李 倩 尉立剛 楊鈺昆 李美萍 郭彩霞

(山西大學生命科學學院，山西 太原 030006)

肉與肉制品是人們日常飲食中必不可少的組成部分。中國是肉類生產及消費大國，2018年豬肉產量超過5 400萬t，占肉類總產量的62.7%[1]。低溫凍藏由于經濟性和便捷性，在肉類工業(yè)中應用廣泛[2]。然而，低溫凍藏時肉類營養(yǎng)成分也會發(fā)生改變[3]。

目前，原料肉在貯藏過程中的品質改變已引起國內外相關學者的普遍關注。Vieira等[4]研究發(fā)現，凍藏期間原料肉的色澤改變與脂肪氧化顯著相關。Bustabad[5]研究了凍藏方式對豬肉和牛肉質量損失的影響，結果表明：風冷貯藏的原料肉質量損失最大。潘君慧等[6]對不同方式凍藏原料肉中蛋白氧化及凝膠特性進行研究，結果發(fā)現：凍藏過程中，未真空包裝的原料肉中蛋白質更易氧化，保水能力下降更快。吳亮亮等[7]研究表明，煮制時間對羊肉樣品的剪切力有顯著影響。李升升等[8]研究發(fā)現，隨著牦牛年齡的增加，牦牛肉的食用品質明顯下降。以上研究均表明加工、蒸煮時間和保存方式等對原料肉品質會有不同程度的影響，其原理仍有待探究。已有研究多集中在原料肉凍藏過程中脂肪氧化、凝膠特性及肉類品質等方面，而關于凍藏不同時間的豬肉中肌原纖維蛋白的變化情況及其相關性研究尚未見報道。

試驗擬以新鮮豬肉為原料，-18 ℃下貯藏0，1，4，8，12周，考察凍藏時間對原料肉中蛋白羰基、總巰基、自由氨基、表面疏水性和內源性色氨酸熒光等指標的影響，以期為原料豬肉凍藏過程中理化性質的改變提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

豬里脊肉：市售；

2,4-二硝基苯肼(DNPH)、三氯醋酸(TCA)：分析純，天津市光復精細化工研究所；

5-5'-二硫代二硝基苯甲酸鹽(DTNB)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)：純度≥98%，上海易恩化學技術有限公司；

十二烷基硫酸鈉(SDS，純度95%)、鹽酸胍(純度≥98.0%)、牛血清蛋白(BSA，純度97%)、L-亮氨酸(純度≥98.0%)：北京索萊寶科技有限公司；

1-苯胺基-8-萘基磺酸鹽(ANS)：純度97.0%，上海賢鼎生物科技有限公司；

2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)：純度5%，北京百泰克生物技術有限公司。

1.1.2 儀器與設備

pH計：STARTER2100型，奧豪斯儀器(上海)有限公司；

紫外—可見光譜儀：UV-2550型，日本日立公司；

電子天平：JA1203N型，上海精密科學儀器有限公司；

渦旋混合器：QT-1型，上海琪特分析儀器有限公司；

水浴鍋：HHS-21-6型，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；

攪拌機：MJ-WBL2501B型，廣東美的生活電器制造有限公司；

離心機：HC-3018R型，安徽中科中佳科學儀器有限公司；

熒光分光光度計：LS-55型，珀金埃爾默儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料豬肉的貯藏 將豬里脊肉于4 ℃下剔除肉眼可見的脂肪(白肉)，切割成20 g左右的肉塊，保鮮袋包裝后于-18 ℃冰箱中存放備用。

1.2.2 肌原纖維蛋白的提取 根據文獻[6]修改如下：將1.2.1中原料肉于4 ℃解凍，并分割成均勻的條狀，按1∶4 (g/mL)的比例加入磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，攪拌機中充分攪拌(攪拌4次，停頓3次，每次攪拌15 s，停頓5 s)，于4 ℃、2 000×g離心15 min，棄上清液，重復上述步驟3次，隨后按1∶4 (g/mL)比例加入NaCl溶液(0.1 mol/L)，充分攪拌，調節(jié)pH至6.25，用100目紗布過濾，離心，棄上清液，得肌原纖維蛋白。以牛血清蛋白(BSA)為標準蛋白，利用雙縮脲法對上述肌原纖維蛋白濃度進行測定。

1.2.3 羰基含量的測定 根據文獻[9]修改如下：取800 μL 濃度為20～40 mg/mL的蛋白溶液，加入8 mL DNPH(10 mmol/L)，避光反應1 h，每隔10 min使用渦旋儀均勻樣品。隨后加入8 mL 20% TCA沉淀蛋白。4 ℃、5 000×g離心10 min，棄上清液，加入16 mL洗色液(乙醇與乙酸乙酯體積比1∶1)，搗碎沉淀，靜置10 min。清洗沉淀3次，棄上清液，吹干樣品，加入6 mol/L 鹽酸胍6 mL，于50 ℃水浴30 min，以2 mol/L HCl做空白，370 nm比色。按式(1)計算羰基含量。

(1)

式中：

B——羰基含量，nmol/mg·Pro；

A——吸光度值；

ε——摩爾消光系數，22 400 L/(mol·cm)；

C——蛋白濃度，mg/mL。

1.2.4 總巰基含量的測定 根據文獻[10-11]修改如下：取1 mL蛋白稀釋液于試管中(濃度約為2.0 mg/mL)，加入8 mol/L尿素和3% SDS(以0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液為溶劑)4 mL，充分混勻，隨后加入10 mmol/L DTNB溶液1 mL，渦旋振蕩30 s后室溫避光反應15 min，以磷酸鹽緩沖液做空白，測定412 nm處吸光度值。按式(2)計算總巰基含量。

(2)

式中：

S——總巰基含量，nmol/mg·Pro；

A——412 nm處吸光度值；

D——稀釋倍數；

C——蛋白濃度，mg/mL。

1.2.5 自由氨基含量的測定 根據文獻[12]修改如下：準確吸取0.2 mL蛋白溶液(濃度為4 mg/mL)，依次加入2 mL 1% SDS和1 mL 0.01% TNBS，充分振蕩后，于50 ℃ 水浴30 min(避光)，加入0.1 mol/L Na2SO3溶液2 mL 終止反應，迅速冷卻至室溫，以蒸餾水為空白，420 nm 處比色，通過L-亮氨酸標準曲線(y=1.041x+0.016，R2=0.99)確定樣品中自由氨基含量。

1.2.6 蛋白質疏水性含量的測定 根據文獻[10]修改如下：制備濃度為0.04，0.08，0.15，0.30，0.60 mg/mL的蛋白液(稀釋溶劑為含0.6 mol/L NaCl的0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.25)，取4 mL稀釋液，用稀釋溶劑作為空白，加入20 μL 8.0 mmol/L ANS溶液(溶解于pH 7.0的0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液)，然后渦旋震蕩10 s，避光反應10 min。測定時儀器參數設置為狹縫寬度5 nm，激發(fā)波長392 nm，發(fā)射波長492 nm，并在分析數據的過程中扣除空白對照。用熒光強度對溶液的蛋白濃度作圖后所獲得的斜率來表示表面疏水指數。

1.2.7 內源性色氨酸熒光的測定 根據文獻[13]修改如下：用1.2.6的方法將蛋白溶液濃度稀釋至0.4 mg/mL，利用熒光分光光度計進行測定，儀器參數為狹縫寬度5 nm，激發(fā)波長279 nm，304.5～460.0 nm的發(fā)射光譜。在分析數據的過程中扣除稀釋溶劑的發(fā)射光譜，以排除試驗過程中所產生的干擾。

1.2.8 數據統(tǒng)計分析 所有試驗均平行3次，采用Statistix 9.0軟件進行方差分析和顯著性分析(LSD法)，字母不同表示差異顯著(P<0.05)，使用SPSS 20軟件進行相關性分析。采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 對肌原纖維蛋白羰基含量的影響

由圖1可知，肌原纖維蛋白中羰基含量隨貯藏時間的延長而升高。羰基初始含量為0.25 nmol/mg·Pro，貯藏12周后羰基含量顯著升高(0.56 nmol/mg·Pro)，說明低溫凍藏環(huán)境下，蛋白質氧化程度隨貯藏時間的延長逐漸升高。Lund等[14]研究發(fā)現脂肪氧化所產生的活性氧自由基或氫過氧自由基在一定程度上可誘導蛋白質發(fā)生氧化，導致肉品體系品質下降。因此，低溫凍藏期間原料肉中的脂肪氧化可能是導致肌原纖維蛋白氧化的原因。

圖1 貯藏時間對肌原纖維蛋白中羰基含量的影響Figure 1 Effects of storage time on carbonyls of myofibrillar protein

2.2 對肌原纖維蛋白總巰基含量的影響

由圖2可知，貯藏1周后，總巰基含量顯著下降(P<0.05)。隨著貯藏時間的延長(4，8周)，總巰基含量未見明顯變化。貯藏12周后，總巰基含量下降顯著(P<0.05)，降至(40.93±4.36) nmol/mg·Pro。因此，經12周低溫凍藏后，肌原纖維蛋白中總巰基含量整體呈下降趨勢。Xiong等[15]研究發(fā)現氧化體系中的總巰基可氧化為—S—S—，促使肌原纖維蛋白發(fā)生分子內交聯，導致肌原纖維蛋白質進一步聚集和沉淀，溶解度下降。Morzel等[16]發(fā)現肌球蛋白中總巰基對氧化條件較為敏感，在氧化條件下可轉化為-S-S-，從而誘導蛋白質發(fā)生聚合。因此，隨著凍藏時間的延長，肌原纖維蛋白發(fā)生氧化可能是導致總巰基含量下降的直接原因。

圖2 貯藏時間對肌原纖維蛋白中總巰基含量的影響Figure 2 Effects of storage time on the total sulfhydryl levels of myofibrillar protein

2.3 對肌原纖維蛋白自由氨基含量的影響

由圖3可知，貯藏1周后，自由氨基含量下降，但無顯著性差異(P>0.05)。貯藏12周后自由氨基含量降至63.14 nmol/mg·Pro，下降趨勢顯著(P<0.05)。因此，肌原纖維蛋白中的自由氨基含量隨貯藏時間的延長逐漸降低。李春強等[17]研究發(fā)現，隨著氧化時間和氧化程度的增加，自由氨基和巰基含量顯著降低，而二硫鍵含量顯著增加；SDS-PAGE結果也表明有大量高分子聚集體生成，因此，自由氨基含量下降可能是肌原蛋白氧化導致蛋白質發(fā)生聚集，阻礙了自由氨基的暴露。

圖3 貯藏時間對肌原纖維蛋白中自由氨基含量的影響Figure 3 Effects of storage time on free amines of myofibrillar protein

2.4 對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

由圖4可知，新鮮原料肉中表面疏水性為282.01，貯藏1周后表面疏水性無顯著變化(P>0.05)，貯藏4周后表面疏水性顯著下降(P<0.05)。因此，肌原纖維蛋白中表面疏水性隨貯藏時間的延長整體呈下降趨勢。劉寶華等[18]研究發(fā)現，蛋白氧化程度隨儲藏時間的延長顯著升高，部分蛋白質發(fā)生聚集，疏水性氨基酸被包埋在蛋白質分子內部從而使蛋白質的表面疏水性下降。曹云剛等[13]研究表明，隨著蛋白質氧化程度的加深，肌原纖維蛋白的結構逐漸展開，使得原先存在于蛋白質內部的疏水基團發(fā)生一定程度的暴露，疏水相互作用在一定程度上促使疏水基團聚集，導致蛋白質表面疏水性降低。因此，隨著凍藏時間的延長，蛋白質結構發(fā)生改變，導致蛋白質發(fā)生交聯聚集，可能是肌原纖維蛋白表面疏水性下降的原因。

圖4 貯藏時間對肌原纖維蛋白中表面疏水性含量的影響Figure 4 Effects of storage time on the surface hydrophobicity of myofibrillar protein

2.5 對肌原纖維蛋白內源性色氨酸熒光含量的影響

內源性色氨酸熒光能夠表示蛋白質中氨基酸殘基及其微環(huán)境的變化，進而表征對蛋白結構的影響。由圖5 可知，肌原纖維蛋白中內源性色氨酸熒光含量隨貯藏時間的延長顯著降低。李玲等[19]研究表明：羥自由基氧化可降低內源性色氨酸熒光強度；色氨酸主要存在于蛋白質內部的疏水結構中，由于羥自由基攻擊蛋白質肽鏈，導致肌原纖維蛋白的結構展開，蛋白質分子表面的色氨酸殘基增多，致使被激發(fā)的內源性色氨酸熒光強度降低。因此，內源性色氨酸熒光強度下降可能是由低溫凍藏使蛋白結構展開導致的。

2.6 相關性分析

由表1可知，貯藏時間與羰基含量呈正相關，與總巰基、自由氨基、表面疏水性含量呈負相關，且相關性極顯著(P<0.01)；羰基含量與總巰基、自由氨基、表面疏水性含量極顯著負相關(P<0.01)；總巰基含量與自由氨基含量顯著正相關(P<0.05)；自由氨基含量與表面疏水性含量極顯著正相關(P<0.01)。進一步表明原料豬肉在低溫凍藏過程中，肌原纖維蛋白的氧化程度隨貯藏時間的延長逐漸加深。

圖5 貯藏時間對肌原纖維蛋白中內源性色氨酸熒光含量的影響Figure 5 Effects of storage time on the fluorescence spectroscopy of endogenous tryptophan of myofibrillar protein

表1 各指標相關性分析?Table 1 Correlation analysis of each index

? *表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01。

3 結論

試驗主要研究冷凍貯藏時間對原料豬肉中肌原纖維蛋白氧化程度的影響及其相關性。結果表明：隨著凍藏時間的延長，肌原纖維蛋白中羰基含量逐漸上升，總巰基、自由氨基、內源性色氨酸熒光、表面疏水性含量總體呈下降趨勢。相關性分析表明：隨著冷凍貯藏時間的增加，肌原纖維蛋白的氧化程度加深。因此，即使在低溫凍藏環(huán)境下仍不能阻止原料肉中的肌原纖維蛋白氧化，貯藏時間越長，肌原纖維蛋白氧化程度越深，原料肉品質下降愈明顯。