蔡學(xué)定，陳馬云，李文雅，吳佩亮，姚丹，黃曉穎

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325015）

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是一種以肺血管收縮與結(jié)構(gòu)重塑為特征的慢性進(jìn)展性疾病，病死率高[1]。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）的異常增殖是肺血管結(jié)構(gòu)重塑的主要原因，而多種炎癥反應(yīng)參與其中[2-3]。目前已有研究探明姜黃素可通過(guò)Nod樣受體蛋白3（Nod-like receptor protein 3， NLRP3）炎性體相關(guān)通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[4]。姜黃素是否在低氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxia induced pulmonary hypertension，HPH）疾病模型中通過(guò)NLRP3炎性體相關(guān)通路抑制炎癥反應(yīng)從而抑制HPH未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立HPH大鼠模型和低氧PASMCs模型，探討姜黃素通過(guò)NLRP3/Caspase-1/IL-1β軸對(duì)HPH的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，購(gòu)于上海斯萊克公司，體質(zhì)量200～300 g，動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)在溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2019-0009。DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25% EDTA胰酶、胎牛血清、青/鏈霉素購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。RIPA裂解緩沖液、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒、蛋白酶磷酸酶抑制劑、ECL超敏化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)于美國(guó)Thermo Pierce公司。姜黃素單體購(gòu)于德國(guó)Merck公司。兔源性NLRP3抗體、兔源性Caspase-1抗體、兔源性IL-1β抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。

1.2 動(dòng)物分組及造模 將18只SD大鼠隨機(jī)分為3組（每組6只）：常氧組（N）、低氧組（H）、低氧+姜黃素組（HC）。N組大鼠均置于SPF環(huán)境中；H組大鼠造模時(shí)被放置于密封的低氧艙內(nèi)，通過(guò)動(dòng)態(tài)充入N2使艙內(nèi)的O2濃度保持在9%～11%，在自動(dòng)控制器的作用下將濕度維持在55%～65%，CO2控制在2%以下，低氧造模低氧時(shí)間為每日8 h，共造模4周。HC組大鼠進(jìn)入低氧艙造模前，腹腔注射40 mg/kg姜黃素，N組、H組均腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。每日密切關(guān)注SD大鼠活動(dòng)情況、飲食情況、精神狀態(tài)[5]。

1.3 細(xì)胞分離培養(yǎng)及分組造模 取SD大鼠，消毒及麻醉后在超凈臺(tái)內(nèi)取得肺組織，分離出肺細(xì)小動(dòng)脈，去除內(nèi)皮細(xì)胞后剪碎，用含有1 mL 0.2%膠原酶I消化，待肺小動(dòng)脈碎塊消化為絮狀物后離心，去上層膠原酶后加入培養(yǎng)基放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3 d后得到原代PASMCs，將細(xì)胞傳代至 4～6代時(shí)收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞饑餓12 h使細(xì)胞周期同步化，之后進(jìn)行干預(yù)。分為N組、H組、HC組（姜黃素濃度為10 μg/mL）。N組培養(yǎng)條件：37 ℃，5% CO2，21% O2，74% N2；H組培養(yǎng)條件：37 ℃，5% CO2，5% O2，90% N2；HC組培養(yǎng)條件：37 ℃，5% CO2，5% O2，90% N2，姜黃素（10 μg/mL）。3組培養(yǎng)時(shí)間均為24 h。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 將PASMCs制成單細(xì)胞懸液并接種至96孔板中，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。分組方式同前，每組6個(gè)孔，周邊設(shè)無(wú)細(xì)胞的空白組，分別置入相應(yīng)培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。干預(yù)結(jié)束后，倒去培養(yǎng)液，每孔中加入培養(yǎng)基和CCK-8試劑，迅速避光放入培養(yǎng)箱中，1～2 h后快速放入酶標(biāo)儀中進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，測(cè)量各孔的吸光度（absorbance，A）。

1.5 肺動(dòng)脈壓力測(cè)定及右心肥大指標(biāo)檢測(cè) 用20%烏拉坦腹腔注射麻醉SD大鼠，固定大鼠后分離右頸外靜脈，測(cè)壓管插管至肺動(dòng)脈，生理記錄儀測(cè)得每只大鼠平均肺動(dòng)脈壓（mean pulmonary artery pressure，mPAP）[6]。大鼠放血處死，取出完整心臟，完整分離右心室（right ventricle，RV）、左心室和室間隔（left ventricle+septum，LV+S），吸干水分后稱(chēng)重，記錄并計(jì)算右心肥厚指數(shù)=[RV/（LV+S）]，反映右心肥大情況。

1.6 肺血管結(jié)構(gòu)重塑指標(biāo)檢測(cè) 取大鼠右肺上葉放入4%多聚甲醛中固定24 h，肺組織常規(guī)石蠟包埋切片，行HE染色。制作好的HE染色切片在普通光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，隨機(jī)選取6個(gè)不同視野下的肺中小動(dòng)脈拍照。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析肺中小動(dòng)脈管壁面積/管總面積（wall area to total area，WA/TA）以反映肺血管結(jié)構(gòu)重塑的程度。

1.7 Western blot檢測(cè)NLRP3、Caspase-1、IL-1β相關(guān)蛋白表達(dá) 提取各組大鼠肺組織標(biāo)本和PASMCs總蛋白，測(cè)定總蛋白濃度。取細(xì)胞蛋白樣品40 μg、組織蛋白樣品60 μg分別行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜后，脫脂牛奶封閉，4 ℃孵育一抗過(guò)夜。次日清洗后孵育二抗，漂洗后運(yùn)行成像儀進(jìn)行曝光。使用Quantity One測(cè)定各條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，各組目的蛋白與對(duì)應(yīng)GAPDH灰度值的比值即為該組蛋白的相對(duì)表達(dá)量，比較各組蛋白的表達(dá)差異。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料用表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組PASMCs數(shù)量比較 與N組（1.079±0.039）比，H組（1.326±0.060）PASMCs數(shù)量顯著增加，差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與H組比，HC組（1.158± 0.050）PASMCs數(shù)量顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與N組比，HC組PASMCs數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 3組大鼠mPAP、右心肥大程度比較 與N組比，H組大鼠mPAP顯著升高，右心肥大指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與H組比，HC組大鼠mPAP明顯下降，右心肥大指數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與N組比，HC組mPAP、右心肥大指數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠mPAP和右心肥大程度比較（每組6只，

表1 3組大鼠mPAP和右心肥大程度比較（每組6只，

與N組比：aP＜0.05；與H組比：bP＜0.05

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2.3 3 組大鼠肺血管重塑程度的比較 與N 組（0.493±0.018）比，H組大鼠WA/TA（0.789±0.042）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與H組比，HC組大鼠WA/TA（0.652±0.034）明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與N組比，HC組大鼠WA/TA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。N組肺動(dòng)脈平滑肌層未見(jiàn)明顯增厚，管壁均勻一致；H組肺動(dòng)脈肌化明顯，管腔明顯狹窄，中膜平滑肌細(xì)胞明顯增生，管壁明顯增厚；HC組較H組肺動(dòng)脈肌化減輕，管壁增厚好轉(zhuǎn)，管腔狹窄不明顯，見(jiàn)圖1。

圖1 3組大鼠肺血管HE染色圖（×400）

2.4 3組PASMCs和肺勻漿NLRP3/Caspase-1/IL-1β軸相關(guān)蛋白表達(dá)量比較 與N組比，H組PASMCs的NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與H組比，HC組PASMCs的 NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與N組比，HC組NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2 和圖2。與N組比，H組大鼠肺勻漿的NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與H組比，HC組大鼠肺勻漿的NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3和圖3。

表2 3組PASMCs NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白的表達(dá)量（每組6只，）

表2 3組PASMCs NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白的表達(dá)量（每組6只，）

與N組比：aP＜0.05；與H組比：bP＜0.05

組別 NLRP3 Caspase-1 IL-1β N組 0.191±0.037 0.184±0.070 0.030±0.011 H組 0.648±0.152a 0.629±0.076a 0.120±0.038a HC組 0.412±0.107ab 0.402±0.104ab 0.068±0.015ab

圖2 3組PASMCs NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白Western blot圖

3 討論

PH是一類(lèi)以肺血管重塑和肺血管阻力增加為特征的進(jìn)展性疾病，病死率高，預(yù)后欠佳。PASMCs的異常增殖是肺血管重塑的重要因素[2，7]，肺動(dòng)脈炎癥反應(yīng)在其中發(fā)揮重要作用[3]，目前臨床上針對(duì)PH的治療措施較為有限。抑制局部肺動(dòng)脈炎癥及PASMCs異常增殖可以緩解甚至逆轉(zhuǎn)肺血管重塑和PH疾病進(jìn)展，因此尋求該類(lèi)的新型中藥單體，并深入探究其作用機(jī)制和有效靶點(diǎn)十分重要。

表3 3組大鼠肺勻漿NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白的表達(dá)量（每組6只，）

表3 3組大鼠肺勻漿NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白的表達(dá)量（每組6只，）

與N組比：aP＜0.05；與H組比：bP＜0.05

組別 NLRP3 Caspase-1 IL-1β N組 0.143±0.049 0.239±0.057 0.022±0.006 H組 0.284±0.030a 0.875±0.125a 0.064±0.008a HC組 0.210±0.019ab 0.587±0.088ab 0.040±0.005ab

圖3 3組大鼠肺勻漿NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白Western blot圖

姜黃素是從姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種植物多酚，有研究報(bào)道其具有抗炎[4]、抗腫瘤[8]、抗氧化和心血管保護(hù)等作用。NLRP3復(fù)合體是一種大分子復(fù)合蛋白，由識(shí)別蛋白-NLRP3、銜接蛋白-凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated specklike protein containing CARD，ASC）和Caspase-1 組成[9]。Nod樣受體（nod-like receptor，NLR）感知應(yīng)激后聚集為NLRP3 寡聚體，通過(guò)ASC募集激活Caspase-1，將無(wú)活性的前體Caspase-1活化為剪切體Caspase-1（cleaved Caspase-1），cleaved Caspase-1可切割炎癥因子IL-1β并使之成熟和釋放，參與炎癥反應(yīng)[9-10]，在缺血再灌注、遺傳性周期性發(fā)熱綜合征等疾病的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用[11]。

至于PH相關(guān)研究領(lǐng)域，有報(bào)道稱(chēng)Caspase-1可調(diào)控炎癥因子，參與PH的發(fā)生發(fā)展[12]；IL-1β可介導(dǎo)小鼠肺血管周?chē)木奘杉?xì)胞募集，促進(jìn)PASMCs異常增殖，造成肺血管重塑，與PH的疾病進(jìn)展密切相關(guān)[13]。YIN等[14]研究報(bào)道姜黃素可以通過(guò)抑制NLRP3炎性體，進(jìn)而抑制IL-1β的分泌，起到抗炎的作用。由于炎癥反應(yīng)是低氧損傷的重要病理機(jī)制之一[15]，姜黃素可能通過(guò)抑制NLRP3炎性體，進(jìn)而抑制Caspase-1的活化，從而減少I(mǎi)L-1β的成熟和釋放，減輕炎癥所致的PASMCs增殖，改善血管的重塑，最終降低HPH大鼠的肺動(dòng)脈壓力。

本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以有效降低HPH大鼠的肺動(dòng)脈壓力，明顯改善右心肥大及肺血管重塑，抑制低氧誘導(dǎo)的PASMCs異常增殖。進(jìn)一步探究其作用機(jī)制和具體靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)姜黃素可降低HPH大鼠肺勻漿以及低氧PASMCs中NLRP3、Caspase-1以及IL-1β的表達(dá)。姜黃素可能通過(guò)抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β軸減少低氧誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而改善低氧PASMCs異常增殖和HPH大鼠肺血管重塑，從而降低肺動(dòng)脈壓力，對(duì)HPH有治療作用。