金 鑫，熊 川，黃文麗，陳祖琴，李 萍，張 利，朱 宇*

1四川省農(nóng)業(yè)科學院生物技術核技術研究所，成都 610061；2阿壩州林業(yè)科學技術研究所，汶川 623000

靈芝是我國一種重要的傳統(tǒng)食藥用真菌，具有廣泛的藥理活性，已被大量研究證明其具有調節(jié)免疫、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老等功效[1-6]，而發(fā)揮這些功效的主要成分為靈芝多糖。硒是人體必需的微量營養(yǎng)元素，能夠增強機體的抗氧化能力，抵抗有關疾病的發(fā)生，然而硒不能由機體自主合成，只能從體外攝取，人體攝入的有機硒主要是硒蛋白和硒多糖[7]。大量的研究表明靈芝具有較強的富硒能力[8,9]，靈芝菌絲體通過富硒發(fā)酵培養(yǎng)，將靈芝多糖與人體必需微量元素硒進行一定程度的螯合，進而結合成為靈芝多糖有機硒化合物，從而更容易被人體吸收[10,11]，以達到二者共同促進的作用，對人體健康具有重要保健作用。富硒發(fā)酵培養(yǎng)是將無機硒轉化為有機硒的有效方法之一，從營養(yǎng)學和微生物代謝角度考慮，通過微生物轉化作用得到的靈芝富硒多糖，具有生物利用率高、生理藥理功效更優(yōu)、安全、無毒副作用等特點，因此，富硒靈芝的研究具有重要的現(xiàn)實意義。

本研究以美國大靈芝(Ganodermaoregonense)作為載體，無機硒亞硒酸鈉作為硒源，通過優(yōu)化培養(yǎng)基碳源、氮源和亞硒酸鈉濃度進行微生物富硒發(fā)酵，并在富硒發(fā)酵過程中初步探析發(fā)酵液胞外酶活性變化，最后提取菌絲體硒多糖，研究其抗氧化活性。本研究獲得的硒多糖將靈芝與硒功效融合于一體，發(fā)揮了硒和靈芝固有的以及協(xié)同的生理作用，具有極大的食用價值，為富硒靈芝產(chǎn)品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

2 材料方法

1.1 材料

美國大靈芝(G.oregonense)菌株由四川省農(nóng)業(yè)科學院生物技術核技術研究所現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究室保存。馬鈴薯、玉米粉、麩皮，市購；亞硒酸鈉、葡萄糖、瓊脂粉、H2SO4、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙醇、Tris-HCl、DPPH、過氧化氫、硫酸亞鐵銨、Vc、鄰苯三酚、磷酸鹽緩沖液、NaOH、水楊酸、HCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4等均為分析純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 靈芝菌株的提純和復壯[12]

靈芝提純培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)，土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、玉米粉10 g、麩皮50 g、青岡樹皮100 g。水1 000 mL，pH自然。靈芝復壯培養(yǎng)基：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、玉米粉10 g、麩皮50 g、青岡樹皮100 g、干靈芝子實體50 g。水1 000 mL，pH自然，分別制作斜面試管和平板。

將實驗室保存的靈芝菌種用接種鉤接入提純培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)，當斜面菌絲生長到一半后，挑選生長快而健壯的試管，取菌絲的尖端部位菌絲體移接到復壯培養(yǎng)基中，同樣28 ℃恒溫培養(yǎng)，當復壯培養(yǎng)基中斜面菌絲生長到一半后，挑選生長快而健壯的試管，取菌絲的尖端部位菌絲體移接到復壯培養(yǎng)基的平板中間，28 ℃恒溫培養(yǎng)，菌絲長滿待用。

1.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化培養(yǎng)正交試驗

發(fā)酵培養(yǎng)基條件為：溫度28 ℃，搖床轉速180 rpm[13,14]。分別以葡萄糖、馬鈴薯、可溶性淀粉為A變量；蛋白胨、玉米粉、麩皮為B變量；5、10、15 mg/L的Na2SeO3為C變量。選定適當水平，設計L9(33)進行正交試驗(見表1)，進行正交實驗，以生物量、硒含量、富硒率為指標，對富硒靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)原料進行優(yōu)化。每組試驗設置3個重復，250 mL容量錐形瓶每瓶裝培養(yǎng)基150 mL，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后，每瓶接種3塊直徑5 mm的靈芝菌種，然后置于28 ℃恒溫振蕩箱中，以180 rpm 轉速振蕩培養(yǎng)15天。

表1 因素水平表

1.2.3 生物量測定

參考Jiang[15]，并做適當修改，在培養(yǎng)的第15天，將靈芝菌絲發(fā)酵液經(jīng)5 000 rpm離心10 min，去除上清液，菌絲體用去離子水震蕩洗滌后再離心去上清液，重復操作，直至上清液不再帶有發(fā)酵液顏色為止，收集菌體，置于烘箱內45 ℃烘干至恒重。以菌絲得率代表生物量，計算公式如下：生物量(g/L)=[(菌絲干重/g)/(發(fā)酵液體積/mL)]×1 000。

1.2.4 菌絲體硒含量測定

菌絲體硒含量測定參照GB 5009.93-2017中電感耦合等離子體質譜法。富硒率(%)=(菌絲體硒含量×菌絲體干重)/培養(yǎng)基中所添加硒量。

1.2.5 菌絲體胞外酶活性測定

在液體培養(yǎng)開始的第3天開始每隔2天吸取發(fā)酵液5 mL，在4 ℃下5 000 rpm離心10 min，得上清液即為粗酶液，連續(xù)測定5次。過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)嚴格按照試劑盒說明書的方法測定酶活性。試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2.6 菌絲體粗多糖含量測定

熱水浸提法提取菌絲體粗多糖：稱取冷凍干燥粉碎后的靈芝菌絲體樣品5 g，加入90 mL的去離子水，置于250 mL錐形瓶中，在90 ℃的水浴鍋中恒溫水浴180 min，5 000 rpm離心10 min后，留下上清液，殘渣重復浸提1次，離心后，合并上清液，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至20 mL下，加3倍體積的無水乙醇進行醇沉，4 ℃靜置過夜，沉淀物用無水乙醇洗2次后，置于45 ℃烘箱中烘至恒重，即得粗多糖。粗多糖得率=(粗多糖質量/菌絲體質量)×100%。將粗多糖用無菌蒸餾水配制成1 mg/mL的樣品溶液，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[16]。

1.2.7 粗多糖體外抗氧化活性測定

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2007 軟件計算平均值和標準偏差。采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差和相關性分析。

2 結果

2.1 靈芝菌絲體富硒培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交實驗

生物量是反映靈芝菌絲生長狀況的重要指標，硒含量是反映靈芝菌絲對硒的吸收能力，富硒率是反映靈芝菌絲吸收的硒總量與培養(yǎng)基中添加的亞硒酸鈉中的硒總量之比，表2是正交試驗的結果，并以富硒率計算極值，從表2中可以看出，在碳源因素水平上分析，其(K2與(K1和(K3之間存在顯著差異(P<0.05)，(K2最優(yōu)；從氮源因素水平上看，其(K3與(K1和(K2之間存在顯著差異(P<0.05)，(K3最優(yōu)；從Na2SeO3濃度水平因素上看，其(K1與(K2和(K3之間存在明顯顯著差異(P<0.05)，(K1最優(yōu)。因此，試驗優(yōu)化得到的靈芝菌絲體富硒培養(yǎng)條件方案為：A2B3C1，即培養(yǎng)基中優(yōu)選20%馬鈴薯，2%麩皮，濃度為5 mg/L Na2SeO3，該試驗組生物量最大為3.86 g/L，硒含量也最高為0.576 mg/g，富硒率同樣最高為44.47%。

從圖1中可以看出，靈芝菌絲體的生長性狀存在一定的差異，第1組、第8組、第6組，其Na2SeO3濃度為5 mg/L時發(fā)酵液菌絲球顏色為白色，菌絲球數(shù)量較少，但直徑較大；第2組、第4組、第9組，其Na2SeO3濃度為10 mg/L時，其菌絲球邊緣顏色為白色，里面則帶著淺紅色，細小菌絲球較多；第3組、第5組、第7組，其Na2SeO3濃度為15 mg/L時，其細小菌絲球邊緣顏色為白色，但直徑較大點的菌絲球變?yōu)樯罴t色，可見，隨著Na2SeO3濃度的增加，菌絲球顏色逐漸加深，Na2SeO3對菌絲的影響程度遠遠大于碳源和氮源的影響。

表2 正交試驗結果

續(xù)表2(Continued Tab.2)

組別Group因素FactorABC生物量Biomass (g/L)硒含量Selenium content (mg/g)富硒率Selenium enrichment rate (%)83213.20±0.05b0.542±0.001a34.6993322.79±0.01c0.465±0.001b12.97(K117.40b16.87b37.64a(K220.37a17.14b12.38b(K317.49b21.25a4.25c極差Range8.9313.15100.16

注：不同小寫字母表示不同組間具有顯著差異(P<0.05)，下同。

Note:Different lowercase letters showed significant differences among different groups (P<0.05),the same below.

圖1 靈芝菌絲體生長試驗Fig.1 G.oregonense mycelium growth test

2.2 胞外過氧化物酶活性分析

過氧化物酶是靈芝體內重要的呼吸酶類，其活性高低與酚類物質代謝和植物抗性密切相關，測定靈芝發(fā)酵液內過氧化物酶活性一定程度上能反映其在特定環(huán)境下的適應能力。通過對9組試驗進行過氧化物酶活性測定(見圖2)，發(fā)現(xiàn)過氧化物酶活性處在1.26～12.74 U/mL之間，其中第6組、第8組、第1組其酶活性顯著高于其他組，在培養(yǎng)9天之前，其酶活性都是處于顯著升高態(tài)勢，第9天到第12天處于緩慢上升中，在第12天到第15天酶活性則處于下降趨勢，這三組都為添加5 mg/L濃度的Na2SeO3組。第7組、第2組和第4組，其酶活性在培養(yǎng)第3天到第9天處于緩慢上升中，在第9天到12天其上升趨勢則變大，在第12天到第15天，其酶活性又緩慢下降，該三組中，第7組為添加15 mg/L濃度的Na2SeO3組，第2組和第4組為添加10 mg/L濃度的Na2SeO3組；第9組、第3組和第5組在培養(yǎng)第3天到第15天之間其酶活性整體變化趨勢不大，呈現(xiàn)小幅度的先上升后降低，酶活性較明顯低于其他組，該三組中，第9組為添加10 mg/L濃度的Na2SeO3組，第3組和第5組為添加15 mg/L濃度的Na2SeO3組。通過過氧化物酶活性的測定，發(fā)現(xiàn)Na2SeO3濃度對酶活性的影響明顯大于碳源和氮源，該酶活性變化趨勢同菌絲生長量、富硒率相同。

圖2 靈芝菌絲體發(fā)酵液POD酶活性變化Fig.2 Changes in POD enzyme activity in G.oregonense mycelium fermentation broth

2.3 胞外多酚氧化酶活性分析

PPO是含有銅離子的膜蛋白酶，能導致褐色素的生成，是導致多種食用菌、果蔬損傷后褐變的主要酶類，通過對9組試驗進行多酚氧化酶活性測定(見圖3)，發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶活性處在1.57～13.06 U/mL之間。第1組、第6組、第8組都為添加5 mg/L濃度的Na2SeO3，其酶活性顯著高于其他組，在培養(yǎng)12天之前，其酶活性都是處于顯著升高態(tài)勢，其中第6組呈直線上升，在第12天達到最大值13.06 U/mL，三組試驗在第12天到第15天則處于下降趨勢，總體變化趨勢同過氧化物酶活性變化趨勢相同；第2組、第4組、第5組和第3組，其酶活性在培養(yǎng)第3天到第12天都處于緩慢上升中，在第12天到第15天，其酶活性又緩慢下降，該四組中，第4組和第2組為添加10 mg/L濃度的Na2SeO3，第5組和第3組為添加15 mg/L濃度的Na2SeO3，可見Na2SeO3濃度從5 mg/L提高到10 mg/L時，其酶活性變化較大，明顯受到抑制，在Na2SeO3濃度從10 mg/L提高到15 mg/L時，其酶活性變化較?。坏?組和第7組試驗在培養(yǎng)第3天到第9天之間其酶活性整體變化趨勢較小，呈現(xiàn)小幅度的上升，從培養(yǎng)第9天到第15天，其酶活性變化則逐漸降低，第9組為添加10 mg/L濃度的Na2SeO3，第7組為添加15 mg/L濃度的Na2SeO3。通過多酚氧化酶活性的測定，同樣發(fā)現(xiàn)Na2SeO3濃度對酶活性的影響明顯大于碳源和氮源，可見，在富硒條件優(yōu)化正交試驗中，Na2SeO3濃度起到了主要的控制作用。

圖3 靈芝菌絲體發(fā)酵液PPO酶活性變化Fig.3 Changes in PPO enzyme activity in G.oregonense mycelium fermentation broth

2.4 多糖含量分析

對9組試驗靈芝菌絲進行粗多糖提取，結果見圖4，從圖中可以看出9組試驗粗多糖含量位于2.29%～2.85%之間，含量最高的為第6組，最低的為9組。第1組、第2組、第6組和第8組之間多糖含量差異不顯著(P>0.05)，第3組、4組、5組和第7組之間多糖含量差異同樣不顯著(P>0.05)，第1～8組多糖含量同第9組存在顯著差異(P<0.05)。可見，在富硒靈芝發(fā)酵的條件優(yōu)化正交試驗中，碳源、氮源和Na2SeO3濃度對靈芝菌絲體內的粗多糖含量影響不大，僅從粗多糖含量上難以區(qū)分9組試驗的優(yōu)劣，必須對粗多糖進行進一步研究。

圖4 靈芝菌絲體粗多糖含量比較Fig.4 Comparison of crude polysaccharide content in G.oregonense mycelium

2.5 不同組別靈芝菌絲粗多糖對DPPH的清除率

9組試驗其粗多糖的DPPH清除率范圍在69.57%～87.25%之間，見圖5，而Vc的DPPH清除率達到96.93%，Vc陽性對照與9組試驗其清除率存在顯著差異(P<0.05)。在9組試驗的DPPH清除率中，第1組、4組、6組、8組其清除率要高于其他組，且存在顯著差異(P<0.05)，這4組試驗中，第1組、6組、8組分別為不同的碳源和氮源，難以篩選出最優(yōu)的碳源和氮源，但卻存在相同的Na2SeO3濃度，為5 mg/L，第4組Na2SeO3濃度為10 mg/L；第2組、第3組、第5組和第9組粗多糖對DPPH的清除率之間不存在顯著差異(P>0.05)，這四組中，第2組和第9組Na2SeO3濃度為10 mg/L，第3組和第5組Na2SeO3濃度15 mg/L，第7組的清除率最低，與其他組都存在顯著差異(P<0.05)，第7組Na2SeO3濃度為15 mg/L?？傮w上可以看出，Na2SeO3濃度為5 mg/L時，其試驗組粗多糖的DPPH清除率明顯高于其他組，該結果同發(fā)酵液胞外酶活性趨勢相同。

圖5 不同組靈芝菌絲體粗多糖對 DPPH 的清除能力Fig.5 DPPH scavenging capacity of crude polysaccharides from different groups of G.oregonense mycelia

2.6 不同組別靈芝菌絲體粗多糖對超氧自由基清除能力比較

9組試驗其粗多糖的超氧自由基清除率范圍在39.74%～68.58%之間，見圖6，最高的組別為第8組，最低組別為第3組，而Vc的超氧自由基清除率達到99.54%，Vc陽性對照與9組試驗其清除率存在顯著差異(P<0.05)。在9組試驗的超氧自由基清除率中，第1組、6組、和8組其清除率要高于其他組，與其他組存在顯著差異(P<0.05)，這三組試驗中，分別為不同的碳源和氮源，其Na2SeO3濃度則相同，均為5 mg/L；第2組、第4組、第5組、第7組和第9組其粗多糖對超氧自由基的清除率，其相互之間不存在顯著差異(P>0.05)，這五組中，第2組、第4組和第9組其Na2SeO3濃度為10 mg/L，第5組和第7組Na2SeO3濃度15 mg/L。從9組試驗中可以看出，Na2SeO3濃度為5 mg/L時，其試驗組粗多糖的超氧自由基清除率明顯高于其他組，高濃度的Na2SeO3對粗多糖的抗氧化活性起到了抑制作用，該結果同DPPH清除率趨勢相同。

圖6 不同組靈芝菌絲體粗多糖對超氧自由基的清除能力Fig.6 Scavenging capacity of crude polysaccharides from different groups of G.oregonense mycelia to superoxide free radicals

2.7 不同組別靈芝菌絲體粗多糖對羥自由基清除能力比較

9組試驗其粗多糖的羥自由基清除率范圍在22.92%～52.62%之間，見圖7，最高的組別為第6組，最低組別為第3組，而Vc的羥自由基清除率達到95.28%，Vc陽性對照與9組試驗其清除率存在顯著差異(P<0.05)。在9組試驗的羥自由基清除率中，第1組、6組、和8組其清除率要高于其他組，與其他組存在顯著差異(P<0.05)，這三組試驗中，分別為不同的碳源和氮源，其Na2SeO3濃度則相同，均為為5 mg/L；第2組、第4組、和第9組其粗多糖對羥自由基的清除率，其相互之間不存在顯著差異(P>0.05)，這三組中，第2組、第4組和第9組其Na2SeO3濃度為10 mg/L；第5組和第7組羥自由基清除率不存在顯著差異(P>0.05)，但與第3組存在顯著差異(P<0.05)，這三組試驗其Na2SeO3濃度15 mg/L。從9組試驗中同樣可以看出，Na2SeO3濃度為5 mg/L時，其試驗組粗多糖的羥自由基清除率明顯高于其他組，高濃度的Na2SeO3對粗多糖的抗氧化活性起到了抑制作用，該結果同DPPH清除率和超氧自由基清除率趨勢相同。綜合9組試驗其菌絲體粗多糖對DPPH 清除率、超氧自由基清除率和羥自由基清除率結果可得出，Na2SeO3濃度對抗氧化活性的影響遠遠大于不同的碳源和氮源對其的影響，第6組試驗其抗氧化能力表現(xiàn)最好，該結果同菌絲體生物量、富硒率以及胞外酶活性結果相同。

圖7 不同組靈芝菌絲體粗多糖對羥自由基的清除能力Fig.7 Scavenging ability of crude polysaccharides from different groups of G.oregonense mycelia to hydroxyl radicals

2.8 線性相關性分析

從表3中可以看出，生物量、硒含量、富硒率、粗多糖、胞外酶活性、以及抗氧化活性之間的相關性均為正向相關。其硒含量與生物量存在顯著相關性；富硒率與生物量和硒含量存在極顯著相關性，相關系數(shù)在0.8以上；粗多糖含量與生物量和硒含量以及富硒率存在極顯著相關性，同樣相關系數(shù)均在0.8以上；胞外酶POD和PPO與硒含量和富硒率存在極顯著相關性，相關系均達到0.9以上，與粗多糖在存在顯著相關性，POD和PPO相互之間也存在極顯著相關性；菌絲粗多糖的抗氧化活性與硒含量、富硒率均存在顯著相關性，而與生物量的相關系數(shù)較低，可見，硒含量和富硒率越高其粗多糖的抗氧化活性就高，而菌絲生物量多其抗氧化活性則不一定高。

表3 靈芝菌絲胞外酶活性、抗氧化活性與菌絲生長之間的線性相關分析

注：**P<0.01;*P<0.05。

3 討論

3.1 富硒靈芝發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗分析

適合靈芝菌絲體生長的碳源有葡萄糖、乳糖、馬鈴薯、淀粉等，適合的氮源有硫酸銨、蛋白胨、豆粕粉、玉米粉、麩皮、酵母粉等，富硒源有活化硒礦、亞硒酸鈉等。對于富硒靈芝發(fā)酵條件篩選，前人做了大量的研究，集中于發(fā)酵過程中不同培養(yǎng)條件如溫度、pH等和培養(yǎng)基中不同的氮源、碳源以及外源硒等對菌絲體生物量和多糖產(chǎn)量的影響。Guo等[7]對富硒靈芝的碳源、氮源和亞硒酸鈉濃度做了篩選，結果表明以4%葡萄糖和20%馬鈴薯為碳源，以1%蛋白胨為氮源，濃度為0.01%的亞硒酸鈉為最優(yōu)條件；Chen[18]通過響應面分析得出靈芝深層培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基組成為葡萄糖2.13%、麩皮汁3.96%，菌絲體中總硒含量在150 μg/g以上，富硒率最高達到55%。Chen[19]通過正交實驗確定兩種菌種液態(tài)發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組成為酒糟80 g/L、麩皮7.5 g/L、豆粕粉10 g/L、葡萄糖5 g/L，該條件下紅芝菌生長較快，長勢較好；Xu等[20]以靈芝胞內多糖得率為指標，優(yōu)化了發(fā)酵碳源、氮源，結果表明添加20%馬鈴薯、3.3%葡萄糖、3%麥麩、0.2% KH2PO4、0.1% MgSO4，其胞內多糖的得率最高。本文在富硒靈芝發(fā)酵條件篩選中，優(yōu)選的碳源為20%的馬鈴薯，氮源為2%的麩皮，該研究結果與前人研究結果較相似，靈芝對碳源的利用較為廣泛，不僅能利用單糖、雙糖，而且也能利用多糖，葡萄糖是靈芝生長較好的碳源，氮源以谷類有機氮源為主。

在富硒靈芝發(fā)酵培養(yǎng)的最適亞硒酸鈉濃度研究上，本文研究富硒發(fā)酵最適添加Na2SeO3為5 mg/L，這與較多研究者不同，例如Dou[21]和Yang[22]研究認為添加1 000 μg/g的亞硒酸鈉靈芝菌絲體富硒率最高；Wang[23]研究認為添加20 mg/L Na2SeO3，其富硒胞外多糖的產(chǎn)量可達到2.84 g/L，生物量為32.26 g/L。研究者得出最適靈芝菌絲生長的不同亞硒酸鈉濃度，可能是由于所使用的靈芝菌種以及菌種活性的不同所導致的，另外本研究在Na2SeO3的無菌處理上采用的無菌濾膜過濾，而其他研究者采用的是高壓滅菌，這也有可能導致研究得出不同的結論。這些研究結果雖然顯示的最適亞硒酸鈉濃度不同，但都表明在適宜的亞硒酸鈉濃度范圍內，低濃度亞硒酸鈉可促進靈芝菌絲體的生長，而隨著硒濃度的升高，則會抑制靈芝菌絲體的生長，硒是細胞內過氧化氫酶等氧化酶活性中心的組成成分，可能正是由于低濃度亞硒酸鈉激活了菌絲體細胞的輔酶而促進菌絲體的發(fā)育，高濃度的亞硒酸鈉則抑制了菌絲體細胞內部分酶的活性[24,25]。

3.2 富硒靈芝發(fā)酵液胞外酶活性分析

靈芝屬于木腐性真菌，在菌絲生長階段和子實體發(fā)育階段，其所需的營養(yǎng)全部由菌絲從外界吸收獲得，而菌絲分解到體外的胞外酶對靈芝吸收營養(yǎng)起著至關重要的作用。靈芝可以向培養(yǎng)基中分泌多種胞外酶，這些胞外酶把營養(yǎng)物質分解成簡單的小分子物質，從而易被菌絲吸收利用。不同的培養(yǎng)基可以誘導靈芝菌絲分泌不同的胞外酶，其胞外酶活性的大小也不相同。He[26]研究了Na2SeO3對靈芝菌絲生長及菌絲生長期間胞外酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)一定濃度的Na2SeO3能促進靈芝菌絲生長和胞外酶活性，高濃度的Na2SeO3可抑制菌絲生長和胞外酶活性；Chen[27]研究發(fā)現(xiàn)在靈芝發(fā)酵過程中胞外酶活力具有較強的階段性，酶活性顯著升高后到平緩到逐漸下降，這些研究與本文的研究結果類似，本研究中發(fā)現(xiàn)胞外酶活性在添加濃度為5 mg/L的Na2SeO3時活性最高，當Na2SeO3濃度提高到10和15 mg/L時，其活性則明顯降低，同時發(fā)現(xiàn)胞外酶活性在從第3天到第9天時逐漸升高，之后則逐漸降低。

3.3 富硒靈芝菌絲粗多糖抗氧化活性分析

靈芝能夠從培養(yǎng)基質中吸收20%～30%的無機硒，并將其中的絕大部分轉化為有機硒，而且，約有40%的有機硒存在于蛋白質中，硒元素可以顯著地提高富硒靈芝中蛋白質組分和硒多糖的抗氧化活性[28]。Du[29]發(fā)現(xiàn)靈芝菌絲體蛋白提取物清除自由基的能力較強，且清除能力與硒含量趨勢相同，Zhou[30]通過富硒靈芝比較體外靈芝硒多糖和普通多糖對自由基的清除率和還原力，發(fā)現(xiàn)靈芝硒多糖對自由基的清除率和還原能力明顯優(yōu)于普通的靈芝多糖，本研究結果同樣顯示靈芝菌絲粗多糖具有較好的抗氧化活性，且隨著Na2SeO3濃度的提高其粗多糖的抗氧化活性逐漸降低。有研究表明硒能提高谷胱甘肽過氧化酶的活性，具有加速分解或去除過氧化脂質作用，保護細胞免遭過氧化作用的損傷，硒與多糖結合后可提高靈芝多糖清除自由基的能力。另有研究表明發(fā)酵液中適宜的硒濃度促進了菌絲體的生長，無機硒進入菌絲后，經(jīng)生物轉化為有機硒，一方面可促進氨基酸和蛋白質的合成，促使氨基酸結合更多的硒[31]，另一方面硒可取代靈芝多糖中甲氧基上的甲基，并以硒氧雙鍵的方式結合，增強了靈芝多糖的活性[32]。然而對于硒多糖的具體作用機理以及無機硒結合多糖的途徑方式還有待進一步研究和探討。

4 結論