任 巧，張 林，劉小慧，蔣 寧，周文霞

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 100850）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，主要發(fā)生于老年人群，臨床主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙，如記憶力減退、失語、失認(rèn)和視空間功能障礙等［1］。AD主要的病理特征是大腦中β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）聚集形成的老年斑、過度磷酸化的tau蛋白聚集而成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)、長期炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)元死亡等［2］。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的巨噬細(xì)胞樣免疫效應(yīng)細(xì)胞，在受損或炎癥反應(yīng)時可被活化。Aβ的異常聚集和沉淀會引起小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，釋放大量神經(jīng)炎癥因子［3］和活性氧（reactive oxygen species，ROS）［4］。近來研究認(rèn)為，Aβ沉積激活小膠質(zhì)細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)是AD患者腦結(jié)構(gòu)改變的特征之一。因此，以小膠質(zhì)細(xì)胞為靶標(biāo)，抑制其激活和炎癥反應(yīng)已成為AD研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。

目前用于AD研究的小膠質(zhì)細(xì)胞主要有永生化小膠質(zhì)細(xì)胞和原代小膠質(zhì)細(xì)胞2種。永生化小膠質(zhì)細(xì)胞雖然具有高度增殖特性，但只能部分模擬AD的病理變化［5］；而原代人小膠質(zhì)細(xì)胞獲取困難，且在體外不能增殖［6］。因此，目前研究AD小膠質(zhì)細(xì)胞的主要阻礙是缺乏足夠的正常和帶有疾病表型的小膠質(zhì)細(xì)胞。人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（human induced plurip?otent stem cells，hiPSC）具有與胚胎干細(xì)胞（embry?onic stem cells，ESC）類似的分化潛能［7］，相較于ESC，hiPSC來源更豐富，攜帶患者的疾病信息［8-9］，而且不涉及倫理學(xué)等問題，因此，hiPSC誘導(dǎo)分化的小膠質(zhì)細(xì)胞（hiPSC-derived microglia-like cell，hiMGL）為研究人員提供了良好的細(xì)胞模型。當(dāng)前hiMGL的研究多集中于誘導(dǎo)分化方法的優(yōu)化及生理狀態(tài)下hiMGL表型的探討［10］，或者選用攜帶致病性基因型突變的hiMGL，研究基因突變對hiMGL表型的影響［11］。但小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)與Aβ清除及神經(jīng)炎癥最為密切相關(guān)的細(xì)胞，探討Aβ對hiMGL表型和功能影響的研究尚未見文獻(xiàn)報道。本研究將認(rèn)知正常老年人（cognitively normal controls，CNC）和AD患者的hiPSC誘導(dǎo)分化為hiMGL，觀察未給予刺激和給予Aβ1-42寡聚體（Aβ1-42-oligome，oAβ）刺激狀態(tài)下對CNC和AD患者來源的hiMGL表型和功能的影響，以及oAβ刺激后的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

mTeSR?1培養(yǎng)基（85850）和造血試劑盒（53100），加拿大Stemcell Technologies公司；小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基（1900），美國ScienCell公司；胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑（41400045）、B27（17504044）、N2（17502048）、谷氨酰胺（35050061）和非必需氨基酸（11140050），美國Thermo Fisher Scientific公司；1-硫代甘油（M175）和Aβ1-42（A9810），美國Sigma公司；四-α-螺旋束細(xì)胞因子（216-MC）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（215-GM）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-34（5265-IL）、轉(zhuǎn)化生長因子 β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）（7754-BH）和類胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）（291-G1）、OX-2膜糖蛋白（OX-2 membrane glycoprotein，CD200）（2724-CD-050）和CX3C趨化因子配體1（C-X3-C motif chemo?kine ligand 1，CX3CL1）（365-FR-025），美國R&D Systems公司；APC抗人CD43（343206）和PE/Cyanine7抗人CD34（343515），美國Biolegend公司；山羊抗離子鈣接頭蛋白分子1（ionized calcium binding adaptor molecule-1，IBA1）（ab5076）多克隆抗體和兔抗跨膜蛋白119（transmembrane protein 119，TMEM119）多克隆抗體（ab185337），美國Abcam公司；山羊抗兔AlexaFluorPlus 488（A32731）和驢抗山羊Alexa Fluor Plus 647（A32849）熒光IgG抗體，美國invitrogen公司；CCK-8試劑盒（CK04），日本同仁化學(xué)研究所；中性紅（71028144），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Aβ1-42ELISA試劑盒（Su-bn10279），北京成志科為生物科技有限公司；ROS檢測試劑盒（S0033S），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑（P1265），北京普利萊基因技術(shù)有限公司；人細(xì)胞因子/趨化因子試劑盒（HCY?TOMAG-60K），美國Millipore公司；六氟異丙醇（H811026），上海麥克林生化科技有限公司。

EnSpire 多功能酶標(biāo)儀（2300），美國 Perki?nElme公司；流式細(xì)胞儀（342975），美國BD公司；LuminexTM 200液相芯片，美國Millipore公司；離心機(jī)（D-37520），德國Heraeus公司；超聲波儀（CH-300），北京創(chuàng)新德超聲電子研究所；酶標(biāo)板振蕩器（ORBIT P4），美國Labnet公司；正置熒光顯微鏡（DM4000B），德國Leica公司。

1.2 細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)

6株hiPSC細(xì)胞系購于上海愛薩爾生物科技有限公司，具體信息見表1。hiPSC用mTeSR?1培養(yǎng)基在37℃，5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換新的培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合率接近70%～80%時傳代。

Tab.1 Demographic information of each human induced pluripotent stem cells（hiPSC）line

1.3 hiPSC誘導(dǎo)分化為hiMGL及細(xì)胞鑒定

按照本研究室前期建立的誘導(dǎo)分化方法［8］，經(jīng)2個步驟將6株hiPSC誘導(dǎo)分化成hiMGL。第一步，按造血試劑盒操作流程將hiPSC分化成造血祖細(xì)胞（hiPSC-derived hemopoietic progenitor cells，hiHPC），并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測表達(dá)hiHPC標(biāo)志物CD34和CD43的陽性細(xì)胞率，以鑒定hiHPC陽性率；第二步，將hiHPC在完全分化培養(yǎng)基〔在小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中額外補(bǔ)充2%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑（V/V）、2% B27（V/V）、0.5% N2（V/V）、一硫代甘油（200 μmol·L-1）、谷氨酰胺（2 mmol·L-1）、非必須氨基酸（100 μmol·L-1）、四-α-螺旋束細(xì)胞因子（25 μg·L-1）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（25 μg·L-1）、IL-34（100 μg·L-1）、IGF-1（25 μg·L-1）和 TGF-β1（50 μg·L-1）〕中培養(yǎng) 23 d，而后更換含CD200和CX3CL1（各100 μg·L-1）的完全分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d，將hiHPC誘導(dǎo)分化成hiMGL，并采用細(xì)胞免疫熒光法檢測表達(dá)hiMGL標(biāo)志物IBA1和TMEM119的陽性細(xì)胞率，以鑒定hiMGL陽性率。

1.4 ooAβ的制備

參照文獻(xiàn)［12］操作流程制備oAβ。向Aβ1-42中加入六氟異丙醇，在室溫下孵育60 min，于冰上放置5 min。將溶液分裝，室溫過夜，儲存于-80℃。使用時加DMSO，水浴超聲溶解。用PBS稀釋后，37℃水浴孵育6 h。4℃，14 000×g離心10 min，將上清液（即oAβ）轉(zhuǎn)移到新管備用。

1.5 CCK-8法檢測hiMGL細(xì)胞存活

分別將2種來源的hiMGL消化后用小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，以每孔2×104細(xì)胞的密度接種于96孔板中，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別將2種來源的hiMGL分為對照組和oAβ組（即CNC hiMGL對照組和AD hiMGL對照組，以及CNC hiMGL oAβ組和AD hiMGL oAβ組），分別加入含溶劑（DMSO 0.02%）或oAβ 1 μmol·L-1的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。而后換不含oAβ的培養(yǎng)基，按試劑盒操作步驟加入10% CCK-8，37℃孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測溶液吸光度（A450nm）值，表示細(xì)胞存活。每次實(shí)驗設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗重復(fù)3次。

1.6 中性紅吞噬實(shí)驗檢測hiMGL吞噬能力

細(xì)胞接種和分組處理同1.7。更換含0.5%中性紅的培養(yǎng)基，37℃孵育30 min，PBS清洗3次。加入無水乙醇及冰醋酸（1∶1）配制的細(xì)胞裂解液，室溫放置2 h。使用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞裂解液A540nm值，表示細(xì)胞內(nèi)中性紅的含量。

1.7 ELISA檢測hiMGL清除oAβ的能力

將hiMGL以每孔5×105的密度接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板并培養(yǎng)24 h。每孔加入oAβ（終濃度1 μmol·L-1）繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，而后更換為不含 oAβ 的培養(yǎng)基。分別于去除oAβ后0，3，6和9 h加入細(xì)胞裂解液，4℃靜置10 min后超聲1 min，4℃、10 000×g離心10 min后取上清，用ELISA試劑盒測定細(xì)胞裂解液中oAβ含量。oAβ清除率（%）=（1-oAβ含量9h/oAβ含量0h）×100%。

1.8 熒光探針法檢測hiMGL內(nèi)ROS水平

細(xì)胞接種和分組處理同1.7。取hiMGL，按照ROS試劑盒操作流程處理，用多功能酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，表示hiMGL內(nèi)ROS水平。

1.9 Luminex法檢測hiMGL分泌細(xì)胞因子的能力

細(xì)胞接種和分組處理同1.7。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)基，300×g離心3 min取上清，按照人細(xì)胞因子/趨化因子試劑盒操作流程進(jìn)行處理，使用Luminex TM 200檢測熒光強(qiáng)度，采用5-參數(shù)邏輯法或spline curve-fitting法計算細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞因子IL-10、IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、CC趨化因子配體7（C-C motif chemokine ligand 7，CCL7）和CXC趨化因子配體10（CXC chemokine ligand 10，CXCL10）的含量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞鑒定

基于課題組前期建立的誘導(dǎo)分化方案，首先將6株hiPSC誘導(dǎo)分化為hiHPC。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，CNC和AD來源的各株細(xì)胞均可表達(dá)hiHPC標(biāo)志物CD34和CD43，且陽性細(xì)胞率均＞90%（圖1A）。hiHPC進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為hiMGL，細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示，6株細(xì)胞均可表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物IBA1和TMEM119（圖1B），陽性細(xì)胞率均＞90%，且CNC hiMGL和AD hiMGL陽性率無明顯差異（圖1C）。

Fig.1 Authentication of human induced pluripotent stem cell（hiPSC）-derived hemopoietic progenitor cells（hiHPCs）and hiPSC-derived microglia-like cells（hiMGLs）.The hiPSCs from cognitively normal controls（CNC）and Alzheimer disease（AD）patients were treated accord?ing to the differentiation protocol［8］ established earlier by our research group.A：flow cytometry was used to detect hiHPCs from CNC and AD patients for hemopoietic progenitor cell-enriched protein CD34 and CD43.B：immunofluorescence label hiMGLs from CNC and AD patients for Ionized calcium binding adaptor molecule-1（IBA1）（red），transmembrane protein 119（TMEM119）（green）and nuclei（blue）on the 38thday respectively.C was the semi-quantitative result of B.hiMGL positive rate was assessed by cellular immunofluorescence of microglial-enriched protein IBA1 and TMEM119.±s，n=3.

2.2 oAβ對CNC hiMGL和AD hiMGL細(xì)胞存活的影響

由圖2所示，在對照組中，AD hiMGL細(xì)胞存活顯著高于CNC hiMGL（P＜0.05）；與各自對照組比較，CNC hiMGL oAβ組細(xì)胞存活增加了（51.6±5.7）%（P＜0.01），AD hiMGL oAβ組細(xì)胞存活增加（62.8±11.2）%（P＜0.01），表明AD hiMGL細(xì)胞存活增加更為明顯；在oAβ組中，AD hiMGL細(xì)胞存活顯著高于CNC hiMGL（P＜0.01）。

Fig.2 Effect of A β1-42-oligome（oAβ）on cell viability of CNC hiMGLs and AD hiMGLs by CCK-8 assay.CNC hiMGLs and AD hiMGLs were treated with oAβ 1 μmol·L-1or vehicle for 24 h，respectively.±s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with CNC hiMGL control group；##P＜0.01，compared with AD hiMGL control group；△△P＜0.01，compared with CNC hiMGL oAβ group.

2.3 oAβ對CNC hiMGL和AD hiMGL吞噬能力的影響

由圖3所示，在對照組中，AD hiMGL對中性紅的吞噬能力顯著高于CNC hiMGL（P＜0.05）；與各自對照組比較，CNC hiMGL oAβ組吞噬能力增加（48.1±2.1）%（P＜0.01），AD hiMGL oAβ組吞噬能力增加（47.2±2.7）%（P＜0.01）。在oAβ組中，AD hiMGL吞噬能力顯著高于CNC hiMGL（P＜0.01）。

Fig.3 Effect of oAβ on phagocytic ability of CNC hiMGLs and AD hiMGLs by neutral red phagocytosis assay.See Fig.2 for the cell treatment.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with CNC hiMGL control group；##P＜0.01，compared with AD hiMGL control group；△△P＜0.01，compared with CNC hiMGL oAβ group.

2.4 oAβ對CNC hiMGL和AD hiMGL ROS水平的影響

由圖4所示，在對照組中，AD hiMGL的ROS水平顯著高于CNC hiMGL（P＜0.05）；與各自對照組比較，CNC hiMGL oAβ組ROS水平增加（140.0±24.7）%，AD hiMGL oAβ組增加（79.8±11.5）%（P＜0.01），CNC hiMGL ROS水平上升更為明顯。在oAβ組中，AD hiMGL的ROS水平仍顯著高于CNC hiMGL（P＜0.01）。

Fig.4 Effect of oAβ on reactive oxygen species（ROS)level of CNC hiMGLs and AD hiMGLs by ROS detection kit.See Fig.2 for the cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with CNC hiMGL control group；##P＜0.01，compared with AD hiMGL control group；△△P＜0.01，compared with CNC hiMGL oAβ group.

2.5 oAβ對CNC hiMGL和AD hiMGL分泌細(xì)胞因子水平的影響

由圖5所示，在對照組中，AD hiMGL分泌5種細(xì)胞因子（IL-10，IL-1β，TNF-α，CCL7和CXCL10）的水平顯著高于CNC hiMGL（P＜0.05，P＜0.01）。與各自對照組比較，CNC hiMGL和AD hiMGL的oAβ 組分泌 IL-10，IL-1β，IL-6，TNF-α，CCL7 和CXCL10的水平均顯著升高（P＜0.01）。在oAβ組中，AD hiMGL分泌6種細(xì)胞因子的水平均顯著高于CNC hiMGL（P＜0.01）。

Fig.5 Effect of oAβ on levels of cyctokines in CNC hiMGLs and AD hiMGLs by Luminex assay.See Fig.2 for the cell treatment.IL：interleukin；CXCL10：CXC chemokine ligand 10；CCL7：CC chemokine ligand 7；TNF-α：tumor necrosis factor-α.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with CNC hiMGL control group；##P＜0.01，compared with AD hiMGL control group；△△P＜0.01，compared with CNC hiMGL oAβ group.

2.6 CNC hiMGL和AD hiMGL對oAβ的清除能力

由圖6所示，終止孵育oAβ后0 h，AD hiMGL內(nèi)oAβ含量高于CNC hiMGL（P＜0.01）（圖6A），表明AD hiMGL吞噬oAβ的能力強(qiáng)于CNC hiMGL；0～3 h，AD hiMGL和CNC hiMGL內(nèi)剩余的oAβ含量無明顯差異；3～9 h，AD hiMGL細(xì)胞內(nèi)剩余的oAβ含量逐漸高于CNC hiMGL（圖6B）；9 h時，AD hiMGL對oAβ的清除率顯著低于CNC hiMGL（P＜0.01）（圖6C），提示AD hiMGL清除oAβ的能力明顯弱于CNC hiMGL。

Fig.6 oAβ clearance ability of CNC hiMGLs and AD hiMGLs by ELISA assay.oAβ content in lysate of hiMGL at different time points after termination of incubation with oAβ.A：experiment flow diagram；B：content of oAβ in CNC hiMGL and AD hiMGL at termi?nation of incubation（0 h）；C：oAβ content in CNC hiMGL and AD hiMGL during 0-9 h；D：oAβ clearance rate of CNC hiMGL and AD hiMGL at 9 h.oAβ clearance rate（%）=［1-（intracellular oAβ content）9 h/（intracellular oAβ content）0 h］×100%.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with CNC hiMGL group.

3 討論

本研究將CNC和AD患者來源的hiPSC誘導(dǎo)分化為hiMGL，觀察oAβ對CNC hiMGL和AD hiMGL表型和功能的影響，及oAβ刺激后2種hiMGL的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)。結(jié)果表明，hiPSC誘導(dǎo)分化得到的hiMGL表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞特征性標(biāo)志物IBA1和TMEM119，且陽性細(xì)胞率＞90%，提示獲得的hiMGL具有小膠質(zhì)細(xì)胞的表型。與各自對照組比較，oAβ刺激組AD hiMGL和CNC hiMGL的細(xì)胞存活、吞噬能力以及細(xì)胞因子分泌能力均明顯增加，且AD hiMGL細(xì)胞存活、吞噬能力以及細(xì)胞因子的分泌能力均顯著高于CNC hiMGL，表明oAβ刺激可引起hiMGL的炎癥反應(yīng)［13-14］，且AD hiMGL的反應(yīng)更強(qiáng)。文獻(xiàn)報道，與正常老年人相比，AD患者腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥基因的表達(dá)普遍上調(diào)［15］，這與本研究結(jié)果一致。

炎癥狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)ROS的主要來源，小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平是衡量腦內(nèi)氧化應(yīng)激程度的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，oAβ刺激組AD hiMGL和CNC hiMGL ROS水平均顯著上升，AD hiMGL的ROS水平顯著高于CNC hiMGL；但oAβ刺激后CNC hiMGL的ROS水平增加程度高于AD hiMGL。文獻(xiàn)報道，Aβ可引起小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)［16］。在AD患者的腦組織中，除自由基在細(xì)胞內(nèi)積累外，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等抗氧化酶的活性或表達(dá)也發(fā)生了變化，且AD患者腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平高于正常老年人，說明氧化應(yīng)激是AD的一個重要病理特征［17-18］。此外，Aβ引起的炎癥反應(yīng)會誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化以及DNA損傷，進(jìn)一步誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡［19-20］。

小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，是AD患者腦內(nèi)清除Aβ的主要參與者［21］。Aβ在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可以經(jīng)再循環(huán)途徑被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，還可以經(jīng)過溶酶體途徑降解，小膠質(zhì)細(xì)胞降解Aβ的能力對Aβ的積聚和沉積至關(guān)重要［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，AD hiMGL吞噬oAβ的能力高于CNC hiMGL，但隨時間推移，AD hiMGL降解oAβ速率明顯減慢。臨床研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦內(nèi)Aβ降解存在障礙，這與小膠質(zhì)細(xì)胞長期處于較高的炎癥環(huán)境下，降低了其Aβ降解酶的表達(dá)水平有關(guān)［23］。

綜上所述，本研究成功將hiPSC誘導(dǎo)分化為hiMGL，獲得的hiMGL具有小膠質(zhì)細(xì)胞的表型；oAβ刺激后，與CNC hiMGL相比，AD hiMGL表現(xiàn)出更強(qiáng)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，且降解oAβ的能力減弱。本研究為后續(xù)應(yīng)用hiMGL進(jìn)行AD病理機(jī)制的研究及抗AD藥物的篩選提供了實(shí)驗依據(jù)。