李少禧，李小龍，金艷慧，楊麗紅，張海月，王明山

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 溫州 325015）

人類凝血因子XII（FXII）是由肝臟合成的一種絲氨酸蛋白酶原，成熟的蛋白質(zhì)由596個(gè)氨基酸殘基所組成，在外周血血漿中的濃度為30～35 μg/mL， 半衰期為50～70 h[1]。FXII在內(nèi)源性凝血途徑啟動(dòng)中起著重要的作用，先天性FXII缺陷癥是一種常染色體隱性遺傳病。根據(jù)FXII促凝活性（FXII:C）和FXII抗原（FXII:Ag）在血漿中的水平不同，分為3種類型：I型是交叉反應(yīng)物質(zhì)陰性型（CRM-），即抗原檢測不到；II型為交叉反應(yīng)物質(zhì)陽性型（CRM+），即抗原水平正常；III型為交叉反應(yīng)物質(zhì)降低型（CRMRed），即抗原水平降低。有研究表明[2-4]，F(xiàn)XII缺陷通常不會(huì)發(fā)生自發(fā)性出血癥狀，反而是血栓形成的一個(gè)危險(xiǎn)因素。本研究對一個(gè)復(fù)合雜合F12 基因突變導(dǎo)致的遺傳性FXII缺陷癥家系進(jìn)行表型與基因檢測，并采用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對其基因突變的位點(diǎn)進(jìn)行分析，初步探討其分子致病機(jī)制。

1 對象和方法

1.1 對象 先證者，男，50歲，浙江平陽人，因創(chuàng)傷性右肱骨骨折入院，平常無異常出血史或血栓形成史。常規(guī)的術(shù)前檢查發(fā)現(xiàn)活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）為59.1 s，明顯延長（參考范圍為29.0～43.0 s），進(jìn)一步的凝血因子檢測顯示FXII:C下降，只有4%，F(xiàn)XII:Ag下降，只有5%（參考范圍為72%～130%）。其他實(shí)驗(yàn)指標(biāo)如凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）等均在正常參考范圍，纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）偏高，為4.44 g/L（參考范圍為2～4 g/L），初步診斷為FXII缺陷癥。在得到先證者和家系成員知情同意的前提下，采取了其他4位家系成員的外周血以分析FXII缺乏的原因。家系譜見圖1。同時(shí)，選擇100名本院健康體檢者作為健康對照組，男57名，女43名，年齡22～60歲，無肝腎功能異常，無異常出血史和血栓史，且采樣已征得本人同意。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理：采集受檢者外周靜脈血2.7 mL，以0.109 mol/L枸櫞酸鈉1:9 抗凝， 3 000 r/min離心10 min，上層乏血小板血漿用于凝血指標(biāo)檢測，并于2 h內(nèi)完成，下層血細(xì)胞用于提取基因組DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序。

圖1 遺傳性FXII缺陷癥家系圖

1.2.2 血漿凝血指標(biāo)檢測：PT、APTT、凝血因子VIII促凝活性（FVIII：C）、凝血因子IX促凝活性（FIX：C）、凝血因子XI促凝活性（FXI:C）和FXII:C等凝血指標(biāo)采用一期凝固法在法國Stago STA-R全自動(dòng)血凝儀上測定（配套試劑由法國Stago公司提供）；FXII:Ag采用ELISA法測定。所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.2.3 DNA提取及PCR擴(kuò)增：采用酚-氯仿法抽提受檢者的外周血基因組DNA，參照文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)合成PCR引物（由上海桑尼生物科技有限公司合成）。PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體積共50 μL，包括Taq PCR Mastermix 25 μL，ddH2O 18 μL，DNA模板3 μL，正向引物2 μL，反向引物2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃變形30 s，根據(jù)不同引物分別以相應(yīng)退火溫度（60～64 ℃）退火30 s，72 ℃延伸45 s （共35個(gè)循環(huán)），72 ℃延伸10 min。

1.2.4 DNA序列分析：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送上海桑尼生物工程有限公司直接測序，所用測序儀為ABI PRISM 3730。測序結(jié)果用Chromas軟件與美國NCBI基因庫所公布的F12 基因序列（Genbank AF538691） 進(jìn)行比對，尋找基因突變位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)基因突變的序列則反向測序予以證實(shí)，再擴(kuò)增其他家系成員相應(yīng)外顯子片段。對100名健康對照組人群相應(yīng)的區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序，用于排除基因多態(tài)性。

1.2.5 保守性分析和生物信息學(xué)預(yù)測：采用多序列比對軟件ClustalX-2.1-win將突變氨基酸與其他7種同源物種（家鼠、褐家鼠、泛穴居人、獼猴、犬狼瘡屬、金絲猴、刺葉黃耆）的氨基酸序列進(jìn)行比對，分析突變氨基酸在物種進(jìn)化過程中的保守性。并用4個(gè)在線生物信息學(xué)軟件（Mutation Taster、Poly-Phen-2、PROVEAN和SIFT）預(yù)測氨基酸替換是否會(huì)影響FXII蛋白的功能和結(jié)構(gòu)。

1.2.6 突變蛋白空間結(jié)構(gòu)模型分析：以蛋白數(shù)據(jù)庫（PDB，http://www.rcsb.org/pdb/home/home/do.PDB，ID：4XDE）中的3D結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，用Swiss-PDB Viewer 4.0.1軟件和蛋白質(zhì)相互作用計(jì)算器程序（http://pic.mbu.iisc.ernet.in）生成蛋白質(zhì)模型，分析F12 基因突變前后由氨基酸變化引起蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變。

2 結(jié)果

2.1 凝血指標(biāo)檢測結(jié)果 先證者APTT為59.1s（參考范圍29.0～43.0 s），明顯延長，F(xiàn)XII:C降低至4%，F(xiàn)XII:Ag降低至5%；其父親、母親和女兒APTT均為正常，F(xiàn)XII:C和FXII:Ag降低至32%～37%，其妻子各指標(biāo)均正常，見表1。先證者及家系其他成員PT、FVIII:C、FIX:C和FXI:C也均在參考范圍內(nèi)（未列出）。

表1 家系成員實(shí)驗(yàn)室表型和基因型分析結(jié)果

2.2 DNA序列分析結(jié)果 除常見的46C/T多態(tài)性（先證者和其父親為46C/T雜合型，其余3個(gè)家系成員均為46C/C野生型）外，先證者F12 基因第13號外顯子存在復(fù)合雜合基因突變，即c.1561G＞A雜合錯(cuò)義突變（p.Glu502Lys）和c.1637T＞C雜合錯(cuò)義突變（p.Met527Thr）；其父親為p.Met527Thr攜帶者，母親和女兒為p.Glu502Lys攜帶者（見表1和圖2）?；驒z測結(jié)果與凝血指數(shù)檢測結(jié)果相應(yīng)。對100例健康對照者F12 基因13外顯子進(jìn)行測序，均未發(fā)現(xiàn)c.1637T＞C，排除基因多態(tài)性。查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)及相關(guān)網(wǎng)站，c.1637T＞C突變位點(diǎn)未見報(bào)道。

2.3 生物信息學(xué)分析 同源序列比對分析顯示在現(xiàn)代智人和其他7 種同源物種（家鼠、褐家鼠、泛穴居人、獼猴、犬狼瘡屬、金絲猴、刺葉黃耆）里Glu502和Met527是個(gè)高度保守的序列（見圖3）。根據(jù)4個(gè)生物信息學(xué)軟件對p.Glu502Lys突變的預(yù)測結(jié)果為“致病的”“良性的”“有害的”和“影響蛋白功能”；而對p.Met527Thr突變的預(yù)示為“致病的” “可能危害性”“有害的”和“影響蛋白功能的”（見 表2）。蛋白模型3D分析的結(jié)果顯示Glu502 替換為Lys502 導(dǎo)致Glu502-His365 之間氫鍵的消失；Met527替換為Thr527導(dǎo)致Thr527-Leu524之間增加2條氫鍵（見圖4）。

圖2 F12 基因第13號外顯子測序結(jié)果

圖3 保守性分析圖表（箭頭所指為目標(biāo)氨基酸）

3 討論

本家系的研究結(jié)果顯示，先證者F12基因的第13號外顯子上存在復(fù)合雜合基因突變，即p.Glu502Lys 雜合錯(cuò)義突變和p.Met527Thr雜合錯(cuò)義突變，其FXII:C和FXII:Ag均極度降低；其父親為p.Met527Thr攜帶者，母親和女兒為p.Glu502Lys攜帶者，F(xiàn)XII:C和FXII:Ag均有不同程度降低。其妻子F12 的基因型為Glu502和Met527野生型，F(xiàn)XII:C和FXII:Ag均為正常。同時(shí)，先證者和其父親F12 基因1號外顯子上46位為46C/T基因型，其余家系三成員均為46C/C基因型，這也表明46C/T這個(gè)基因多態(tài)性并不引起這個(gè)家系FXII活性和抗原性的下降。此外，沒有其他因素導(dǎo)致FXII活性和抗原的下降，且在復(fù)合雜合FXII缺陷里FXII:C及FXII:Ag降低的程度也和許多報(bào)道一致[6-7]。由此推斷p.Glu502Lys和p.Met527Thr這種復(fù)合雜合突變導(dǎo)致了FXII活性和抗原的降低。

遺傳性FXII缺陷癥是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病。FXII嚴(yán)重缺乏的個(gè)體常常表現(xiàn)為體外實(shí)驗(yàn)APTT延長而體內(nèi)并無出血傾向[8]。有研究結(jié)果表明[3]，復(fù)合雜合子突變的FXII活性和抗原水平比單個(gè)雜合子的更低，且?guī)缀跛械膹?fù)合雜合突變和純合突變有一樣的表型特征，即FXII活性和抗原水平極低。該先證者的FXII活性和抗原水平同步顯著下降，為III型FXII缺陷癥（CRM-），提示這個(gè)突變蛋白的合成、分泌和功能受到了損害[9]。通過家系圖，可以看出該先證者的復(fù)合雜合突變p.Glu502Lys和p.Met527Thr遺傳自其父親和母親，這種遺傳模式與其他遺傳性FXII缺陷癥患者的常染色體隱性遺傳模式相符。p.Met527Thr突變?yōu)閲H上首次報(bào)道，而p.Glu502Lys已經(jīng)有過報(bào)道[6-7]。

為了進(jìn)一步探討p.Glu502Lys和p.Met527Thr突變對FXII水平的影響，本研究分析了這些位點(diǎn)保守性和突變對蛋白的可能影響。保守性分析結(jié)果表明，Glu502和Met527在同源物種間高度保守，表明這些位點(diǎn)在FXII常規(guī)功能中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。信息生物學(xué)的結(jié)果顯示p.Glu502Lys和p.Met527Thr突變很可能是有害突變，會(huì)影響FXII的結(jié)構(gòu)和功能，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

表2 生物信息學(xué)軟件分析結(jié)果

圖4 模型分析圖

Glu502和Met527位于FXII蛋白輕鏈催化域（催化三聯(lián)體His393-Asp442-Ser544)，其中Met527靠近有活性的Ser544。進(jìn)一步研究表明FXII蛋白的催化域在372～614的氨基酸殘基區(qū)，在蛋白的酶活性功能中是個(gè)關(guān)鍵部位。為了分析突變對蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響，本研究運(yùn)用了模型分析，結(jié)果顯示Glu502替換為Lys502導(dǎo)致了Glu502-His365之間氫鍵消失；Met527替換為Thr527導(dǎo)致了Thr527-Leu524之間增加2條氫鍵。氫鍵的聯(lián)接對維持蛋白空間構(gòu)象和穩(wěn)定有著重要作用，因此，這些改變可能影響了催化域微妙的空間結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致FXII蛋白的激活及活性。對Glu502Lys的體外實(shí)驗(yàn)表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，突變蛋白在細(xì)胞的前高爾基體里被廣泛降解，從而導(dǎo)致了突變蛋白的低水平表達(dá)[7]。通過對突變FXII蛋白（p.Gly531Glu）的功能研究發(fā)現(xiàn)，該突變導(dǎo)致FXII對激肽釋放酶原的裂解活性存在局部缺陷[3]。由于Met527位點(diǎn)靠近Gly531，我們推測p.Met527Thr突變蛋白與p.Gly531Glu一樣存在功能缺陷。

綜上所述，本研究在一個(gè)遺傳性FXII缺陷癥患者身上發(fā)現(xiàn)了兩種錯(cuò)義突變（p.Glu502Lys和p.Met527Thr），這些突變可能導(dǎo)致了催化域空間結(jié)構(gòu)的改變，從而降低了FXII的活性和抗原水平，但其確切分子致病機(jī)制有待進(jìn)一步研究。