陳間美,李晉禎,何曉彤,王 玲
(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088)
菠蘿(Ananas comosus),又名鳳梨,含有豐富的糖分、多種維生素和礦物質(zhì),廣泛分布于我國(guó)的廣東、廣西、云南等地。廣東西部的湛江是我國(guó)菠蘿的集中種植區(qū),且產(chǎn)量大、品質(zhì)好。目前,菠蘿加工的主要產(chǎn)品有罐頭、果醬和果汁等,菠蘿在加工的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生高達(dá)50%~60%的菠蘿皮渣。目前菠蘿皮渣僅有一小部分被直接利用作為飼料,絕大部分作為廢物丟棄,既浪費(fèi)資源又對(duì)環(huán)境造成污染[1]。菠蘿皮渣含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵后可以提高其蛋白含量作為動(dòng)物飼料[2]。王玲等人[3]用菠蘿皮渣釀制果醋。Contreras A等人[4]在奶山羊的飼料中添加菠蘿皮渣提取的菠蘿蛋白酶,改善了乳品質(zhì)。梁耀開(kāi)等人[5]發(fā)現(xiàn),菠蘿皮渣混合菌種發(fā)酵可生產(chǎn)出高蛋白的畜禽飼料。葉盛權(quán)等人[6]成功開(kāi)發(fā)出菠蘿皮渣飼料添加劑。
研究旨在對(duì)利用菠蘿皮渣生產(chǎn)出高菌體蛋白飼料進(jìn)行菌種篩選[7-9]和對(duì)其生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化[10-15]。分別以熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、綠色木霉、黑曲霉為出發(fā)菌株對(duì)菠蘿皮渣生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高菌體蛋白飼料進(jìn)行發(fā)酵篩選優(yōu)良菌種;以菠蘿皮渣為主要原料、豆粕和麩皮為輔料制備培養(yǎng)基,分別接入各出發(fā)菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)液,以發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白含量為考查指標(biāo),先進(jìn)行單一菌種的篩選,再將得到的較優(yōu)菌株進(jìn)行混合使用,設(shè)計(jì)一定比例的接種量、料液比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度4個(gè)因素對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化,以發(fā)酵產(chǎn)物的理化品質(zhì)及感官指標(biāo)來(lái)考查[16-18],得到最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件,為利用菠蘿皮渣高效生產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的高菌體蛋白飼料提供試驗(yàn)依據(jù)。
1.1.1 原料與試劑
新鮮菠蘿皮渣,湛江鷹峰食品有限公司提供,于85℃下烘干后粉碎備用,按以下配方做成固體發(fā)酵培養(yǎng)基:菠蘿皮渣(干粉) 70%,麩皮22%,硫酸銨[(NH4)2SO4]3%,尿素[CO(NH2)2]3%,KH2PO42%,料液比為1∶1(V/V)。
1.1.2 菌種
產(chǎn)朊假絲酵母、綠色木霉,廣東省微生物研究所菌種保藏中心提供。
熱帶假絲酵母、黑曲霉,廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。
1.1.3 儀器與設(shè)備
高溫滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、鼓風(fēng)干燥機(jī)、無(wú)菌操作臺(tái)、半微式凱氏定氮儀等。
1.2.1 水分含量的測(cè)定
采用國(guó)標(biāo)GB 5009.3—2016常壓干燥法測(cè)定。
1.2.2 粗蛋白含量測(cè)定方法
采用國(guó)標(biāo)GB/T 6432—2018凱氏定氮方法測(cè)定。
1.2.3 干物質(zhì)得率及粗蛋白得率測(cè)定方法
在115℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中將發(fā)酵產(chǎn)物烘干后進(jìn)行稱質(zhì)量,通過(guò)計(jì)算依次得干物質(zhì)得率、測(cè)蛋白得率。
1.3.1 菌種活化
(1) 產(chǎn)朊假絲酵母活化。首次活化用0.1~0.2 mL的無(wú)菌水溶解凍干管中的凍干粉,接種到2支麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上,于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h;然后將首次活化菌種在麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接活化2次,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
(2) 綠色木霉活化。首次活化用0.1~0.2 mL的無(wú)菌水溶解凍干管中凍干粉,接種到2支馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上,于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d;然后將首次活化菌種在馬鈴薯瓊脂斜面培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接活化2次,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
(3) 熱帶假絲酵母活化。挑取2~3環(huán)實(shí)驗(yàn)室4℃冰箱保存的熱帶假絲酵母接種到2支麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化,于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
(4) 黑曲霉活化。挑取2~3環(huán)實(shí)驗(yàn)室保存的黑曲霉接種到2支馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上,于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 菌種液體種子制備
(1) 產(chǎn)朊假絲酵母菌種液。挑取2環(huán)新鮮活化的產(chǎn)朊假絲酵母到50 mL麥芽汁液體培養(yǎng)基中,在28℃條件下以轉(zhuǎn)速140 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。
(2) 熱帶假絲酵母菌種液。挑取2環(huán)新鮮活化的熱帶假絲酵母到50 mL麥芽汁液體培養(yǎng)基中,在28℃條件下以轉(zhuǎn)速140 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。
(3) 綠色木霉菌種液。挑取2環(huán)新鮮活化的綠色木霉到50 mL馬鈴薯液體培養(yǎng)基中,在28℃條件下以轉(zhuǎn)速140 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。
(4) 黑曲霉菌種液。挑取2環(huán)新鮮活化的黑曲霉到50 mL馬鈴薯液體培養(yǎng)基中,在28℃條件下以轉(zhuǎn)速140 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。
1.3.3 固體發(fā)酵試驗(yàn)
將培養(yǎng)好的液體菌種按設(shè)計(jì)好的接種量接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基中,在一定的環(huán)境條件下進(jìn)行發(fā)酵。
按照固體培養(yǎng)基質(zhì)量的10%分別接入產(chǎn)朊假絲酵母、綠色木霉、熱帶假絲酵母、黑曲霉的液體菌種液到固體培養(yǎng)基中,制成固體發(fā)酵培養(yǎng)物,每個(gè)試驗(yàn)樣品設(shè)置3個(gè)平行組,另外設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照組。在28℃恒溫箱中培養(yǎng),2種酵母菌培養(yǎng)物培養(yǎng)3 d,其余2種霉菌培養(yǎng)物培養(yǎng)4.5 d。培養(yǎng)結(jié)束后,在115℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干發(fā)酵產(chǎn)物,測(cè)定發(fā)酵固體培養(yǎng)物的干物質(zhì)得率、粗蛋白含量,計(jì)算粗蛋白得率后通過(guò)比較篩選得出蛋白質(zhì)產(chǎn)量最高的各菌種。
將篩選出的最優(yōu)單一菌種的菌種液按1∶1體積比混合,接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)物中。設(shè)計(jì)以不同的接種量、發(fā)酵溫度、料液比、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)單因素分別對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。
1.5.1 接種量條件優(yōu)化
設(shè)置5個(gè)接種量梯度6%,8%,10%,12%,14%,其他條件菌保持一致:料液比為1∶1,溫度為28℃,發(fā)酵時(shí)間為72 h。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行組,設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照組。以所測(cè)粗蛋白含量最高對(duì)應(yīng)的參數(shù)為主,以感官指標(biāo)最好對(duì)應(yīng)的參數(shù)為輔,選擇最佳的接種量。
1.5.2 料液比條件優(yōu)化
設(shè)置5個(gè)料液比梯度2∶1,1∶1,1∶2,1∶3,1∶4,其他條件保持一致:接種量為上述選出的最優(yōu)參數(shù),溫度為28℃,發(fā)酵時(shí)間為72 h。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行組。以所測(cè)粗蛋白含量最高對(duì)應(yīng)的參數(shù)為主,以感官指標(biāo)最好對(duì)應(yīng)的參數(shù)為輔,選擇最佳的料液比。
1.5.3 發(fā)酵溫度條件優(yōu)化
設(shè)置5個(gè)溫度梯度26,28,30,32,34℃,其他條件保持一致:接種量及料液比為上述選出的最優(yōu)參數(shù),發(fā)酵時(shí)間為72 h。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行組。以所測(cè)粗蛋白含量最高對(duì)應(yīng)的參數(shù)為主,以感官指標(biāo)最好對(duì)應(yīng)的參數(shù)為輔,選擇最佳的發(fā)酵溫度。
1.5.4 發(fā)酵時(shí)間條件優(yōu)化
設(shè)置5個(gè)溫度時(shí)間72,84,96,108,120 h其他條件保持一致:接種量、料液比、發(fā)酵溫度為上述選出的最優(yōu)參數(shù)。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行組。以所測(cè)粗蛋白含量最高對(duì)應(yīng)的參數(shù)為主,以感官指標(biāo)最好對(duì)應(yīng)的參數(shù)為輔,選擇最佳的發(fā)酵時(shí)間。
采用產(chǎn)朊假絲酵母、綠色木霉、熱帶假絲酵母、黑曲霉這4種菌進(jìn)行單一菌種篩選試驗(yàn),測(cè)定4種單一菌種對(duì)應(yīng)的發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量、干物質(zhì)得率、粗蛋白得率。
單一菌種發(fā)酵產(chǎn)物的各指標(biāo)含量變化情況見(jiàn)表1。
表1 單一菌種發(fā)酵產(chǎn)物的各指標(biāo)含量變化情況
由表1可知,以產(chǎn)朊假絲酵母、綠色木霉、熱帶假絲酵母、黑曲霉4種單一菌種及空白對(duì)照組進(jìn)行固體發(fā)酵,每組設(shè)置3個(gè)平行組,表1中粗蛋白含量、干物質(zhì)得率、粗蛋白得率為3個(gè)平行組的平均值。2種酵母菌(產(chǎn)朊假絲酵母、熱帶假絲酵母)發(fā)酵產(chǎn)物各指標(biāo)情況對(duì)比結(jié)果表明,粗蛋白含量為產(chǎn)朊假絲酵母高于熱帶假絲酵母,干物質(zhì)得率為產(chǎn)朊假絲酵母低于熱帶假絲酵母,粗蛋白得率為產(chǎn)朊假絲酵母高于熱帶假絲酵母,因此生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蛋白能力更強(qiáng)的酵母菌為產(chǎn)朊假絲酵母。2種霉菌(綠色木霉、黑曲霉)發(fā)酵產(chǎn)物各指標(biāo)情況對(duì)比結(jié)果表明,粗蛋白含量為綠色木霉高于黑曲霉,干物質(zhì)得率為綠色木霉低于黑曲霉,粗蛋白得率為綠色木霉高于黑曲霉,因此生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蛋白能力更強(qiáng)的霉菌為綠色木霉。綜合4種菌及對(duì)照組的各指標(biāo)情況可見(jiàn),粗蛋白含量最高的2種菌依次為綠色木霉、產(chǎn)朊假絲酵母,粗蛋白得率最高依次為綠色木霉、產(chǎn)朊假絲酵母。由測(cè)定結(jié)果可知,單一菌種發(fā)酵效果越好,物料中粗纖維、糖類物質(zhì)等被菌種利用轉(zhuǎn)換合成蛋白質(zhì)的程度越高。因?yàn)楫a(chǎn)物的粗蛋白含量越高,干物質(zhì)得率越低,最終的粗蛋白得率就越高。
根據(jù)上述綜合分析,綠色木霉為試驗(yàn)的最優(yōu)菌種,產(chǎn)朊假絲酵母次于綠色木霉,最終確定綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母為試驗(yàn)4種單一菌種中的最優(yōu)菌種。
2.2.1 接種量條件優(yōu)化結(jié)果
按表1結(jié)果選出2種菌種的最優(yōu)菌種分別為綠色木霉及產(chǎn)朊假絲酵母,將綠色木霉及產(chǎn)朊假絲酵母的菌種液按1∶1體積比混合備用。在料液比為1∶1,發(fā)酵溫度為28℃,發(fā)酵時(shí)間為72 h,綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母按1∶1體積比,混合菌種液接種量分別為6%,8%,10%,12%,14%的條件下進(jìn)行菠蘿皮渣的固態(tài)發(fā)酵。
接種量條件優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 接種量條件優(yōu)化結(jié)果
隨著發(fā)酵時(shí)間的推移,菠蘿皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量的高低與菌體接種量、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的水分、溫度、發(fā)酵時(shí)間有著緊密聯(lián)系。在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基含水量、溫度和發(fā)酵時(shí)間一定的情況下,增大菌種接種量有利于提高菌體生長(zhǎng)量,從而提高產(chǎn)品蛋白質(zhì)的含量。
由圖1可知,菌種接種量在6%時(shí)菠蘿皮渣發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量很少,在接種量為10%之前蛋白質(zhì)含量隨著菌種接種量的增加逐漸增加,當(dāng)菌種接種量達(dá)到10%左右時(shí),菠蘿皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)含量達(dá)到了最高水平,繼續(xù)增加接種量,蛋白質(zhì)含量稍有下降但也趨于平穩(wěn),高于10%菌種接種量的發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量沒(méi)有明顯增加,可能與菌種發(fā)酵過(guò)程中從菠蘿皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中獲取的營(yíng)養(yǎng)成分有限有關(guān)。從試驗(yàn)結(jié)果及生產(chǎn)成本角度來(lái)看,在料液比1∶1,發(fā)酵溫度28℃,發(fā)酵時(shí)間72 h的條件下,產(chǎn)朊假絲酵母和綠色木霉按1∶1體積比混合菌種液,接種量10%為最佳的發(fā)酵條件。
2.2.2 料液比條件優(yōu)化結(jié)果
在綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母1∶1體積比混合菌種液,接種量為10%,發(fā)酵溫度為28℃,發(fā)酵時(shí)間為 72 h,料液比分別以 2∶1,1∶1,1∶2,1∶3,1∶4的條件下進(jìn)行菠蘿皮渣固態(tài)發(fā)酵。
料液比條件優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2 料液比條件優(yōu)化結(jié)果
由圖2可知,菠蘿皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中水分含量對(duì)產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量有很大影響,水是微生物生長(zhǎng)必需的生長(zhǎng)條件。在料液比為1∶3之前,蛋白質(zhì)含量隨著水分含量的增加而增加,料液比在1∶3左右蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高水平,料液比1∶3后可能由于水分含量增加對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖起抑制作用,從而使發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量下降。由此可見(jiàn),在工藝生產(chǎn)過(guò)程中,從生產(chǎn)操作、節(jié)約成本角度出發(fā),確定最佳的發(fā)酵料液比為1∶3。
2.2.3 發(fā)酵溫度條件優(yōu)化結(jié)果
在綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母1∶1體積比混合菌種液,接種量為10%,料液比為1∶3,發(fā)酵時(shí)間為72 h,發(fā)酵溫度分別為26,28,30,32,34℃的條件下進(jìn)行菠蘿皮渣固態(tài)發(fā)酵。
發(fā)酵溫度條件優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖3。
由圖3可知,發(fā)酵溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)影響很大,26℃時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量較低,微生物生長(zhǎng)緩慢,固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分的利用率不高,隨著溫度的上升,產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量呈上升趨勢(shì),當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到30℃時(shí)產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高,繼續(xù)提高培養(yǎng)溫度發(fā)酵產(chǎn)物則蛋白含量降低,菌種的發(fā)酵效果降低,這與菌種的生長(zhǎng)受到溫度抑制有關(guān),溫度過(guò)高可導(dǎo)致微生物的死亡。由此可見(jiàn),發(fā)酵溫度控制在30℃左右時(shí)發(fā)酵效果最佳。
2.2.4 發(fā)酵時(shí)間條件優(yōu)化結(jié)果
在綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母1∶1體積比混合菌種液,接種量為10%,料液比為1∶3,發(fā)酵溫度為30℃,發(fā)酵時(shí)間分別為72,84,96,108,120 h的條件下進(jìn)行菠蘿皮渣固態(tài)發(fā)酵。
發(fā)酵時(shí)間條件優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖4。
圖3 發(fā)酵溫度條件優(yōu)化結(jié)果
由圖4可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量增加,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到96 h時(shí)達(dá)到最大值,繼續(xù)增加發(fā)酵時(shí)間,蛋白質(zhì)含量略微下降且逐漸趨于平穩(wěn),導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量下降的原因可能是菠蘿皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中可提供微生物生長(zhǎng)需要的碳源及氮源消耗完了,使最終發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)含量偏低,也可能是由于霉菌發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)后形成了大量孢子,造成了負(fù)面的影響,從而使蛋白質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果偏低。由此可見(jiàn),發(fā)酵時(shí)間在96 h左右的發(fā)酵效果最佳。
經(jīng)過(guò)最佳發(fā)酵條件(綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母1∶1體積比混合菌種液,接種量為10%,料液比為1∶3,發(fā)酵溫度為30℃,發(fā)酵時(shí)間為96 h) 的發(fā)酵,將固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的產(chǎn)品進(jìn)行提取,通過(guò)物理和感官2個(gè)方面的測(cè)定,檢驗(yàn)其品質(zhì)。
發(fā)酵條件優(yōu)化前后發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量對(duì)比見(jiàn)圖5。
發(fā)酵條件優(yōu)化后,測(cè)定優(yōu)化后發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量——利用半微式凱氏定氮法測(cè)定其粗蛋白的含量為20.27%。由圖5可知,蛋白質(zhì)含量從發(fā)酵條件優(yōu)化前(沒(méi)有外加菌種,料液比為1∶1,發(fā)酵溫度為28℃,發(fā)酵時(shí)間為72 h)的4.05%提升到發(fā)酵條件優(yōu)化后的20.27%。
產(chǎn)朊假絲酵母單一菌種的發(fā)酵產(chǎn)物有酸味,氣味不太宜人;產(chǎn)朊假絲酵母單一菌種的發(fā)酵產(chǎn)物有類似啤酒的酒精清香,氣味宜人。綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母種子液1∶1體積比混合發(fā)酵的產(chǎn)物氣味宜人,有菠蘿的芳香。
圖5 發(fā)酵條件優(yōu)化前后發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量對(duì)比
(1)試驗(yàn)通過(guò)對(duì)熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、綠色木霉、黑曲霉4種菌種進(jìn)行單一菌種篩選,測(cè)定其粗蛋白含量、干物質(zhì)得率、粗蛋白得率并進(jìn)行綜合分析,發(fā)現(xiàn)綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母為試驗(yàn)4種單一菌種中的2株最優(yōu)菌種。
(2)在單一菌種篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,繼而進(jìn)行混合菌種對(duì)菠蘿皮渣生產(chǎn)飼料蛋白發(fā)酵工藝優(yōu)化的試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母1∶1體積比混合發(fā)酵菠蘿皮渣生產(chǎn)菌體蛋白飼料的最佳工藝條件為接種量10%,料液比1∶3,發(fā)酵溫度30℃,發(fā)酵時(shí)間96 h。
(3)經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)含量測(cè)定及感官品質(zhì)測(cè)定,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵條件優(yōu)化后產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)和感官都有極大提高,發(fā)酵條件優(yōu)化后菠蘿皮渣發(fā)酵的蛋白質(zhì)含量從4.05%提高到20.27%,可成為畜禽優(yōu)質(zhì)高菌體蛋白飼料。