潘一釗，馬君梅，黃堅(jiān)堅(jiān)，胡志妍，梅虹霞，林函，

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科；2.浙江省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

手術(shù)刺激會(huì)導(dǎo)致血漿糖皮質(zhì)激素水平升高，直至術(shù)后第8天糖皮質(zhì)激素水平才恢復(fù)正常，糖皮質(zhì)激素濃度過(guò)高會(huì)損害神經(jīng)發(fā)育并持續(xù)存在[1]。神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）作為神經(jīng)元的前體細(xì)胞，可以促進(jìn)缺氧缺血損傷模型中受損的新生兒腦中的神經(jīng)前體細(xì)胞遷移和分化，促進(jìn)感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)[2]。而糖皮質(zhì)激素暴露之后受損的神經(jīng)細(xì)胞沒(méi)有因神經(jīng)干細(xì)胞再生修復(fù)，因此我們考慮糖皮質(zhì)激素暴露直接引起NSCs的發(fā)育受損。

右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）為腎上腺α-2受體激動(dòng)劑，具有神經(jīng)保護(hù)作用，呈劑量相關(guān)性減輕七氟醚、異氟醚暴露造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷[3-4]， 且DEX對(duì)氯胺酮造成的NSCs損傷有保護(hù)作用，但未見(jiàn)有關(guān)于DEX在皮質(zhì)酮（corticosterone，CORT）暴露模型上是否具有保護(hù)作用的研究[5]。本研究采用CORT誘導(dǎo)NSCs損傷模型，探討DEX對(duì)NSCs的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 DMEM/F12和B27 supplement購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；CytoTox 96非放射性細(xì)胞毒性試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Matrigel購(gòu)自美國(guó)BD公司；CORT購(gòu)自美國(guó)MCE公司；DEX購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。Click-iTTMEdUAlexa Fluor高通道顯像試劑盒、Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；小鼠神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白巢蛋白（Nestin）和兔胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白（SRY-related HMG-box2，SOX2）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔GSK3-β抗體、兔p-GSK3-β抗體、兔β-catenin抗體、兔Cyclin D1抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；兔β-Tubulin抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RR037A購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；鼠抗兔二抗購(gòu)自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 NSCs制備、鑒定和分組：SD大鼠，體質(zhì)量250～350 g[溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（浙）2010-0044]。將雌雄SD大鼠置入交配籠里進(jìn)行交配，將觀察到陰栓日記為孕第0天（E0）。分離E15胎鼠的皮質(zhì)NSCs進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含bFGF（2% B27，20 μg/L bFGF和20 μg/L EGF） 的DMEM/F12，培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃。培養(yǎng)4～ 5 d后進(jìn)行細(xì)胞傳代，穩(wěn)定培養(yǎng)至第2代。將細(xì)胞接種于24孔板上，加入500 μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行Nestin及SOX2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，熒光顯微鏡拍照。在大鼠體內(nèi)皮質(zhì)酮作為糖皮質(zhì)激素的活性形式存在，所以本實(shí)驗(yàn)選取皮質(zhì)酮代表糖皮質(zhì)激素。進(jìn)行乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)及EdU法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞增殖時(shí)，將NSCs分為Control組、DMSO組、CORT組（1 μmol/L CORT孵育24 h）和DEX組（0.01，0.1，1 μmol/L DEX預(yù)處理1 h后，再加入CORT繼續(xù)孵育24 h）。在機(jī)制探討部分，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，1 μmol/L DEX具有神經(jīng)保護(hù)作用，所以選擇1 μmol/L作為DEX的濃度，具體分為對(duì)照組、DMSO組、CORT組（1 μmol/L CORT孵育24 h）和DEX組（1 μmol/L DEX預(yù)處理1 h后，再加入CORT繼續(xù)孵育24 h）。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)α-2受體亞型在NSCs上的表達(dá)：將細(xì)胞接種于6孔板中，提取NSCs的總RNA，測(cè)定總RNA的濃度與A260 nm/A280 nm比值，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)PCR產(chǎn)物，EB染色，紫外線下觀察α-2A受體、α-2B受體、α-2C受體的mRNA表達(dá)的結(jié)果。其引物序列見(jiàn)表1。

1.2.3 LDH釋放法檢測(cè)細(xì)胞毒性：將NSCs接種于96孔板內(nèi)并加入100 μL培養(yǎng)基，按1.2.1分組繼續(xù)處理24 h后，按照CytoTox96非放射性細(xì)胞毒性試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

表1 引物序列

1.2.4 EdU法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞增殖：將NSCs接種于24孔板上，細(xì)胞按1.2.1分組繼續(xù)處理24 h。最后 4 h加入0.1% 5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷（EdU）試劑，鏡下計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。EdU陽(yáng)性率=EdU染色的增殖細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，以此表示細(xì)胞增殖率。

1.2.5 Western blot檢測(cè)NSCs增殖相關(guān)基因的表達(dá)：將細(xì)胞接種于6孔板中，按1.2.1分組繼續(xù)處理24 h后，將蛋白裂解試劑加入至6孔板中，于冰上靜置，收集裂解液，超聲，低溫離心10 min，收取上清液。測(cè)定蛋白濃度，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入內(nèi)參蛋白兔β-Tubulin抗體和目的蛋白兔GSK3-β抗體、兔p-GSK3-β抗體、兔β-catenin抗體、兔Cyclin D1抗體，按1:2 000的滴度稀釋，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1 h；通過(guò)ECL顯色，X線膠片曝光成像。使用ImageJ軟件分析目標(biāo)蛋白條帶和內(nèi)參蛋白條帶的積分吸光度（integrated absorbance，IA），以兩者IA的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCs鑒定結(jié)果 圖1A顯示原代培養(yǎng)第二代的神經(jīng)球，進(jìn)行Nestin（紅色）和SOX2（綠色）免疫熒光染色鑒定，圖1B顯示基質(zhì)膠鋪板后進(jìn)行貼壁培養(yǎng)的NSCs，進(jìn)行Nestin（紅色）和SOX2（綠色）免疫熒光染色鑒定，細(xì)胞核進(jìn)行DAPI染色鑒定（藍(lán)色）。其中Nestin和SOX2共染細(xì)胞在DAPI細(xì)胞核染色的細(xì)胞中陽(yáng)性率超過(guò)97%，免疫熒光染色結(jié)果證明培養(yǎng)的細(xì)胞為NSCs。

圖1 神經(jīng)球（A）和單層NSCs（B）的Nestin（紅色）和SOX2（綠色）免疫熒光染色

2.2 α-2腎上腺受體亞型在NSCs上的表達(dá) 圖2所示為NSCs的總RNA進(jìn)行RT-PCR后的凝膠電泳圖，結(jié)果證明腎上腺α-2受體的3個(gè)亞型α-2A、α-2B、α-2C在NSCs上均有表達(dá)。

2.3 CORT及DEX對(duì)NSCs的細(xì)胞毒性的影響 不同處理組間LDH的釋放量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05），見(jiàn)圖3。說(shuō)明CORT、不同濃度DEX不會(huì)對(duì)NSCs 造成損傷，對(duì)神經(jīng)發(fā)生的影響與藥物的細(xì)胞毒性 無(wú)關(guān)。

2.4 DEX減輕CORT抑制NSCs的增殖 與Control組和DMSO組比，CORT組的NSCs增殖能力顯著被抑制（P＜0.05）。而0.1、0.01 μmol/L的DEX預(yù)處理對(duì)NSCs的增殖作用不明顯（P＞0.05），當(dāng)劑量增加至1 μmol/L時(shí)，NSCs的增殖能力有所恢復(fù)（P＜0.05），見(jiàn)圖4-5。后續(xù)實(shí)驗(yàn)僅檢測(cè)1 μmol/L DEX預(yù)處理對(duì)NSCs的影響。

2.5 DEX減輕CORT抑制NSCs的增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與Control組、DMSO組 比，CORT處理后p-GSK-3β、β-catenin、Cyclin D1的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），而與CORT組比，DEX預(yù)處理后p-GSK-3β、β-catenin、Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。Total GSK-3β蛋白在各組間的相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見(jiàn)圖6-7。

圖2 NSCs總RNA進(jìn)行RT-PCR后凝膠電泳圖

圖3 LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CORT和DEX對(duì)NSCs的細(xì)胞毒性（每組n=3）

圖4 EdU法檢測(cè)CORT和DEX對(duì)NSCs增殖影響的免疫熒光染色（綠色為EdU標(biāo)記新增殖細(xì)胞，藍(lán)色為Hoechst標(biāo)記總細(xì)胞，刻度尺為100 μm）

2.6 PI3K磷酸化抑制劑LY294002拮抗DEX對(duì)NSCs的促增殖作用 與Control組、DMSO組比，CORT組、CORT+1 μmol/L DEX組、CORT+1 μmol/L DEX+ LY294002組的NSCs增殖能力顯著被抑制（P＜0.05），而預(yù)先1 μmol/L DEX處理后，與CORT組比NSCs的增殖能力有所恢復(fù)，但給予DEX前再給予PI3K磷酸化抑制劑LY294002（LY294002抑制GSK-3β的磷酸化）后DEX的神經(jīng)保護(hù)作用被逆轉(zhuǎn)（P＜0.05）。見(jiàn)圖8-9。

3 討論

本研究以NSCs為研究對(duì)象，觀察了DEX減輕CORT抑制NSCs的增殖作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 μmol/L CORT會(huì)抑制NSCs的增殖，而1 μmol/L DEX可以減輕CORT對(duì)NSCs增殖的抑制。

糖皮質(zhì)激素會(huì)對(duì)神經(jīng)發(fā)育造成損傷，連續(xù)7 d給予新生鼠地塞米松導(dǎo)致齒狀回中NSCs（神經(jīng)祖細(xì)胞）顯著凋亡，導(dǎo)致齒狀回體積的持續(xù)減小，耗竭神經(jīng)祖細(xì)胞池[6]。將NSCs暴露于1 μmol/L地塞米松或1 μmol/L CORT中時(shí)，發(fā)現(xiàn)地塞米松和CORT都抑制了NSCs的增殖[7]。且地塞米松可以通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體，抑制GSK-3β蛋白Ser9 位點(diǎn)的磷酸化，促進(jìn)GSK-3β與AXIN、APC形成復(fù)合物分解胞質(zhì)內(nèi)β-catenin，使β-catenin與核內(nèi)LEF/TCF轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合減少，抑制周期蛋白的表達(dá)[8]。據(jù)報(bào)道DEX可以通過(guò)PI3K/Akt和ERK1/2通路參與對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，促進(jìn)GSK-3β蛋白Ser9位點(diǎn)的磷酸化[9]，因此我們考慮DEX和CORT是否可能通過(guò)GSK-3β這一共同靶點(diǎn)起到相互影響的作用。

Wnt信號(hào)通路與新生神經(jīng)元的發(fā)育有關(guān)，可以維持成年大腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞池，以及誘導(dǎo)新生神經(jīng)元的分化，調(diào)節(jié)發(fā)育中大腦的突觸傳遞和可塑性及神經(jīng)發(fā)生[10]。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的主要效應(yīng)物，當(dāng)β-catenin被GSK3β、Axin和APC形成的復(fù)合物持續(xù)降解，導(dǎo)致胞漿內(nèi)的β-catenin含量減少無(wú)法激活下游的LEF/TCF轉(zhuǎn)錄因子，使Cyclin D1的表達(dá)量減少[11]。GSK3β的Ser9 位點(diǎn)磷酸化可以抑制Axin和APC形成復(fù)合物分解β-catenin，然后促進(jìn)β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，從而激活下游的LEF/TCF轉(zhuǎn)錄因子，使Cyclin D1的表達(dá)量增加[12]。

圖5 EdU法檢測(cè)CORT和DEX對(duì)NSCs增殖率的影響（每組n=3）

圖6 CORT和DEX對(duì)NSCs中p-GSK-3β、Total GSK-3β、β-catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá)的印跡圖

在本研究中1 μmol/L CORT暴露后p-GSK-3β、β-catenin、Cyclin D1的表達(dá)量減少，而總GSK-3β表達(dá)量沒(méi)有變化，所以推測(cè)CORT抑制NSCs增殖的能力可能是通過(guò)抑制GSK-3β蛋白的磷酸化實(shí)現(xiàn)的。 1 μmol/L DEX預(yù)處理后p-GSK-3β、β-catenin、 Cyclin D1的表達(dá)量增加，在DEX預(yù)處理之前通過(guò)LY294002抑制GSK-3β蛋白的磷酸化，DEX的保護(hù)作用受到了抑制。因此推測(cè)DEX通過(guò)促進(jìn)GSK-3β的磷酸化，減輕CORT抑制NSCs的增殖。

綜上所述，CORT對(duì)NSCs增殖能力的抑制可能與GSK-3β蛋白的磷酸化有關(guān)。而DEX可以通過(guò)促進(jìn)GSK-3β蛋白的磷酸化減輕CORT抑制NSCs的增殖。由于本研究為離體實(shí)驗(yàn)，尚需進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明。

圖7 CORT和DEX對(duì)NSCs中P-GSK-3β、Total-GSK-3β、β-catenin、Cyclin D1相對(duì)表達(dá)量的影響

圖8 EdU法檢測(cè)CORT和DEX對(duì)NSCs增殖影響的免疫熒光染色（綠色為EdU標(biāo)記新增殖細(xì)胞，藍(lán)色為Hoechst標(biāo)記總細(xì)胞，刻度尺為100 μm）

圖9 EdU法檢測(cè)CORT和DEX對(duì)NSCs增殖率的影響