戴顯寧，童郁，林建萍，施建有，陳璐，許鍇

（溫州市人民醫(yī)院 檢驗科，浙江 溫州 325000）

淋病奈瑟菌（n.gonorrhoeae，NG）又稱淋球菌，為嚴格的人體寄生菌，常寄存于急性尿道炎患者膿性分泌物的白細胞中。而淋球菌性尿道炎（gonococcal urethritis）是由NG感染的一種較常見的性傳播疾病，臨床主要表現(xiàn)以尿道炎多見，典型癥狀是排尿困難、尿頻、尿急、尿痛等。它具有發(fā)病率高、傳染性強、潛伏期短等特點[1-3]。男性在最初發(fā)病時會出現(xiàn)尿道發(fā)癢、微痛、尿道發(fā)紅、變腫、分泌異物等癥狀。有些男性患者發(fā)病期尿道分泌物可能較少或沒有，且病程較長，易造成漏檢[4-5]。 因此建立一種男性NG病原菌快速而準確的檢測方法，對診斷和控制淋病傳播至關重要。恒溫擴增技術（simultaneous amplification and testing，SAT）是近年來發(fā)展起來的一種新型核酸擴增技術，已在腸道病毒、肺炎支原體和結核分枝桿菌的研究中被證實較傳統(tǒng)聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）有更高的靈敏度和特異度，且優(yōu)于其他檢測技術[6]。本研究應用RNA-SAT法、實時熒光定量PCR（real time fluorescence quantitative，F(xiàn)Q-PCR）以及分離培養(yǎng)法檢測322例男性疑似NG感染患者，擬建立從男性尿液樣本中檢測病原菌NG-RNA的方法，用于輔助男性淋球菌性尿道炎的診斷。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2017年6月至2018年6月溫州市人民醫(yī)院男科門診疑似淋球菌性尿道炎患者322例，年齡19～65（37.5±11.2）歲。納入標準：①符合臨床對淋球菌性尿道炎感染的診斷標準[7]；②初次篩查均為首診，且排除1周內已使用相關藥物治療的患者。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 試劑與儀器 RNA-SAT法試劑盒購自上海仁度生物科技有限公司（批號：20180201）；FQ-PCR法試劑盒購自廣州中山達安生物有限公司（批號：2018003）；NG瓊脂平板購自鄭州安圖生物工程股份有限公司（批號：20171011A）。熒光定量PCR儀AB-7500購自美國ABI公司，37 ℃培養(yǎng)箱購自上海躍進醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：尿液采集：留取≥2 h不排尿后的首段尿并取1 mL加至尿液RNA保存液中，用于RNA-SAT檢測。分泌物采集：用無菌棉拭子伸入男性尿道口1～2 cm，旋轉數(shù)周，停留10 s以上，一式三份；一份拭子加1.5 mL 0.9%氯化鈉溶液震蕩洗滌，用于FQ-PCR檢測；一份加至尿液RNA保存液中，用于RNA-SAT檢測；另一份拭子立即接種于專屬淋球菌培養(yǎng)基上。

1.3.2 檢測方法：RNA-SAT檢測：加入RNA模板5 μL 至35 μL反應體系微量管中，置于恒溫金屬浴內 （60 ℃，10 min；42 ℃，5 min），并加入已預熱SAT酶10 μL；ABI-7500熒光定量PCR儀進行恒溫擴增（42 ℃，1 min，40 個循環(huán)）。FQ-PCR檢測：將分泌物樣本用1 mL 0.9%氯化鈉溶液充分洗脫至 1.5 mL EP管中，13 000 r/min離心3 min，取沉淀物加入50 μL DNA提取液，100 ℃煮沸裂解10 min。13 000 r/min離心3 min，取2.5 μL上清液至FQPCR反應液，至ABI-7500 熒光定量PCR儀進行擴增（95 ℃，5 min；95 ℃，30 s，58 ℃，45 s，72 ℃， 1 min，35個循環(huán)；72 ℃，10 min）；NG培養(yǎng)：1 h內接種至NG培養(yǎng)基后，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱，在5%～10% CO2、35～37 ℃、相對濕度80%以上的條件下培養(yǎng)24～48 h。

1.3.3 預后評估：對于NG陽性的患者采用頭孢曲松鈉1.0 g，加1%利多卡因3.5 mL一次肌注，同時給予阿奇霉素1.0 g聯(lián)合用藥。并對其中用藥7 d后臨床癥狀、體征消失且尿常規(guī)白細胞陰性患者采樣復查，比較RNA-SAT法、FQ-PCR法以及分離培養(yǎng)法的陰轉率。

1.4 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。分離培養(yǎng)法是WHO推薦診斷淋菌性尿道炎的首選方法，也是診斷淋病的金標準，故以分離培養(yǎng)法為參考方法[8-9]，計算RNA-SAT、FQ-PCR法檢測NG的靈敏度、特異度、陽性預測值及陰性預測 值。計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。繪制ROC曲線圖，并通過曲線下面積（area under curve，AUC）判斷試驗的準確性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3種不同方法檢測男性NG感染情況 對322例疑似尿道炎患者尿液及拭子樣本分別采用RNA-SAT法、FQ-PCR法以及培養(yǎng)法檢測病原菌NG。NG陽性率最高為尿液RNA-SAT法[35.1%（113/322）]，其次為拭子RNA-SAT法[33.2%（107/322）]、拭子FQ-PCR法[31.4%（101/322）]以及分離培養(yǎng)法[29.5%（95/ 322）]；NG陽性率最低為尿液FQ-PCR法[26.1%（84/ 322）]，見表1。3種尿液檢測方法的陽性率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.312，P＜0.05），而3種拭子檢測方法的陽性率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.039，P ＞0.05）。

2.2 RNA-SAT法和FQ-PCR法檢測NG的方法評價及ROC曲線分析

2.2.1 RNA-SAT法和FQ-PCR法檢測NG的方法評價：以分離培養(yǎng)法作為參考方法，計算RNA-SAT、FQ-PCR法檢測NG的靈敏度、特異度、陽性預測值及陰性預測值，其中尿液RNA-SAT法檢測NG的靈敏度最高，尿液FQ-PCR法的靈敏度最低，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.026，P＜0.01）；特異度則相反，且差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.507，P＜0.05）。拭子RNA-SAT法與拭子FQ-PCR法的靈敏度和特異度差異均無統(tǒng)計學意義（χ2=0.121，P＞0.05；χ2=3.467，P＞0.05）。尿液RNA-SAT法和拭子RNA-SAT法的靈敏度和特異度差異均無統(tǒng)計學意義（χ2=1.205，P＞0.05；χ2=2.752，P＞0.05），見表2。

表1 3種不同方法檢測男性NG感染情況（例）

表2 RNA-SAT法和FQ-PCR法檢測NG的方法評價

2.2.2 ROC曲線分析：根據(jù)靈敏度和特異度繪制ROC曲線，按照AUC為0.7～0.9表示診斷準確度為中等劃分[10-11]，以上檢測方法的診斷準確度均中等偏上。拭子FQ-PCR法（AUC=0.987）＞拭子RNA-SAT法（AUC=0.974）＞尿液RNA-SAT法（AUC=0.960）＞尿液FQ-PCR法（AUC=0.942），見圖1。

圖1 RNA-SAT法和FQ-PCR法檢測NG感染的ROC曲線圖

2.3 NG預后陰轉率評估 對81例NG陽性的患者且用藥7 d后臨床癥狀、體征消失且尿常規(guī)白細胞陰性的患者采樣復查，比較尿液RNA-SAT法、尿液FQPCR法以及分離培養(yǎng)法的陰轉率，三者差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.531，P＞0.05）；同樣比較拭子RNASAT法、拭子FQ-PCR法以及分離培養(yǎng)法的陰轉率，三者差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.933，P＞0.05），見表3。

3 討論

培養(yǎng)法長期以來都是檢測NG的金標準，但由于NG培養(yǎng)條件苛刻，培養(yǎng)時間長以及離體易死亡等因素，不利于NG的快速檢測及早期診斷[12]。因此，目前非培養(yǎng)法越來越多用于NG的診斷。其中RNA-SAT法是將新一代的核酸恒溫擴增技術和實時熒光檢測技術相結合的一種新型核酸檢測技術?；驹硎峭粶囟认?，首先通過M-MLV反轉錄酶產生靶標核酸（RNA）的一個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7 RNA多聚酶從該DNA拷貝上產生多個RNA拷貝；每一個RNA拷貝再從反轉錄開始進入下一個擴增循環(huán)；同時，帶有熒光標記的探針和這些RNA拷貝特異結合，產生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，實時反映擴增循環(huán)情況。該方法具有高靈敏度、高特異度、低污染、反應穩(wěn)定等優(yōu)點[13]。

表3 RNA-SAT法、FQ-PCR法以及分離培養(yǎng)法陰轉率比較

本研究通過對322例疑似尿道炎患者尿液及拭子樣本分別采用RNA-SAT法、FQ-PCR法及分離培養(yǎng)法檢測病原菌NG，結果顯示RNA-SAT法檢測NG陽性率均要高于FQ-PCR法和分離培養(yǎng)法，與國內其他報道[14-15]相近?？赡茉蛞环矫媸荈Q-PCR法采用傳統(tǒng)的煮沸裂解法提取核酸，效率較低，再加上尿液成分中含有較多的PCR反應抑制物，導致FQ-PCR法對尿液不敏感，影響核酸擴增[16]；而分離培養(yǎng)法作為傳統(tǒng)的NG診斷金標準，由于NG對環(huán)境、標本的采集、運送等要求較高，同時還可能因抗生素使用、接種后病原微生物不成活等因素而導致漏 檢[17]。另一方面RNA-SAT法采用磁珠法提取核酸，反應體系加入了競爭性內標，從而增加檢測反應靈敏度[18-19]。此外，從ROC曲線判斷，拭子RNA-SAT法和尿液RNA-SAT法的AUC中等偏上，具有較高的診斷價值（AUC＞0.9）。且尿液RNA-SAT法和拭子RNASAT法的靈敏度和特異度差異無統(tǒng)計學意義，提示RNA-SAT法均可將泌尿生殖道分泌物和尿液作為待測樣本，且尿液作為一種非侵入式取樣，避免男性患者拭子取樣的尷尬和痛苦。因此，在男性患者排斥或尿道拭子取材有困難時，可根據(jù)實際情況考慮留取尿液標本檢查，但是必須在留取尿液標本時明確首次排空尿（first void urine，F(xiàn)VU）概念，即尿液留取時間與上次排尿間隔至少2 h，且必須為首段尿的10～30 mL。這樣才能保證檢測結果準確可靠[20]。最后，本研究通過對81例用藥7 d后臨床癥狀、體征消失且尿常規(guī)白細胞陰性的患者重新采樣進行療效監(jiān)測，陰轉率從高到低依次是尿液FQ-PCR法＞拭子RNA-SAT法＞尿液RNA-SAT法＞拭子FQ-PCR法，但差異均無統(tǒng)計學意義，可能原因是陽性標本例數(shù)不夠造成的，需進一步擴大樣本量進行驗證?？偟膩碚f，RNA-SAT法能排除患者治療后病灶處已死亡病原菌對檢測結果造成的假陽性并且RNA在死亡的病原菌中降解快速，有利于治療后的療效觀察及判愈，避免過度治療，從而減輕患者負擔。

綜上所述，RNA-SAT法和FQ-PCR法對初診或未經治療患者NG病原菌檢測中作用相當，均可作為判斷NG病原菌感染的指標。但在治療過程中，F(xiàn)Q-PCR法檢出的結果不能區(qū)別是活菌或死菌，不適合用作判斷預后標準，而RNA-SAT法具有活菌擴增，死菌不擴增的特點，有利于臨床治療后的療效觀察及判愈，從而避免過度治療[12，14]；同時可采用尿液作為待檢樣本，具有采樣方便、污染小及結果準確等優(yōu)點，可用于臨床男性NG病原菌檢測與預后評估。