曹曙光，吳昊，林李淼

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

胃促生長(zhǎng)素（Ghrelin）是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的由28個(gè)氨基酸組成的內(nèi)源性肽，它是生長(zhǎng)激素促分泌物質(zhì)受體（growth hormone secretagogue receptor，GHSR）的內(nèi)源性配體，與GHSR結(jié)合后可產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。在具有促生長(zhǎng)激素（growth hormone， GH）分泌作用的同時(shí)，又具有增強(qiáng)食欲，減少脂肪利用，增加體質(zhì)量[1]，維持能量正平衡和調(diào)節(jié)能量代謝的作用[2]，同時(shí)與調(diào)節(jié)胃排空的激素胃動(dòng)素（Motilin）在結(jié)構(gòu)上具有高度相同性[3]，故其與胃腸道運(yùn)動(dòng)的關(guān)系已引起人們的關(guān)注。本研究旨在觀察不同劑量Ghrelin腹腔注射后大鼠胃排空效應(yīng)，觀察Ghrelin對(duì)食管下括約?。╨ower esophageal sphincter，LES）壓力的影響，同時(shí)測(cè)定血漿中Motilin和P物質(zhì)（Substance P）水平的變化，探討Ghrelin對(duì)LES壓力的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量200～250 g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2015-0001；大鼠Ghrelin購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Motilin和Substance P放免試劑盒由北京?？其J生物技術(shù)中心提供；UPS-2020型低順應(yīng)性毛細(xì)管連續(xù)水灌注測(cè)壓系統(tǒng)（荷蘭MMS公司）；三腔微細(xì)通道測(cè)壓管（美國(guó)Sandhill公司），外徑1.7 mm，內(nèi)徑0.4 mm，各側(cè)孔之間距離均為2.0 mm， 水流的速度為每側(cè)孔0.2 mL/min。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物和分組：Wistar大鼠60只，置于（22± 3）℃室溫下，安靜環(huán)境飼養(yǎng)，晝夜循環(huán)光照，自由飲水、取食，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，禁食24 h、禁水12 h，采用完全隨機(jī)分組方法將大鼠分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，其中實(shí)驗(yàn)組又分為5組，每組10只。另取Wistar大鼠30只，采用完全隨機(jī)分組方法將大鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組15只，實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射Ghrelin 1.5 nmol/kg，對(duì)照組大鼠每天腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1 mL，60 min后，所有大鼠進(jìn)行LES壓力測(cè)定，尾靜脈取血，用放射免疫法測(cè)定血漿中Motilin和Substance P濃度，比較2組間LES壓力和血漿中Motilin和Substance P濃度差異。

1.2.2 半固體糊制備：取5 g羥甲基纖維素溶于125 mL蒸餾水中，然后分別加入8 g奶粉，4 g糖， 4 g淀粉，每次加入攪拌均勻，配成150 mL約150 g的半固體糊[4]，置于冰箱冷藏12 h，使用前2 h取出恢復(fù)至室溫。

1.2.3 大鼠胃排空測(cè)定：5組實(shí)驗(yàn)組大鼠，每組10只，分別接受不同劑量的Ghrelin（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 nmol/kg）腹腔注射，對(duì)照組大鼠接受0.9%氯化鈉溶液1 mL腹腔注射，45 min后所有大鼠半固體糊1.0 mL/只灌胃，灌胃后30 min尾靜脈取血并處死動(dòng)物，打開腹腔，結(jié)扎幽門和賁門，取出胃，用濾紙擦干后稱全重，然后沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內(nèi)容物后擦干，稱凈重。以胃全重和胃凈重之差為胃內(nèi)殘留物質(zhì)量，計(jì)算胃內(nèi)殘留物占所灌半固體糊質(zhì)量百分比為胃內(nèi)殘留率，按下式計(jì)算胃排空率，胃排空率=[1-（胃全重-胃凈重）]×100%。

1.2.4 大鼠血漿Motilin和Substance P測(cè)定：所有大鼠尾靜脈取血放入含EDTA二鈉0.3 μL和抑肽酶1 000 kU的試管中，試管中血液標(biāo)本經(jīng)混勻，低溫離心10 min（3 000 r/min），分離血漿，用放射免疫法測(cè)定血漿中Motilin和Substance P濃度。

1.2.5 LES壓力測(cè)定：食管測(cè)壓采用定點(diǎn)牽拉法（stationary pull-through technique，SPT）確定LES位置，固定測(cè)壓管，應(yīng)用低順應(yīng)性毛細(xì)灌注測(cè)壓系統(tǒng)監(jiān)測(cè)大鼠LES壓力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組間大鼠胃排空比較 對(duì)照組大鼠胃排空率為（27.03±2.91）%，而腹腔注射不同劑量Ghrelin的實(shí)驗(yàn)組大鼠胃排空率為（38.24±7.15）%，明顯大于對(duì)照組，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 Ghrelin對(duì)大鼠胃排空的量效關(guān)系 健康雄性Wistar大鼠小劑量Ghrelin（0.5 nmol/kg）腹腔注射后的胃排空率為（29.78±4.68）%，對(duì)照組為（27.03±2.91）%，2 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），中等劑量及高劑量Ghrelin（1.0、1.5、2.0、2.5 nmol/kg）腹腔注射后胃排空率逐漸增加，分別 為（34.59±4.07）%、 （38.33±4.41）%、 （41.88± 3.94）%、 （46.64±4.14）%，與對(duì)照組比較均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 2 組大鼠LES壓力及血漿中Motilin和Substance P濃度比較 實(shí)驗(yàn)組大鼠LES壓力明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿中Motilin濃度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿中Substance P與 對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1， 提示Ghrelin能增加大鼠LES壓力。Motilin可能參與Ghrelin對(duì)大鼠LES壓力的調(diào)節(jié)。

表1 2組間大鼠LES壓力及血漿中Motilin和Substance P濃度比較（每組n=15，）

表1 2組間大鼠LES壓力及血漿中Motilin和Substance P濃度比較（每組n=15，）

與對(duì)照組比：aP＜0.01

分組 LES壓力（mmHg）Substance P（ng/L）對(duì)照組 13.78±2.29 190.02±18.18 21.18±5.43實(shí)驗(yàn)組 19.57±3.26a 217.28±25.38a 24.36±5.55 Motilin（ng/L）

3 討論

Ghrelin是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的由28個(gè)氨基酸組成的內(nèi)源性肽，具有增強(qiáng)食欲，減少脂肪利用，增加體質(zhì)量，維持能量正平衡的調(diào)節(jié)能量代謝的作用；同時(shí)與調(diào)節(jié)消化道運(yùn)動(dòng)的激素Motilin在結(jié)構(gòu)上具有高度相似性，一些研究已表明Ghrelin有促消化道動(dòng)力作用[5]。近來動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Ghrelin及其激動(dòng)劑作用于嚙齒類動(dòng)物后能加速胃排空[6]，對(duì)術(shù)后梗阻的大鼠模型的胃排空也有促進(jìn)作用[7]，在對(duì)人的研究中亦發(fā)現(xiàn)，Ghrelin能加速正常人胃排空效 應(yīng)[8-9]，同樣對(duì)特發(fā)性胃輕癱和糖尿病胃輕癱患者有促胃排空作用[10]；同時(shí)，Ghrelin也能促進(jìn)小腸及結(jié)腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)作用[11-12]。

本研究結(jié)果顯示，Ghrelin能加速大鼠胃排空，存在一定的量效關(guān)系。小劑量Ghrelin腹腔注射后，胃排空較對(duì)照組有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中、大劑量Ghrelin腹腔注射后胃排空率呈逐漸增加趨勢(shì)。內(nèi)源性Ghrelin能調(diào)節(jié)大鼠及小鼠胃出現(xiàn)III相樣收縮[13]，誘發(fā)胃和十二指腸移行性運(yùn)動(dòng)復(fù)合波III相提前出現(xiàn)，同時(shí)能加強(qiáng)移行性運(yùn)動(dòng)復(fù)合波III相收縮強(qiáng)度。Ghrelin激動(dòng)劑TZP-101 能明顯緩解胃癱患者的惡心和嘔吐癥狀[14]。健康大鼠口服或腹腔注射左旋多巴后，胃排空效應(yīng)明顯受抑制，但Ghrelin能明顯逆轉(zhuǎn)左旋多巴對(duì)大鼠的胃排空抑制作用[15-16]，本研究與上述研究結(jié)果相一致，提示Ghrelin能加速胃排空。

胃食管反流病是消化科常見病，是指胃十二指腸內(nèi)容物反流入食管引起食管黏膜損害，出現(xiàn)燒心和胸骨后不適等癥狀。主要發(fā)病機(jī)制與LES松弛、食管廓清能力下降及反流物對(duì)食管黏膜攻擊作用增強(qiáng)有關(guān)。大量臨床研究已證實(shí)胃排空障礙患者胃酸及胃內(nèi)容物向食管反流明顯增多，可導(dǎo)致胃食管反流病發(fā)病率增加及反流癥狀的加重[17]，促胃動(dòng)力藥物5-羥色胺4受體激動(dòng)劑能明顯改善胃食管反流病患者的癥狀[18]。有研究表明肥胖者胃食管反流病發(fā)病率較非肥胖者有升高，其可能機(jī)制與肥胖者食管酸暴露時(shí)間增加及LES壓力下降有關(guān)[19-20]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin能增加Barrett’s食管風(fēng)險(xiǎn)[21]，Ghrelin可增強(qiáng)食欲，減少脂肪利用，以增加體質(zhì)量，增加胃食管反流病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)Ghrelin有促進(jìn)胃排空，減少胃酸或胃十二指腸內(nèi)容物的反流。目前有關(guān)Ghrelin與胃食管反流病的關(guān)系國(guó)內(nèi)外研究較少。

LES松弛是胃食管反流病的主要發(fā)病機(jī)制，LES的神經(jīng)支配主要來自迷走神經(jīng)，迷走神經(jīng)由興奮性膽堿能和抑制性非腎上腺能非膽堿能神經(jīng)元組成，形成突觸分布介導(dǎo)LES壓力的增加和減低，LES壓力是興奮性和抑制性兩種因素的平衡決定的，此外尚有體液因素參與LES壓力的調(diào)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，Ghrelin腹腔注射能增加LES壓力，腹腔注射Ghrelin后，血漿Motilin濃度較對(duì)照組升高，而Substance P 2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明Motilin可能參與Ghrelin對(duì)大鼠LES壓力的調(diào)節(jié)。Motilin作用于平滑肌上的Motilin受體，導(dǎo)致平滑肌收縮，增加LES壓力；Substance P直接刺激膽堿能神經(jīng)元和作為非膽堿能興奮性神經(jīng)遞質(zhì)作用于LES，使LES壓力增加。Ghrelin作為新發(fā)現(xiàn)的胃腸激素，是否參與LES壓力的調(diào)節(jié)，國(guó)內(nèi)尚無研究。

本研究結(jié)果表明，Ghrelin具有加強(qiáng)胃體收縮，促進(jìn)胃排空，且呈一定的量效關(guān)系，Ghrelin能增加LES壓力，Motilin可能參與Ghrelin對(duì)LES壓力的調(diào)節(jié)，但Ghrelin對(duì)胃排空及LES壓力影響的病理生理學(xué)機(jī)制尚待深入研究揭示。