duì)黑果枸杞花色苷顏色穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of pH on the color stability of anthocyanins from L.ruthenicum

3 結(jié)論

本研究采用高效溶劑萃取法提取黑果枸杞中花色苷，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，得到最佳提取條件：溫度48 ℃，乙醇濃度60%，提取時(shí)間4 min，靜態(tài)萃取壓力8 MPa，循環(huán)2次，在此條件下，花色苷提取得率為1.989%，與傳統(tǒng)提取工藝相比，該提取工藝所需時(shí)間短，效率高。顏色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明酸性條件和低溫條件有助于黑果枸杞花色苷溶液的保存，其最適保存溫度為4 ℃、pH值為2.5，為其以后加工與貯藏提供理論依據(jù)。