余明軍，趙娜，王海明

（杭州市第三人民醫(yī)院 普外科，浙江 杭州 310009）

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，其中有約80%為甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[1]。近年來，甲狀腺癌的發(fā)病率仍在迅速增長，PTC的增長速度尤為可觀，占所有女性腫瘤榜首，而在男性腫瘤中居第2位[2]。大部分PTC在手術(shù)切除結(jié)合碘131及甲狀腺素治療后可達到臨床治愈，但仍存在5%的5年復(fù)發(fā)率[3]。目前PTC的發(fā)病機制仍不明確，尋找治療和診斷PTC的小分子標(biāo)志物對于提高其診斷率和治療效果都具有重要意義。

miRNA是一類長為21～25個核苷酸片段的小分子非編碼RNA，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。研究表明，miR-144在肺癌、鼻咽癌、肝癌、腎 癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌和胃癌等癌癥中發(fā)揮抑癌基因的作用[4-6]。JAHANBANI等[7]檢測了113例甲狀腺組織（其中包含81例PTC）中84種miRNA的表達情況，證實miR-144在PTC組織中低表達。另一項細胞水平的研究證實，miR-144可以通過抑制腫瘤細胞自噬，提高甲狀腺未分化癌對鉑類的化療敏感性[4]。目前尚未見有研究涉及miR-144對PTC細胞增殖能力及細胞周期的影響。本研究檢測了PTC細胞及正常甲狀腺細胞中miR-144的表達水平，研究miR-144對PTC細胞增殖能力、單克隆形成能力及細胞周期的影響，可以為PTC早期診斷、預(yù)測復(fù)發(fā)以及找尋新的治療靶點提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料 人PTC細胞K1、TPC-1 和人甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1 均購自中國科學(xué)院上海細胞庫。qPCR試劑盒購自上海欣百諾生物工程有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；miR-144 mimics、miR-144 inhibitor、NC mimics、NC inhibitor購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；MTT溶液、DMSO溶液購自美國Sigma公司；流式周期檢測試劑盒購自美國Sigma公司；兔抗人Anti-Cyclin D1購自美國Abcam公司，鼠抗人β-actin購自美國Epitomics公司；其他試劑均是國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：從液氮罐中取出人PTC細胞K1、TPC-1和人甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1，放置于37 ℃水浴鍋中，快速晃動至凍存液完全融化，加入預(yù)熱的完全培養(yǎng)基（含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL、 10% FBS的培養(yǎng)基，K1 細胞用DMEM培養(yǎng)，TPC-1和Nthy-ori 3-1細胞用RPMI1640培養(yǎng)），1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2，飽和濕度）中培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液。定時觀察細胞狀態(tài)，當(dāng)細胞融合至70%～90%時傳代，加入胰蛋白酶（0.25%胰酶+0.02% EDTA）消化細胞2 min，小心吸去胰酶，加入新鮮完全培養(yǎng)基，用吸管吹打細胞成單細胞懸液，按1:3～1:2傳代接種于培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 qPCR檢測細胞中miR-144表達：取對數(shù)生長期的K1、TPC-1和Nthy-ori 3-1細胞，加入適量TRIozl細胞裂解液，反復(fù)抽吸吹打均勻，用無RNAase槍頭將各孔液體分別轉(zhuǎn)移到對應(yīng)的1.5 mL無RNAase的EP 管中，靜置5 min。加入100 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置5 min。4 ℃，12 000 r/min離心15 min。吸取水相層至新的EP管中，加入250 μL異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10 min。4 ℃，12 000 r/min 離心10 min沉淀RNA。棄上清液，加入500 μL預(yù)冷無水乙醇，震蕩混勻。4 ℃，7 500 r/min離心 5 min，棄上清液。根據(jù)所用細胞數(shù)目，用30～50 μL DEPC水溶解沉淀。-80 ℃保存。用紫外分光光度計檢測RNA的濃度及純度，定量后用DEPC水將RNA稀釋至500 ng/μL。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成各組細胞miR-144的cDNA。按照RT-PCR試劑盒操作說明書擴增miR-144的cDNA。分析各組細胞中miR-144的表達水平。miR-144引物為：5’-CGGCGGTACAGTATAGA TGATG-3’；內(nèi)參采用β-U6，引物為：正向：5’-CTCGC TTCGGCAGCACA-3’，反向：5’-AACGCTTCACGAATTTGCG T-3’。相對定量用2-△△CT法計算。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期的K1細胞，消化收集細胞，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，調(diào)整初始細胞數(shù)為1.2×105，輕拍使細胞均勻分散，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鋪板24 h內(nèi)，培養(yǎng)至細胞單層密度達到50%～60%時，按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書提供的方法進行轉(zhuǎn)染。實驗分組為：陰性對照組（NC）、miR-144 mimics組和miR-144 inhibitor組。

1.2.4 MTT實驗檢測細胞增殖能力：轉(zhuǎn)染NC、miR-144 mimics和miR-144 inhibitor 24 h后，收集各組細胞，接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，初始細胞數(shù)為1 500/孔，每組設(shè)置4 個復(fù)孔。設(shè)置24、48、72、96、120 h 5個時間點，分別進行檢測。避光條件下，每孔加入MTT 溶液20 μL（5 mg/mL），孵育 4 h；終止培養(yǎng)，避光條件下，負壓吸引器小心吸去上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，搖床上低速震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。使用多功能酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔在490 nm波長的吸光度（OD值），計算平均值，繪制細胞增殖曲線。

1.2.5 克隆形成實驗檢測細胞單克隆形成能力：各組轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞，各組細胞按500個/孔接種于6孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，輕輕晃動6孔板使細胞分散均勻。每孔補足完全培養(yǎng)基至1.5 mL，在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，每2～3 d更換新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)6孔板中出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆時終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，用PBS小心沖洗2次。用95%乙醇固定10 min，通風(fēng)處風(fēng)干。0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，自來水小心沖洗。風(fēng)干后拍照。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞周期：各組轉(zhuǎn)染48 h后，用0.25%無EDTA的胰酶消化收集各組細胞，用PBS重懸細胞置于10 mL流式離心管中，室溫2 000 r/min 離心5 min。棄去上清液，每管加2 mL PBS混勻，再次室溫2 000 r/min離心5 min。棄去上清液，回流約50 μL殘留PBS，輕彈離心管使細胞重懸，每管加入預(yù)冷的75%乙醇，輕彈混勻，4 ℃固定過夜。每管加入400 μL 0.05 g/L PI（碘化丙啶），室溫避光孵育30 min，混勻，流式細胞儀上機檢測。

1.2.7 Western blot檢測細胞周期蛋白Cyclin D1的表達：各組轉(zhuǎn)染48 h后倒掉培養(yǎng)基，各孔用1 mL預(yù)冷PBS沖洗3 次，PBS棄凈后將培養(yǎng)板放在冰上。每孔加入80～100 μL裂解液，震蕩混勻，冰上裂解30 min。用干凈的刮棒將細胞刮下，將細胞碎片和裂解液移至1.5 mL EP管中，12 000 r/min，4 ℃，離心30 min，上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中。經(jīng)蛋白定量后，按體積加入一定量5×loading buffer， 100 ℃沸水水浴15 min使蛋白質(zhì)變性，標(biāo)記名稱日期，-80 ℃保存。按照比例配制10%分離膠5%濃縮膠，各組蛋白上樣，80 V電泳，待蛋白marker分開后調(diào)整為120 V，至溴酚藍染料前沿到達凝膠末端，停止電泳。取出蛋白凝膠置于轉(zhuǎn)膜液中平衡 15 min，200 mA轉(zhuǎn)膜1 h。NC膜蛋白面向上放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫于搖床低速搖動，封閉1 h。 封閉液稀釋一抗：Cyclin D1：1/5 000，β-actin：1/1 000，一抗雜交，4 ℃搖床避光孵育過夜。PBST洗滌NC膜3次，每次10 min，加二抗室溫避光孵育 2 h。PBST洗膜3次，NC膜蛋白面朝下上機掃描，應(yīng)用Odyssey蛋白質(zhì)分析成像系統(tǒng)顯像，通過獲取目的條帶的灰度值作為表達強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，Graphpad Prism 6.0軟件繪圖。實驗數(shù)據(jù)去除異常值，計量資料采用表示，所有試驗均重復(fù)檢測3次。多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞中miR-144的表達檢測 人PTC細胞K1、TPC-1和人甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1培養(yǎng)至對數(shù)生長期，經(jīng)RNA提取，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，qPCR檢測細胞中miR-144的相對表達量。K1細胞中miR-144相對表達量為1.114±0.097，TPC-1細胞中miR-144相對表達量為1.555±0.110，甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1中miR-144的相對表達量為2.706±0.135。PTC細胞K1、TPC-1中的miR-144的相對表達量與甲狀腺細胞相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。2種PTC細胞中K1細胞的miR-144表達量較TPC-1細胞低（P＜ 0.01）。

2.2 miR-144 對細胞增殖能力的影響 轉(zhuǎn)染NC、miR-144 mimics和miR-144 inhibitor的K1細胞經(jīng)MTT和DMSO處理，酶標(biāo)儀檢測轉(zhuǎn)染后24、48、72、96、120 h的OD值。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后24 h內(nèi)，NC組、miR-144 mimics組和miR-144 inhibitor組的OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。從轉(zhuǎn)染后48 h 開始，3組細胞增殖能力開始出現(xiàn)差異，在轉(zhuǎn)染后120 h差異顯著：與NC組比，miR-144 mimics組細胞增殖明顯受到抑制，而miR-144 inhibitor組細胞增殖活躍（P＜0.01），見圖1。證明高表達miR-144可以明顯抑制K1細胞的增殖能力，而低表達miR-144促進K1細胞增殖。

圖1 MTT法檢測miR-144對K1細胞增殖能力的影響

2.3 miR-144對細胞單克隆形成能力的影響 轉(zhuǎn)染NC、miR-144 mimics和miR-144 inhibitor的K1細胞接種于6孔板，經(jīng)過7～10 d培養(yǎng)，用0.1%結(jié)晶紫染色，拍照比較各組克隆形成情況。miR-144 mimics 組細胞克隆形成明顯少于NC組，且其單個克隆大小也較NC組??；而miR-144 inhibitor組細胞克隆形成明顯多于NC組，且其單個克隆大小也較NC組大。本研究結(jié)果證明過表達miR-144能夠抑制K1細胞的單個細胞克隆形成能力，而抑制其表達則K1細胞的單個細胞克隆形成能力明顯受促進。本研究結(jié)果進一步證實了高表達miR-144能抑制PTC細胞的增殖能力。見圖2。

圖2 miR-144對K1細胞單克隆形成能力的影響

2.4 miR-144對細胞周期的影響 PTC細胞株K1各組細胞轉(zhuǎn)染后48 h，收集細胞進行流式細胞周期分析。如圖3 所示，與NC組比，miR-144 mimics組G0/G1 期細胞占比明顯增加，S、G2/M期細胞占比明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與NC組比，miR-144 inhibitors組G0/G1期細胞占比明顯減少，S、G2/M 期細胞占比明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）； 提示miR-144對K1細胞周期的影響主要表現(xiàn)在G0/G1 期阻滯。見表1。調(diào)控G1期-S期進程的細胞周期蛋白為Cyclin D1，為了進一步驗證miR-144阻斷K1細胞的G1期-S期進程，引起G0/G1期阻滯，本研究通過Western blot實驗檢測miR-144 mimics、miR-144 inhibitor及NC組轉(zhuǎn)染K1細胞后Cyclin D1蛋白表達水平的變化情況。與NC組比，miR-144 mimics組Cyclin D1蛋白表達量明顯下降，而miR-144 inhibitor組Cyclin D1蛋白表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖4。

圖3 流式細胞技術(shù)檢測miR-144對K1細胞周期的影響

表1 miR-144對K1細胞周期的影響（%）

3 討論

甲狀腺癌發(fā)病率占內(nèi)分泌腫瘤的95%，在頭頸部腫瘤中居首位。由于甲狀腺癌早期臨床癥狀不明顯，使其早期診斷較為困難。惡性腫瘤細胞的迅速增殖、侵襲轉(zhuǎn)移是癌癥患者死亡的主要原因[8]。因此，研究其增殖、侵襲的分子機制至關(guān)重要。在PTC的發(fā)生發(fā)展中，miRNA起著極其重要的作用。一些研究已經(jīng)證實PTC組織中存在很多miRNA的差異表達，并且發(fā)揮著促癌基因或抑癌基因的作用[4，7，9-10]。 目前甲狀腺癌主要依靠臨床癥狀、體征及多普勒彩色超聲、頭頸部CT、ECT等來進行診斷和鑒別診 斷[1]，甲狀腺腫瘤miRNA表達譜的改變，可作為特殊的生物學(xué)標(biāo)志用于早期診斷。修復(fù)或抑制miRNA在PTC細胞中的表達，有可能為開發(fā)抗腫瘤藥物提供新思路。

圖4 miR-144對K1細胞Cyclin D1蛋白表達的影響

有研究表明，miR-144 在包括甲狀腺癌在內(nèi)的多種癌癥中表達下調(diào)[4-7]，在PTC細胞K1中下調(diào)miR-144可以增強癌細胞的侵襲能力，這一作用通過靶向ZEB1和ZEB2基因?qū)崿F(xiàn)[10]。本研究通過實驗證實miR-144在人PTC細胞表達顯著降低，在生物學(xué)功能方面，miR-144通過抑制Cyclin D1的表達實現(xiàn)抑制細胞的有絲分裂，進而抑制細胞增殖，具體表現(xiàn)為miR-144高表達的細胞單克隆形成能力下降、細胞增殖率下降。由以上實驗結(jié)果和文獻資料我們推斷，miR-144在甲狀腺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，并且從細胞增殖、細胞周期及細胞侵襲等多方面阻斷癌細胞的存活和擴散，但其能否作為新的治療靶點投入到臨床中還需要進一步深入研究。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)miR-144在PTC細胞中呈低表達，提高miR-144表達可以有效抑制PTC細胞的增殖能力，并且通過抑制Cyclin D1將細胞阻滯在G0/G1期。