王鵬旭，成傳香，賈 蒙，馬亞琴

西南大學柑桔研究所 國家柑桔工程技術研究中心，重慶 400712

近年來，隨著環(huán)境友好型理念的發(fā)展，食品、醫(yī)藥、生物、化工、化妝品等行業(yè)一直在探尋安全、高效的提取方法。在此期間，天然產物的“綠色提取”理念應運而生并逐漸走入大眾視野[1,2]，其原則是通過對提取過程的重新設計優(yōu)化盡可能使提取產量最大化，提取過程清潔化、單元操作最小化，提取產物優(yōu)質化以及環(huán)境污染最小化[1,3]。新興發(fā)展起來的提取技術包括超聲波輔助提取技術[4]，微波輔助提取技術[5]、超臨界二氧化碳提取技術[6]、瞬時控制壓差技術[7]及這些技術的結合使用[8]，可以較好克服傳統(tǒng)提取行業(yè)耗能高、耗時長、污染大、效率低等弊端[9]。超聲波輔助提取技術又由于操作簡單、用途廣泛、投資成本低等優(yōu)勢，不斷被廣泛探究優(yōu)化。

目前，超聲波提取設備主要以水浴式為主[10]，即超聲發(fā)射器先傳遞能量進入溶液后再進入提取容器，此類超聲波提取設備的能量耗散較為嚴重，而且提取效率相對較低。探頭式超聲設備其探頭直接與物料接觸，誘導的大量的空化氣泡相當于無數個小型壓榨機，能有效的瓦解固體物料及細胞組織，促進溶劑滲透、內容物的釋放以及傳質擴散過程。國內外現已有將探頭式超聲波與動態(tài)提取相結合，初步實現設備的中試運行[10]。此外，傳統(tǒng)提取行業(yè)由于有機溶劑的使用，使得提取產物中不可避免地殘留有機溶劑影響其品質，尤其是在精細化工行業(yè)以及制藥行業(yè)，其品質的優(yōu)劣直接影響著人體健康?！熬G色提取”理念則強調以水或臨界水或其他安全無毒的替代溶劑包括超超臨界二氧化碳、甘油、檸檬烯、低共熔溶劑、離子液體等[11-13]。

響應曲面法可以通過對多個變量進行試驗、建模、驗證擬合出變量與響應之間的函數，在各領域的工藝優(yōu)化中得到廣泛應用[14]。由于RSM的優(yōu)化結果可進行可視化分析，因此便于解讀各個參數對多酚產量的影響特征。GA-ANN具有很好的自我學習能力，GA可以對測試誤差計算適應度，使誤差的精度控制在盡可能小的范圍，使ANN的預測結果更加符合期望值，具有很強的魯棒性及全局尋優(yōu)性。因此，本文欲將RSM與GA-ANN聯用，對超聲波細胞粉碎機輔助水提取橙皮多酚的工藝參數進行優(yōu)化，為天然產物的綠色提取提供理論依據及方案支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橙皮、蒸餾水，來自加工中試車間；Folin-酚試劑，重慶鼎國生物技術有限責任公司；沒食子酸，成都化夏化學試劑有限公司；碳酸鈉，重慶川東化工集團有限公司。

1.2 儀器與設備

超聲波細胞粉碎機(JY98-IIIN)、恒溫水浴槽(SDC-6)，寧波新芝生物科技股份有限責任公司；紫外可見分光光度計(TU-1901)，北京普析通用儀器有限責任公司；高速冷凍離心機(TGL-20M)，長沙高新技術產業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限責任公司；漩渦震蕩器(XW-80A)，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 材料預處理

將來自于加工中試車間的橙皮在烘干箱中40 ℃恒溫干燥72 h，然后用粉碎機粉碎，過60目篩(微粒尺寸約0.3 mm)，密封包裝放置于-18 ℃冰箱中保存。

1.3.2 提取程序

取一定量的橙皮粉于定制的夾層反應器中，反應器外接循環(huán)水以控制反應溫度，將超聲波細胞粉碎機探頭插入反應器內。選擇適合200 mL左右樣品量的直徑為15 mm的探頭。探頭表面與液面之間的距離保持為20 mm。反應器內部插入熱電偶溫度計，將實時溫度傳輸于控制面板以檢測溫度的動態(tài)變化。占空比(0.1%～99.9%)可以根據需求調節(jié)，頻率19.5～20.5 kHz，超聲功率120 W。在預試驗基礎上，由于超聲時間對提取產量的影響較為有限，因此選擇超聲時間為5 min。超聲結束后，取出反應液于4 ℃離心機離心，收集上清液并測定吸光度。對照組采用超聲波輔助80%甲醇水溶液提取多酚，其總酚含量為9.67 mg GAE/g。

1.3.3 總酚測定

總酚測定參照Singleton等[15]并稍有改動。取處理后的提取液0.5 mL于25 mL比色試管中并置于暗處，待測試時用水稀釋至10 mL刻度線，搖晃均勻后加入Folin-酚試劑1 mL，并漩渦震蕩1 min，放在避光處靜置5 min，然后再加入5 mL的質量分數為5%的碳酸鈉溶液并用蒸餾水定容至25 mL，放在避光處反應30 min，在760 nm處測定其吸光度。標曲的制作：標準品為沒食子酸，母液濃度為2 mg/mL。分別吸取0、20、40、60、80、100、120、140 μL的母液于比色試管中按上述步驟測定吸光度?？偡雍恳悦靠烁沙绕ぶ械臎]食子酸當量表示(mg gallic acid equivalent/g)(mg GAE/g)。

滾筒直徑應適中，過大則整體結構及料箱高度隨之增大，且滑板伸出長度變短出料效果差；過小則滑板伸出長度過長，轉速高，經過料箱時槽內充料時間縮短，充料不可靠。滾筒的外圓線速度與穴盤的速度應相等，即它們的相對速度為0。本設計中取滾筒旋轉7/8轉覆料1盤，直徑為196mm。

1.3.4 工藝參數篩選

選取溫度、占空比、料液比為目標參數，各個參數的考察水平分別為超聲溫度(25、40、55、70 ℃)，占空比(1/3、1/2、2/2、2/1)，料液比(1/100、1/50、1/33、1/25、1/20 g/mL)。

1.3.5 RSM設計

在篩選后的工藝參數基礎上，以總酚含量為響應值，通過Box-Benhnken(BBD)并結合RSM對工藝參數進行優(yōu)化。其具體因素與水平設計如下表1：

表1 BBD因素與水平編碼

1.3.6 GA-ANN模型構建優(yōu)化

本研究采用多層前饋人工神經網絡，ANN模型3層，以溫度、占空比、料液比作為輸入層神經元，隱含層神經元個數由(1)計算得出。本研究輸入層神經元為4個，輸出層神經元1個，因此隱含層神經元個數為2+c，構建出的神經元拓撲結構大致如下圖1。

(1)

式中：h表示隱含層神經元個數；i表示輸入層神經元個數；o表示輸出層神經元個數；c表示常數，其取值范圍為1≤c≤10。

圖1 ANN的拓撲結構Fig.1 Topological Structure of ANN

采用Levenberg-Marquardt算法作為訓練函數。同時，隱含層激勵函數為tansig，輸出層激勵函數為purelin，學習次數為2 000，學習率為0.1，學習目標為0.000 1。GA優(yōu)化參數為個體數目10，最大遺傳代數100，交叉概率0.7，變異概率0.05。

采用SPSS 22.0進行方差分析(ANOVA)及其顯著性分析，P<0.05表明差異顯著；采用Origin 2017繪圖；RSM優(yōu)化采用Design-expert 8.0；ANN模型的構建與GA優(yōu)化采用Matlab R2017b。模型的評價采用均方誤差(root mean square error，RMSE)、平均絕對誤差(mean absolute error，MAE)、決定系數(R2)三個指標。RMSE和MAE越小，R2越大，表示模型越好。

(2)

(3)

(4)

式中：Yp表示預測值；Ya表示實際值；Ya表示實際值的平均值。

2 結果與分析

2.1 工藝參數篩選

超聲溫度會影響溶質的傳質過程，同時還會影響空化氣泡的數量以及崩塌強度，從而影響提取產量。在占空比2/2，料液比1∶25 g/mL時。由圖2可以看到，總酚含量隨著溫度的增加呈先減少后增加的趨勢，在40 ℃時，其總酚含量最低。這可能是由于隨著溫度的增加，個別多酚類物質發(fā)生了一定程度的降解，同時由于是以水為介質，較低溫度下空化氣泡崩塌誘導水分子均裂產生的羥基自由基較多，攻擊了溶液中的酚類化合物單體,導致其表觀提取產量下降[16]。但是隨著溫度的再次增加(55和70 ℃)可能促進了傳質過程，使得酚類化合物產量再次提升。因此，綜合考慮，選擇40、55、70 ℃作為RSM的考察對象。

圖2 溫度對總酚含量的影響Fig.2 The effects of temperature on total phenolic content

占空比(超聲開啟時間/(超聲開啟時間+超聲停止時間))是超聲波細胞破粉碎機的一個關鍵參數，可以根據物料的質地適當調節(jié)占空比以達到較好的提取效果。在溫度40 ℃，料液比1∶25 g/mL時，圖3展示了占空比對總酚含量的影響。隨著占空比(超聲開啟時間)的增加，總酚含量呈先增加后減少的趨勢，在占空比1/2情況下，其提取產量達到最大值為8.07 mg GAE/g。隨著占空比繼續(xù)的增加，總酚含量顯著降低，在2/1占空比下，總酚含量為6.69 mg GAE/g，相比占空比1/2時減少了17.1%。這充分說明占空比對多酚的提取具有顯著影響。占空比越高，直接作用于介質的有效時間越長，誘導的空化氣泡越多，羥基自由基的產量也越高，雖然能有效瓦解物料組織，但是也容易造成多酚結構的破壞。同時，在工業(yè)上，較低占空比的使用有助于節(jié)省成本[17]。因此，選擇占空比1/3、1/2、2/2作為RSM的優(yōu)化對象。

圖3 占空比對總酚含量的影響Fig.3 The effects of duty cycle on total phenolic content

料液比的選擇直接影響提取產量，同時又是工業(yè)化生產較為重視的參數之一。在超聲溫度40 ℃，占空比2/2條件下，圖4展示了料液比對總酚含量的影響。隨著料液比的增加，總酚含量呈線性增加，料液比為1∶20 g/mL時，總酚含量為8.75 mg GAE/g，相比1∶100 g/mL時的2.46 mg GAE/g，產量增加近乎2.6倍。這些結果說明在超聲參數固定情況下，其釋放的能量較為強大，在料液比大幅度增加時，其能量還可以有效破碎物料組織結構。但是在探究中發(fā)現，料液比為1∶20 g/mL時，由于溶液介質濃度過高，造成超聲探頭發(fā)熱嚴重，釋放的熱量在短時間內局部積累過高，這對于多酚的提取以及探頭都是不利的。因此，選擇料液比1∶50、1∶33、1∶25 g/mL作為RSM的優(yōu)化對象。

圖4 料液比對總酚含量的影響Fig.4 The effects of solid-liquid ratio on total phenolic content

2.2 RSM優(yōu)化及分析

2.2.1 模型建立及分析

天然產物提取的一個重要目標就是盡可能使提取產量最大化并減小對目標提取物的影響，同時避免不理想的降解產物的發(fā)生[18]。由單因素實驗可以明顯看出，較短時間(5 min)，較高溫度，較低占空比和較高料液比是有助于橙皮多酚的提取，這說明各工藝參數之間可能存在交互作用。尋求最優(yōu)工藝參數，是工業(yè)化生產的關鍵。因此以溫度(A)、占空比(B)、料液比(C)為自變量，以總酚含量(Y)為響應值，建立了回歸模型，其方程如下：Y=4.882 41-0.150 31A-5.956 74B+230.225 5C+0.102 94AB+0.167 15AC+5.776 96BC+0.001 645 1A2-0.528 5B2-1 015.466 62C2。

通過對回歸模型進行顯著性分析，如表2所示，P<0.000 1，表明擬合出的模型具有高度顯著性，說明模型可以很好的預測總酚的提取產量。失擬項=0.051 8>0.05，表明所選取的實驗點能用擬合出的函數表示。決定系數R2=0.999 2，表明回歸方程對結果預測的準確度很高。同時，從表2顯著性檢驗一欄可以看到各因素對總酚含量的影響程度，溫度(A)(P<0.000 1)、料液比(C)(P<0.000 1)、溫度與占空比的交互作用(AB)(P=0.000 2)對結果都有極顯著的影響。溫度的平方(P<0.000 1)對結果也有極顯著影響。占空比(B)和料液比平方(C2)(P<0.005)對結果有顯著影響。各工藝參數對總酚產量的影響順序為A>C>B，即溫度>料液比>占空比。

2.2.2 交互作用分析

根據表2以及圖5可以看到，占空比與溫度的交互作用對提取產量有顯著性影響，在較低溫度下(40 ℃)，占空比對酚類化合物的提取幾乎呈負面影響，這與之前的單因素實驗結果基本吻合，說明超聲波細胞粉碎機在以水為介質，低溫度高占空比情況下，短時間內就可以造成所提取出的酚類化合物發(fā)生降解。同時也說明以水為介質情況下，超聲波的聲化學效應是不能被忽略的。Patil等[19]用探頭式超聲波設備提取喜樹堿時發(fā)現高占空會導致提取產量發(fā)生顯著下降。但是，在較高溫度下，占空比對酚類化合物的影響似乎不再顯著。從圖中5(I)可以看出，在溫度(70 ℃)與占空比(2/2)都較高情況下，橙皮多酚的提取產量明顯增加，其曲面由平緩逐漸變得陡峭。這可能是在此過程中，雖然高占空比也造成酚類化合物的降解，但是溫度的增加提升了傳質過程，促進了內容物的釋放。同時，溫度的增加使得溶液粘度和表面張力減小，蒸汽壓力升高，造成更多的蒸汽進入空化氣泡，使得空化氣泡的崩塌強度衰減，羥基自由基的產量降低，一定程度上限制了酚類化合物發(fā)生降解[20]。料液比與溫度(圖5 II)、料液比與占空比(圖5 III)之間的交互作用均不顯著，從圖中可以看出，其曲面近乎呈平滑斜面，說明料液比對提取產量的影響過于顯著，使得溫度與占空比對提取產量的影響在短時間內可以忽略不計。

表2 RSM優(yōu)化模型的方差分析表

注：*P<0.05，**P<0.01。

Note:*P<0.05，**P<0.01.

圖5 操作參數對總酚含量的交互作用Fig.5 Interaction of operating parameters on total phenolic content注：A:溫度；B：占空比；C：料液比。Note:A:Temperature;B:Duty cycle;C:Solid-liquid ratio.

2.2.3 模型驗證

通過對RSM優(yōu)化出的工藝參數(溫度68.60 ℃、占空比2/2、料液比1∶25 g/mL)進行模型驗證，結果顯示，以水為溶劑并在該工藝參數下，總酚含量為8.18 mg GAE/g，較Khan等[21]用80%乙醇從橙皮中回收的總酚含量2.78 mg GAE/g相比，絕對提取量為5.4 mg GAE/g，提取率接近其3倍，表明此種提取方法的高效性以及水提取的可行性。

2.3 GA-ANN模型構建結果及與RSM對比分析

2.3.1 隱含層神經元個數的確定

由于隱含層神經元個數會影響輸出結果的精度，因此初步確定3、4、5、6為隱含層神經元個數。訓練樣本為RSM數據中的75%，驗證樣本為15%，測試樣本為15%，分別計算對比擬合精度，進一步確定隱含層神經元個數。從圖6可以看出，隱含層神經元個數為3時，模型擬合效果最好。

2.3.2 RSM與GA-ANN模型優(yōu)化結果及其分析

從圖7可以看出，在經過60代進化后，其適應度已達到最大值，此時對應的工藝參數為溫度67.546 5 ℃，占空比0.394 0，料液比0.039 8，預測的最優(yōu)產量為8.402 0 mg GAE/g，根據實際將工藝參數調整為溫度67 ℃，占空比1/2，料液比1∶25 g/mL。從表3與表4可以看出，相較于RSM，GA-ANN的RMSE與MAE均小于RSM，但是GA-ANN(0.997 9)的決定系數R2要小于RSM(0.999 2)。對比其預測值與真實值的相對誤差，GA-ANN的準確度要高于RSM。超聲輔助80%甲醇水溶液提取的總酚含量為9.67 mg GAE/g,在此優(yōu)化的條件下，水提取的總酚含量為8.21 mg GAE/g，達到其84%的產量，證明用GA-ANN優(yōu)化工藝參數的可行性。

圖6 不同隱含層數的回歸圖Fig.6 Regression map with different hidden layers注：A：隱含層= 3；B：隱含層=4；C：隱含層=5；D：隱含層=6；Note:A:Hidden layer=3;B:Hidden layer=4;C:Hidden layer=5;D:Hidden layer=6.

3 結論

隨著綠色發(fā)展理念和可持續(xù)發(fā)展理念的貫徹以及消費者對綠色產品的需求，綠色提取技術會步入新的發(fā)展階段，天然產物的綠色提取是基于對提取過程的重新設計，從而減少能源消耗以及有機溶劑的使用，確保提取物的品質和安全。因此，開發(fā)節(jié)能高效的提取過程和安全環(huán)保的提取技術就顯得尤為重要。綠色溶劑的開發(fā)選用及其配套設備的研發(fā)是實現綠色提取的重要環(huán)節(jié)。水作為最環(huán)保的溶劑，如何用水提取使天然產物的產量最大化也是重要的研究課題。本研究將超聲波細胞粉碎機與水結合提取多酚，實現了良好的結果。相較于以80%甲醇水溶液為溶劑，水提取的產量達到了84%的比例。但是，需要注意的是，在提取過程中占空比和料液比的選用至關重要。較高的占空比會造成多酚類物質發(fā)生降解,過高的料液比則會造成料液內部局部溫度過高，影響探頭使用壽命以及多酚穩(wěn)定性。

圖7 適應度曲線Fig.7 Fitness curve

表3 模型評價

表4 RSM與GA-ANN優(yōu)化結果對比及評價

RSM與GA-ANN聯用優(yōu)化的條件為：溫度67 ℃，占空比1/2，料液比1∶25 g/mL，總酚含量為8.21 mg GAE/g，顯著降低了預測值與實際值間的相對誤差。因此，RSM與GA-ANN聯用具有更優(yōu)越的全局尋優(yōu)能力。同時，本研究也證明了超聲波細胞粉碎機輔助水提取多酚的可行性，為天然產物綠色提取的實驗室探索、中試優(yōu)化提供了理論基礎。