邵錦根，楊江，陳浩浩，陶紅苗，李旭升

（1.金華市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 金華 321000；2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 金華 321017）

缺血性腦卒中已成為嚴(yán)重危害我國居民生命健康的主要疾病之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，自噬是溶酶體介導(dǎo)的對(duì)體內(nèi)受損細(xì)胞器及大分子物質(zhì)進(jìn)行降解的過程，自噬被過度激活后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡，與腦卒中的病理機(jī)制關(guān)系密切[2-3]。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路在自噬中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[4]。海馬是大腦中對(duì)缺血缺氧損傷極敏感的區(qū)域[5]。本研究用四血管阻斷法建立大鼠全腦缺血再灌注損傷模型，探討腦缺血再灌注不同時(shí)間對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元自噬及PI3K/mTOR通路的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量180～250 g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0005，動(dòng)物合格證號(hào)0267780。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器：栓線2634-A4型（北京沙東生物有限公司）；兔抗大鼠Beclin-1多克隆抗體（英國Abcam公司）；兔抗大鼠LC3 II多克隆抗體（英國Abcam公司）；p-PI3K、p-Akt及p-mTOR抗體（美國Santa Cruz公司）；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋科技有限公司）；BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；PVDF膜0.45 μm（美國Santa Cruz公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國Pierce Biotechnology公司）；Nikon攝影生物光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；Tecnai G2 Spirit Bio TWIN透射電鏡（美國FEI公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和模型制備：參照文獻(xiàn)[6]采用四血管阻斷法建立大鼠全腦缺血再灌注損傷模型。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為假手術(shù)組和缺血再灌注組。缺血再灌注組：夾閉雙頸總動(dòng)脈缺血 15 min[7]，分別恢復(fù)血流灌注0、6、12、24、36 h；假手術(shù)組：除不夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈外其他處理同缺血再灌注組。每組12只。缺血再灌注后從每組中隨機(jī)選取5只對(duì)神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分，剩余大鼠立即斷頭取海馬組織-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分：大鼠缺血再灌注不同時(shí)間后，從每組中隨機(jī)選取5只，參考文獻(xiàn)[8]對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分。

1.2.3 缺血再灌注對(duì)大鼠腦梗死面積影響：參照文獻(xiàn)[9]采用TTC染色法用于測(cè)量腦梗死面積。采用 ImageJ 1.45圖像分析軟件測(cè)量每張染色圖片的梗死面積，梗死腦組織百分比=梗死區(qū)面積/（梗死面積+非梗死面積）×100%。

1.2.4 HE染色：取大鼠海馬組織，4%甲醛溶液固 定，常規(guī)石蠟包埋，經(jīng)二甲苯、乙醇、蒸餾水洗脫后，蘇木精染色5 min，水洗后0.5%伊紅液染色 3 min，蒸餾水沖洗、脫水、干燥后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察海馬組織切片。

1.2.5 透射電鏡觀察大鼠海馬神經(jīng)元自噬：參照文獻(xiàn)[10]方法置于電鏡下觀察大鼠海馬神經(jīng)元自噬。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)海馬組織自噬相關(guān)蛋白及PI3K/mTOR通路蛋白表達(dá)：取大鼠海馬組織，剪碎，加入蛋白裂解液于冰上充分裂解30 min，4 ℃、 12 000 r/min離心10 min，上清液-80 ℃保存?zhèn)溆谩CA法測(cè)定蛋白濃度，取40 μg樣品以10% SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后半干法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加入一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后加入HPR標(biāo)記的二抗（稀釋度1:5 000），37 ℃孵育2 h。TBST洗膜后加入ECL化學(xué)發(fā)光顯色、曝光拍照。以β-actin為內(nèi)參，BandScan軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦缺血再灌注不同時(shí)間大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 與假手術(shù)組比，隨著腦缺血再灌注時(shí)間的延長，0～24 h組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分呈增加的趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 腦缺血再灌注不同時(shí)間大鼠腦梗死面積 與假 手術(shù)組比，隨著腦缺血再灌注時(shí)間的延長，0～24 h組大鼠腦梗死面積呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 腦缺血再灌注不同時(shí)間海馬組織HE染色形態(tài) 假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)整，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核飽滿。隨著腦缺血再灌注時(shí)間的延長，大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞核固縮、碎裂現(xiàn)象逐漸嚴(yán)重，見圖3。

2.4 腦缺血再灌注不同時(shí)間海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)

假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，染色質(zhì)分布均勻，線粒體脊線清晰，自噬不明顯。隨著腦缺血再灌注時(shí)間的延長，海馬神經(jīng)元染色質(zhì)固縮，線粒體出現(xiàn)損傷，有自噬泡出現(xiàn)，且腦缺血再灌注時(shí)間越長，自噬泡數(shù)量越多，見圖4。

圖1 腦缺血再灌注不同時(shí)間神經(jīng)功能缺損評(píng)分（每組n=5）

圖2 腦缺血再灌注不同時(shí)間大鼠腦梗死面積（每組n=5）

2.5 腦缺血再灌不同時(shí)間海馬組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比，隨著腦缺血再灌注時(shí)間的延長，0～24 h組海馬組織LC3 II蛋白表達(dá)呈增加趨勢(shì)，p62 蛋白表達(dá)呈降低趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05）；與假手術(shù)組比，隨著腦缺血再灌注時(shí)間的延長，0～36 h組海馬組織Beclin-1蛋白表達(dá)呈增加趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

2.6 腦缺血再灌不同時(shí)間海馬組織PI3K/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比，隨著腦缺血再灌注時(shí)間延長，0～36 h組海馬組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)均呈下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與假手術(shù)組比，隨著腦缺血再灌注時(shí)間延長，0～ 12 h組海馬組織p-mTOR蛋白表達(dá)均呈下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖6。

3 討論

缺血性腦卒中是全球主要的致死及致殘疾病之一，嚴(yán)重危害患者健康。腦缺血再灌注損傷在缺血性腦血管病病理生理過程中較為常見，其機(jī)制比較復(fù)雜，與多種病理環(huán)節(jié)相關(guān)，如自由基損傷、炎癥介質(zhì)釋放、細(xì)胞凋亡和自噬等。

自噬是溶酶體介導(dǎo)的對(duì)體內(nèi)受損細(xì)胞器及大分子物質(zhì)進(jìn)行降解的過程。正常生理狀態(tài)下的自噬可維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，調(diào)控細(xì)胞損傷及防止細(xì)胞 老化[11]，但自噬被過度激活后，則會(huì)造成細(xì)胞程序性死亡，引起一系列疾病[12]。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元變化與自噬密切相關(guān)。趙亞倩等[13]通過建立腦缺血再灌注大鼠模型發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注激活了大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)觀察到大量自噬小體。本研究結(jié)果顯示，隨著腦缺血再灌注時(shí)間延長，大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分增加，腦梗死面積增加，海馬區(qū)神經(jīng)出現(xiàn)核固縮和碎裂現(xiàn)象，腫脹明顯，海馬區(qū)自噬小體數(shù)量增加，這與趙亞倩等[13]報(bào)道的結(jié)果一致。

圖3 腦缺血再灌注不同時(shí)間海馬組織HE染色

圖4 腦缺血再灌注不同時(shí)間海馬組織透射電鏡圖

圖5 腦缺血再灌不同時(shí)間海馬組織Beclin-1、LC3 II和p62蛋白表達(dá)（每組n=7）

圖6 腦缺血再灌注不同時(shí)間海馬組織p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)（每組n=7）

自噬發(fā)生過程涉及多種蛋白的表達(dá)變化，Beclin-1是酵母ATG6的同系物，是一種參與自噬的特異性基因。研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1在腦缺血再灌注期間發(fā)揮至關(guān)重要的作用，Beclin-1表達(dá)上調(diào)可增強(qiáng)自噬，促進(jìn)自噬體的形成和成熟[14]。LC3是目前公認(rèn)的自噬體標(biāo)記物，分為I型和II型，I型常規(guī)表達(dá)并游離存在于胞質(zhì)中。自噬發(fā)生時(shí)，LC3 I磷脂化形成LC3-PE，即膜結(jié)合形式的LC3 II，LC3 II位于胞內(nèi)自噬體的膜上，其含量高低可反映自噬小體數(shù)量[15]。 自噬發(fā)生時(shí)，p62與泛素化的蛋白質(zhì)結(jié)合后再與自噬小體內(nèi)膜上的LC3 II蛋白形成復(fù)合物，一同在自噬溶酶體內(nèi)降解。當(dāng)自噬活性減弱或自噬功能缺陷時(shí)，p62 蛋白在細(xì)胞質(zhì)中不斷累積，其含量高低可間接反映自噬小體清除水平[16]。SHU等[17]研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注大鼠Beclin-1和LC3 II蛋白表達(dá)顯著升高，電針治療可降低其蛋白表達(dá)，減輕自噬和細(xì)胞凋亡。WANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)腦缺血/再灌注損傷后大鼠海馬CA1區(qū)自噬體數(shù)量、Beclin-1蛋白表達(dá)及LC3 II/LC3 I比率均顯著增加，p62蛋白表達(dá)顯著降低。本研究結(jié)果顯示，自噬相關(guān)蛋白beclin1、LC3 II表達(dá)均顯著上調(diào)，且再灌注時(shí)間越長，蛋白表達(dá)越高，提示腦缺血再灌注可激活大鼠海馬神經(jīng)元自噬，再灌注時(shí)間越久，自噬越嚴(yán)重，與報(bào)道結(jié)果一致，說明腦缺血再灌注可激活大鼠海馬過度自噬，損傷神經(jīng)細(xì)胞。

PI3K/mTOR信號(hào)通路在自噬中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在生理?xiàng)l件下，酪氨酸激酶受體被活化后可激活PI3K，底物PIP2被活化的PI3K催化為PIP3，PIP3進(jìn)而與磷酸肌醇依賴的激酶-1協(xié)同作用激活A(yù)kt，p-Akt將信號(hào)傳遞至mTOR，活化后的mTOR（p-mTOR）激活其下游的相關(guān)因子，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、增殖和生長，加速細(xì)胞代謝，抑制其自噬[19]。研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚預(yù)處理可激活PI3K/Akt信號(hào)通路，增強(qiáng)下游mTOR活性，進(jìn)而降低缺血再灌注期間心肌細(xì)胞的自噬水平，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[4]。王潔等[20]研究發(fā)現(xiàn)，丁苯酞可能通過P53/mTOR通路減少細(xì)胞自噬反應(yīng)，保護(hù)腦缺血再灌注后損傷。本研究結(jié)果顯示，缺血再灌注后，大鼠海馬組織p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)均顯著下降，且再灌注時(shí)間越長，蛋白表達(dá)越低，提示缺血再灌注抑制了大鼠海馬區(qū)PI3K/mTOR信號(hào)通路。因此，通過藥物作用激活PI3K/mTOR通路促進(jìn)mTOR活性，可能降低缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元自噬，起到腦保護(hù)的作用。

綜上所述，腦缺血再灌注不同時(shí)間可增強(qiáng)大鼠海馬神經(jīng)元自噬，抑制PI3K/mTOR信號(hào)通路，但是具體作用機(jī)制還需要進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。