趙學(xué)正，高偉，唐保永，鄭思化，李利軍

（杭州市西溪醫(yī)院 骨科，浙江 杭州 310023）

放療是骨肉瘤綜合治療重要輔助治療之一，術(shù)后和術(shù)前放療的臨床應(yīng)用極大改善了骨肉瘤患者預(yù)后，然而目前使用的放療增敏劑多是化療藥物，其發(fā)揮放療的增敏作用的同時(shí)也表現(xiàn)出同化療一樣的不良反應(yīng)，因此開發(fā)增敏作用強(qiáng)、不良反應(yīng)小的新型放療增敏劑便成為臨床的研究熱點(diǎn)之一[1]。 研究報(bào)道金雀異黃素（genstein，GEN）對放療具有增敏效果，可顯著提高放療對腫瘤的治療作用，而5-羥基-4’-硝基-7-丙酰氧基金雀異黃素（5-hydroxy-4’-nitro-7-propionyloxy-genistein，HNPG）是GEN的一種新型衍生物，在體外具有更強(qiáng)的抗腫瘤、抗氧化等作用[2-3]，然而其對放療是否有增敏作用尚未見報(bào)道。本研究通過檢測亞毒性濃度HNPG對亞毒性劑量的X線照射骨肉瘤Saos-2細(xì)胞的增敏作用，并進(jìn)一步探究其可能的分子生物學(xué)機(jī)制，為HNPG對骨肉瘤的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)試劑 人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生科館細(xì)胞資源中心，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃含5% CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。HNPG由第二軍醫(yī)大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)室金永生教授合成贈(zèng)送，分子式：C18H13O7N，相對分子質(zhì)量：355，淺黃色粉末，純度98%。所有照射均在室溫下進(jìn)行，采用醫(yī)用直線加速器（Elekta Synergy，Elekta CompactTM，瑞典）照射，X線能量6 mV，劑量率6 Gy/min，源皮距SSD 100 cm，照射野10 cm×10 cm，于細(xì)胞上方加培養(yǎng)基至厚度為1.5 cm，使劑量建成在細(xì)胞層上，垂直照射。一抗bcl-2（A00040-1）、bax（A00183）、cyt-c（BA0774）、cleaved-caspase-3（BM3937）和GAPDH（A00227-1）購自美國BOSTER生物技術(shù)有限公司。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，A001-3）、過氧化氫酶（catalase，CAT，A007-1-1）、谷胱甘肽（glutathione，GSH，A006-1）、ROS（E004-1-1）和丙二醛（malondialdehyde，MDA，A003-4）測定試劑盒購自南京建成生物研究所。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（C0162）和線粒體膜電位檢測試劑盒（C2006）購自上海碧云天生物公司。

1.2 MTT法檢測亞毒性濃度HNPG對X線照射Saos-2細(xì)胞增殖抑制的增敏作用 取對數(shù)期生長的Saos-2細(xì)胞，以5 000/孔的密度種植在96孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞完全貼壁后，每孔添加不同濃度的HNPG（0.5、1、2、4、8、16、32 μmol/L）作用骨肉瘤Saos-2細(xì)胞24 h，檢測其對Saos-2細(xì)胞的增殖抑制作用，獲取其亞毒性生物活性濃度并用于后續(xù)實(shí) 驗(yàn)。同樣取另一組Saos-2細(xì)胞，每孔添加不同強(qiáng)度的X線（0.5、1、2、4、8、16、32 Gy）照射骨肉瘤Saos-2細(xì)胞24 h，檢測其對Saos-2細(xì)胞的增殖抑制作用，獲取其24 h亞毒性抑制強(qiáng)度并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取亞毒性濃度2 μmol/L HNPG、亞毒性放射劑量1 Gy X線、2 μmol/L HNPG+1 Gy X線分別作用Saos-2細(xì)胞24 h，然后移除培養(yǎng)液，添加5 mg/L MTT繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，移除MTT混懸液，添加100 μL DMSO，570 nm檢測光密度（型號(hào)：ELX-800 type）。細(xì)胞增殖抑制率（IR）=（1-實(shí)驗(yàn)組A均值/空白對照組A均值）×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。分別記為HNPG組，X線組，HNPG+ X線組。以0.9%氯化鈉溶液作用為對照（NS組）。

1.3 AV/PI染色流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM） 檢測亞毒性濃度HNPG對X線照射Saos-2細(xì)胞凋亡的增敏作用 取對數(shù)期生長的Saos-2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后完全貼壁后，更換培養(yǎng)基，用2 μmol/L HNPG、 1 Gy X線、2 μmol/L HNPG+1 Gy X線分別作用Saos-2細(xì)胞24 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞并吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，以2 000 r/min離心5 min，棄上清液保留細(xì)胞沉淀，分別使用1 mL的50 mmol AV和PI溶液混懸細(xì)胞，于37 ℃避光孵育30 min，再用無血清的DMEM溶液洗滌細(xì)胞3次，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測AV-PI熒光強(qiáng)度，激發(fā)波488 nm和發(fā)射波530 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 Rh123染色FCM法檢測亞毒性濃度HNPG對X線照射Saos-2細(xì)胞線粒體膜電位調(diào)控的增敏作用 取對數(shù)期生長的Saos-2 細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后完全貼壁后，更換培養(yǎng)基，用2 μmol/L HNPG、1 Gy X線、 2 μmol/L HNPG+1 Gy X線分別作用Saos-2細(xì)胞24 h， 棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞并吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，以2 000 r/min離心5 min，棄上清液保留細(xì)胞沉淀，用500 μL Rh123溶液（終濃度為5 μg/mL）混懸細(xì)胞，于37 ℃避光孵育30 min，再用無血清的DMEM溶液洗滌細(xì)胞3次，再用PBS洗滌細(xì)胞2次，用40 μm的濾網(wǎng)過濾細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測Rh123 熒光強(qiáng)度，激發(fā)波 475 nm和發(fā)射波525 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 DCFH-DA染色FCM法檢測亞毒性濃度HNPG對X線照射Saos-2細(xì)胞活性氧調(diào)節(jié)的增敏作用 取對數(shù)期生長的Saos-2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后完全貼壁后，更換培養(yǎng)基，用2 μmol/L HNPG、1 Gy X線、2 μmol/L HNPG+1 Gy X線分別作用Saos-2細(xì)胞24 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞并吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，以2 000 r/min離心5 min，棄上清液保留細(xì)胞沉淀，用1 mL的50 mmol DCFHDA溶液混懸細(xì)胞，于37 ℃避光孵育30 min，再用無血清的DMEM溶液洗滌細(xì)胞3次，除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，用40 μm的濾網(wǎng)過濾細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測DCFH-DA熒光強(qiáng)度，激發(fā)波488 nm和發(fā)射波530 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 ELISA法檢測亞毒性濃度HNPG對X線照射Saos-2 細(xì)胞SOD、CAT、GSH和MDA調(diào)節(jié)的增敏作用

取對數(shù)期生長的Saos-2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后完全貼壁后，更換培養(yǎng)基，用2 μmol/L HNPG、1 Gy X線、2 μmol/L HNPG+1 Gy X線分別作用Saos-2細(xì)胞24 h， 用0.25%的胰酶消化細(xì)胞并吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，以800 r/min離心5 min，棄上清液保留細(xì)胞沉淀，用冰PBS混懸細(xì)胞，再以800 r/min離心5 min，棄上清液保留細(xì)胞沉淀，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解 30 min，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白密度測定。按照SOD、CAT、GSH和MDA試劑盒說明書分別在550 nm、405 nm、420 nm和532 nm處對SOD和CAT活力進(jìn)行測試，對GSH和MDA含量進(jìn)行測試。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 Western blot法檢測亞毒性濃度HNPG對X線照射Saos-2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)的增敏作用 取對數(shù)期生長的Saos-2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后完全貼壁后，更換培養(yǎng)基，用HNPG 2 μmol/L、X線1 Gy、HNPG 2 μmol/L+X線1 Gy分別作用Saos-2細(xì)胞24 h，用冰PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液提取蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取30 μg樣品用SDSPAGE電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再用5%脫脂牛奶-TBST室溫?fù)u床封閉2 h，一抗于37 ℃溫育3 h，二抗于37 ℃溫育1 h，ECL發(fā)光劑激發(fā)熒光，壓片顯影定影。結(jié)果用灰度掃描儀處理分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS18.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 亞毒性濃度HNPG對X線照射Saos-2細(xì)胞增殖抑制的增敏作用 取不同濃度的HNPG（0.5、1、2、4、 8、16、32 μmol/L）作用骨肉瘤Saos-2細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)HNPG對細(xì)胞的增殖抑制呈濃度依賴性，其中在2 μmol/L濃度以下，HNPG對細(xì)胞的作用處于亞毒性范圍之內(nèi)，抑制率均小于15%，見圖1A。取不同照射強(qiáng)度X線（0.5、1、2、4、8、16、32 Gy）的X線，發(fā)現(xiàn)X線對細(xì)胞的毒性呈強(qiáng)度依賴性，其中在1 Gy強(qiáng)度下，細(xì)胞呈亞毒性，細(xì)胞的抑制率均小于15%，見圖1B。取2 μmol/L HNPG聯(lián)合1 Gy X線，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖抑制率顯著提高，分別與HNPG組或X線組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而HNPG組和X線組比較，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1C。

2.2 亞毒性濃度HNPG對X線照射Saos-2細(xì)胞凋亡的增敏作用 取對數(shù)期生長的Saos-2 細(xì)胞，分別予以2 μmol/L HNPG、1 Gy X線和2 μmol/L HNPG+ 1 Gy X線持續(xù)培養(yǎng)24 h后，用FCM檢測發(fā)現(xiàn)Saos-2細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，凋亡率分別為10.60%± 0.87%、9.49%±0.69%、50.37%±4.13%，較NS組（0.1%±0.01%）顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HNPG+X線組與HNPG組和X線組比，凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HNPG組和X線組凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示HNPG對X線照射Saos-2細(xì)胞有顯著的增敏作用，見圖2。

2.3 亞毒性濃度HNPG對X線照射Saos-2細(xì)胞活性氧調(diào)控的增敏作用 取對數(shù)期生長的Saos-2細(xì)胞，分別予以2 μmol/L HNPG、1 Gy X線和2 μmol/L HNPG+1 Gy X線持續(xù)培養(yǎng)24 h后，用FCM檢測發(fā)現(xiàn)Saos-2細(xì)胞DCFH-DA熒光強(qiáng)度出現(xiàn)不同程度的增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度分別為1.51±0.11、1.28±0.10、8.12± 0.64，較NS組（0.78±0.06）顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HNPG+X線組熒光強(qiáng)度與HNPG組和X線組比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HNPG組與X線組細(xì)胞熒光強(qiáng)度相當(dāng)，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖1 亞毒性濃度HNPG對X線照射骨肉瘤Saos-2細(xì)胞增殖抑制的增敏作用

圖2 亞毒性濃度HNPG對X線照射骨肉瘤Saos-2細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的增敏作用

2.4 亞毒性HNPG對X線照射Saos-2細(xì)胞線粒體膜電位調(diào)控的增敏作用 取對數(shù)期生長的Saos-2細(xì)胞，分別予以2 μmol/L HNPG、1 Gy X線和2 μmol/L HNPG+1 Gy X線持續(xù)培養(yǎng)24 h后，用FCM檢測發(fā)現(xiàn)Saos-2細(xì)胞平均Rh123熒光強(qiáng)度分別為6.16±0.42、6.67±0.48、1.18±0.08，與NS組（7.25±0.56）比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HNPG+X線組熒光強(qiáng)度與HNPG組和X線組比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HNPG組和X線組平均Rh123熒光強(qiáng)度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

2.5 亞毒性HNPG對X線照射Saos-2細(xì)胞調(diào)節(jié)SOD、CAT、GSH和MDA表達(dá)的增敏作用 取對數(shù)期生長的Saos-2細(xì)胞，分別予以2 μmol/L HNPG、1 Gy X線和2 μmol/L HNPG+1 Gy X線持續(xù)培養(yǎng)24 h后，分別用SOD、CAT、GSH和MDA試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)Saos-2細(xì)胞SOD和CAT活力出現(xiàn)不同程度的下降，GSH含量出現(xiàn)不同程度的降低，而MDA含量卻出現(xiàn)不同程度的升高，與NS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HNPG+X線組與HNPG組和X線組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HNPG組和X線組SOD和CAT活力、GSH和MDA含量相當(dāng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.6 亞毒性濃度HNPG對X線照射Saos-2細(xì)胞調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白的增敏作用 取對數(shù)期生長的Saos-2細(xì)胞，分別予以2 μmol/L HNPG、1 Gy X線和2 μmol/L HNPG+1 Gy X線持續(xù)培養(yǎng)24 h后，提取細(xì)胞蛋白并檢測蛋白印跡平均相對灰度值，發(fā)現(xiàn)Saos-2細(xì)胞bcl-2蛋白表達(dá)呈濃度依賴性下調(diào)，與NS組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而bax、cyt-c和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)卻呈濃度依賴性上調(diào)，與NS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HNPG+X線組與HNPG組和X線組比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

圖3 亞毒性濃度HNPG對X線照射骨肉瘤Saos-2細(xì)胞活性氧調(diào)節(jié)的增敏作用

3 討論

目前針對骨肉瘤的治療模式是以手術(shù)為主，化療和放療為輔，然而隨著放療技術(shù)的不斷發(fā)展，尤其是新型放療模式的變革，放療效果顯著提高，在很大程度上改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后，這使放療成為骨肉瘤最為重要的治療方式之一[4]。臨床上為了使放療達(dá)到最佳的治療效果，通常在放療的基礎(chǔ)上采用放療增敏劑；增敏劑的應(yīng)用，提高了放療的治療效果，減少了放療劑量，減少了放療的不良反應(yīng)。但是，目前放療增敏劑多系化療藥物，其依舊存在化療的不良反應(yīng)，并產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重限制了它們的臨床應(yīng)用，為此開發(fā)不良反應(yīng)小，增敏效果強(qiáng)的新型放療增敏劑，便成了臨床研究的工作熱點(diǎn)之一[5]。本研究檢測亞毒性濃度HNPG對X線照射骨肉瘤Saos-2細(xì)胞增殖抑制的增敏作用，并進(jìn)一步探討其可能的分子生物學(xué)機(jī)制。

細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)包括SOD、CAT、GSH等，抗氧化酶系的存在對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用[6]。SOD在細(xì)胞內(nèi)以超氧負(fù)離子自由基為底物，催化其發(fā)生歧化反應(yīng)并生成無毒的氧或過氧化氫，直接對抗氧自由基和活性氧的抗氧化酶[7]； 而CAT能有效催化過氧化氫為無毒物質(zhì)氧[8]；GSH可以有效催化過氧化氫為無毒物質(zhì)氧和水[9]；SOD、CAT、GSH等共同構(gòu)成了細(xì)胞內(nèi)抗氧化的酶系統(tǒng)，因此測定SOD、CAT、GSH含量，可以間接體現(xiàn)機(jī)體對氧自由基和活性氧的清除能力[10]。細(xì)胞內(nèi)的氧自由基或活性氧，可以攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并形成MDA等脂質(zhì)過氧化物，因而測試MDA的量常?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，亞毒性濃度的HNPG和亞毒性劑量的X線聯(lián)合處理Saos-2細(xì)胞后，細(xì)胞增殖抑制顯著加強(qiáng)，凋亡現(xiàn)象明顯增加，細(xì)胞內(nèi)ROS累積增多，伴隨著SOD和CAT生物活性降低，GSH含量降低，而MDA含量增高，提示亞毒性濃度的HNPG可以增敏X線對Saos-2細(xì)胞的放療效果，其機(jī)制可能與其下調(diào)SOD、CAT、GSH表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS不能被清除，進(jìn)而引起線粒體磷脂膜受損密切相關(guān)。這與ARAVINDAN等[12]研究GEN增強(qiáng)放療抑制乳腺癌細(xì)胞的效果和機(jī)制相似，提示GEN和它的新型衍生物HNPG均可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞放療效果。

在線粒體的雙層磷脂酶上有bcl-2和bax蛋白，它們共同構(gòu)成的線粒體器膜轉(zhuǎn)化孔，調(diào)節(jié)并保持線粒體內(nèi)外電解質(zhì)的平衡，并維持著線粒體膜內(nèi)外存在一定的膜電壓[13-14]；一旦線粒體細(xì)胞器膜受損，引起bcl-2和bax蛋白表達(dá)失調(diào)，就會(huì)導(dǎo)致線粒體膜內(nèi)外電解質(zhì)調(diào)節(jié)障礙，引起線粒體膜電位下降，同時(shí)線粒體內(nèi)物質(zhì)外泄，而這些線粒體內(nèi)的物質(zhì)，諸如cyt-c等，一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，就會(huì)激活細(xì)胞質(zhì)中半胱氨酸蛋白酶家族（caspase家族），最終激活凋亡效應(yīng)蛋白cleaved-caspase-3產(chǎn)生并誘導(dǎo)細(xì)胞凋 亡[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)亞毒性濃度的HNPG和亞毒性劑量的X線聯(lián)合處理Saos-2細(xì)胞后，細(xì)胞增殖抑制顯著，凋亡現(xiàn)象明顯，線粒體膜電位MMP降低，伴隨著bcl-2 表達(dá)降低，而bax、cyt-c和cleaved- caspase-3蛋白表達(dá)增加，提示亞毒性濃度的HNPG在體外可增敏X線對Saos-2細(xì)胞增殖抑制作用，其機(jī)制可能與其誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡途徑相關(guān)。這與SAHIN等[17]研究GEN增強(qiáng)放射治療前列腺癌細(xì)胞的效果和機(jī)制相似，提示GEN和它的新型衍生物HNPG在體外均可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞放療效果。

圖4 亞毒性濃度HNPG對X線照射骨肉瘤Saos-2細(xì)胞線粒體膜電位調(diào)節(jié)的增敏作用

表1 亞毒性濃度HNPG對X線照射Saos-2細(xì)胞調(diào)節(jié)SOD、CAT、GSH和MDA表達(dá)的增敏作用（每組n=3，

表1 亞毒性濃度HNPG對X線照射Saos-2細(xì)胞調(diào)節(jié)SOD、CAT、GSH和MDA表達(dá)的增敏作用（每組n=3，

與NS組比：aP＜0.05；與HNPG組比：bP＜0.05；與X線組比：cP＜0.05

組別 SOD（U/mg prot） CAT（U/mg prot） GSH（mg/g prot） MDA（nmol/mg prot）NS組 40.18±3.02 8.89±0.52 10.27±0.84 4.48±0.37 HNPG組 35.46±2.83a 6.52±0.47a 9.08±0.87a 5.54±0.39a X線組 33.98±3.01a 6.08±0.39a 9.15±0.81a 5.76±0.47a HNPG+X線組 15.72±1.03abc 4.38±0.37abc 4.26±0.33abc 10.73±0.86abc

圖5 亞毒性濃度HNPG對X線照射骨肉瘤Saos-2細(xì)胞調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的增敏作用

綜上所述，亞毒性濃度的HNPG和亞毒性X線放射治療劑量聯(lián)合使用在體外對骨肉瘤Saos-2細(xì)胞展示的顯著的細(xì)胞毒性，抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡的作用顯著提升，其分子生物學(xué)機(jī)制可能是與亞毒性濃度的HNPG促進(jìn)X線下調(diào)細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH抗氧化的酶表達(dá)，降低其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)清除ROS的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS累積，進(jìn)而損傷腫瘤細(xì)胞線粒體磷脂膜，降低細(xì)胞膜電位，引起線粒體功能紊亂，使cyt-c等誘發(fā)細(xì)胞凋亡的酶進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，激活caspase酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，引起細(xì)胞凋亡所致。