劉欣，謝旺凱，孫祥威，陳治元，沈賢，薛向陽

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院胃腸外科，浙江溫州325027；2.溫州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室，浙江溫州325035）

人巨細胞病毒（humancy to megalovirus，HCMV）是一種廣泛存在于人群中的病毒，屬于β皰疹病毒家亞科，包含236kb的雙鏈DNA基因組，其人群攜帶率在嬰幼兒約為20%，隨著年齡的增長在發(fā)展中國家可達100%[1]。在免疫功能正常的個體，HCMV感染通常無明顯臨床癥狀，而其在免疫功能缺陷的個體，如HIV患者，或者在接受器官移植的患者中會再次激活而導致嚴重的并發(fā)癥，甚至危及生命[2]。UL111A基因在HCMV中編碼細胞因子，其主要編碼cmvIL-10和LAcmvIL-10蛋白，由于它們與hIL-10有一定的同源性，可以通過與IL-10R結(jié)合而發(fā)揮免疫抑制調(diào)節(jié)功能[3-6]。目前AD169 UL111A基因在人包皮成纖維細胞（human foreskin fibroblast，HFF）中的轉(zhuǎn)錄本的情況還未見報道，本研究旨在探究HCMV增殖性感染不同時間點UL111A基因轉(zhuǎn)錄本特征及變化。

1 材料和方法

1.1 材料 HFF和293T細胞購自中國科學院細胞庫，AD169 病毒株購自美國ATCC，TRIzol、Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen公司，pcDNA3.1載體為本實驗室保存，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FSQ301）購自日本TOYOBO公司，HA-Tag兔抗（#3724）和羊抗兔IgG HRP偶聯(lián)（#7074）二抗購自美國CST公司，高保真酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司，PCR反應試劑盒、pEASY-Blunt Zero Cloning Kit購自北京全式金生物有限公司，DNA回收試劑盒購自北京天根公司。

1.2 方法

1.2.1 AD169病毒感染HFF細胞：將1×105個HFF細胞鋪于6孔板中，過夜貼壁后換液，然后加入純DMEM培養(yǎng)基和感染復數(shù)MOL=1的AD169病毒液，放入37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育2 h，每隔30 min取出搖晃1次，2 h后換成含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，此時記為感染開始時間，隨后感染12 h，24 h，48 h，72 h，5 d，7 d，9 d后提取RNA用于后續(xù)實驗。

1.2.2 RNA提取和RT-PCR：根據(jù)TRIzol RNA提取試劑說明書，分別提取12 h，24 h，48 h，72 h，5 d， 7 d，9 d不同時間點的感染AD169病毒的HFF細胞的RNA，測濃度后按照ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒說明書，分別取 0.5 μg RNA反轉(zhuǎn)錄10 μL體系cDNA，各自取1 μL cDNA模板按照PCR反應試劑說明書行PCR檢測（循環(huán)數(shù)29個），引物為vIL-10AFP，vIL-10ARP，然后再分別取1 μL上述PCR產(chǎn)物稀釋50倍后再取1 μL作為模板行PCR檢測（循環(huán)數(shù)35個），引物為vIL-10CFP，vIL-10CRP，vIL-10EFP，vIL-10ERP，vIL-10GFP，vIL-10GRP，vIL-10IFP，vIL-10FRP，引物序列見表1。

1.2.3 UL111A轉(zhuǎn)錄本檢測和測序鑒定：分別取 12 h，24 h，48 h，72 h，5 d，7 d，9 d不同時間點經(jīng)反轉(zhuǎn)錄cDNA，經(jīng)高保真酶PCR后行膠回收然后連pEASY-Blunt Zero Cloning載體經(jīng)Trans1-T1感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化后涂平板，37 ℃倒置過夜，挑選單克隆送測序鑒定。PCR引物為vIL-10AFP，vIL-10ARP（見表1），條件為94 ℃完全變性5 min，35個循環(huán)的 94 ℃變性30 s，58 ℃退火，72 ℃延伸1 min，最后充分延伸10 min。

1.2.4 真核表達載體pcDNA3.1-cmvIL-10、pcDNA3.1-LAcmvIL-10和pcDNA3.1-unspliced的構(gòu)建及鑒定：使用帶BamHI/EcoRI酶切位點的轉(zhuǎn)錄本編碼區(qū)特異性引物，同時在后向引物C端加入一個HA標簽序列，PCR擴增產(chǎn)物與pcDNA3.1載體經(jīng)過酶切酶連，構(gòu)建相應的載體，提取質(zhì)粒通過Lipofectamine 2000質(zhì)粒試劑轉(zhuǎn)染293T細胞，24 h后用RIPA裂解液裂解提取細胞蛋白，15%的SDS-PAGE膠進行電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后使用HA-Tag兔抗（1:1 000）4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后，加入羊抗兔二抗（1:5 000）室溫孵育1 h，再次洗滌膜后曝光。

2 結(jié)果

2.1 HCMV UL111A基因在增殖性感染期存在3 種形式的轉(zhuǎn)錄本 以UL111A全長通用引物PCR檢測AD169感染HFF細胞24 h的cDNA，結(jié)果見圖1，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序，結(jié)果顯示的3個條帶分別為未剪切形式，LAcmvIL-10和cmvIL-10轉(zhuǎn)錄本序列。為了進一步探究轉(zhuǎn)錄本外顯子連接位點的堿基序列，圖2的測序峰圖呈現(xiàn)了結(jié)果的可靠性。U111A 3種轉(zhuǎn)錄本模式見圖3。

2.2 HCMV感染不同時間點UL111A轉(zhuǎn)錄本特征及其變化 為探索不同時間點是否存在不同的UL111A轉(zhuǎn)錄本特征變化，首先，我們使用UL111A特異性引物（見圖4）PCR檢測感染AD169 病毒的不同時間點HFF細胞的cDNA，并經(jīng)測序驗證，oLX2-12 以及oLX3-13 特異性引物擴增的產(chǎn)物顯示的2 個條帶分別為包含第1個內(nèi)含子和不包含第1個內(nèi)含子的模式，并且隨著時間的增加，剪切第1個內(nèi)含子模式越來越少。同樣的，oLX6-14和oLX6-15特異性引物擴增的產(chǎn)物主要顯示包含第2個內(nèi)含子的模式，在早期12 h或24 h，可見較弱剪切第2內(nèi)含子條帶模式。隨后我們以UL111A全長通用引物PCR檢測不同時間點感染HFF的cDNA，擴增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收連載體，挑選大量單克隆送測序進一步檢測轉(zhuǎn)錄本占比的情況，表2顯示在感染的各個時間點，未剪切形式轉(zhuǎn)錄本皆占比最多，其次為LAcmvIL-10轉(zhuǎn)錄本，而cmvIL-10轉(zhuǎn)錄本只在感染的早期（24 h）和晚期 （9 d）被檢測到。

表1 UL111A相關引物

圖1 感染AD169病毒HFF細胞24 h cDNA反轉(zhuǎn)錄圖

圖2 不同轉(zhuǎn)錄本剪切位點峰圖

2.3 CmvIL-10、LAcmvIL-10 和unspliced 3 種轉(zhuǎn)錄本均能在293T細胞中有效表達 分別將3 種轉(zhuǎn)錄本編碼區(qū)序列所構(gòu)建的真核表達載體pcDNA3.1-cmvIL-10、pcDNA3.1-LAcmvIL-10 和pcDNA3.1- unspliced質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，24 h后提取的細胞蛋白經(jīng)Western blot驗證可見目的大小的特異性條帶，而轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的293T細胞無特異性條帶，表明構(gòu)建的載體能在293T細胞中有效表達，見圖5。

3 討論

HCMV是目前已知的最大的皰疹病毒，其編碼大量病毒基因組蛋白包括細胞因子、趨化因子和它們的受體，在機體發(fā)揮相應的免疫調(diào)節(jié)功能，并且與腫瘤等疾病有密切的關聯(lián)[7-10]。巨細胞病毒AD169株完整序列在1990年首次被研究報道，其編碼了超過200多個蛋白質(zhì)[11]。在我們的研究中首次報道了AD169病毒株感染HFF細胞后，UL111A基因在其增殖性感染的不同時間點轉(zhuǎn)錄本特征，通過RT-PCR和挑選單克隆實驗檢測到了cmvIL-10、LAcmvIL-10和未剪切形式轉(zhuǎn)錄本。CmvIL-10蛋白編碼UL111A基因3個外顯子序列的175個氨基酸，盡管它與hIL-10只有約27%的同源性，但是它可以通過與hIL-10R結(jié)合發(fā)揮免疫抑制作用，如降低單核細胞主要組織相容性復合物I（major histocompatibility complex I， MHC I）和MHC II的表達，降低內(nèi)皮細胞基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，損傷體外內(nèi)皮細胞的遷移和細胞滋養(yǎng)層細胞的侵襲性[12-15]。hIL-10是一個多效價的細 胞因子，在機體炎癥和免疫功能發(fā)揮免疫抑制等作用[16]。LAcmvIL-10蛋白編碼包含第2個內(nèi)含子序列的139 個氨基酸，其終止密碼子在第2 個內(nèi)含子內(nèi)，其N端127個氨基酸與cmvIL-10蛋白相同，C端12個氨基酸不同，相似的，LAcmvIL-10同樣發(fā)揮一部分的免疫抑制功能，如抑制人初始骨髓細胞和單核細胞MHC II的表達[17]，然而其機制可能不同于cmvIL-10，如LAcmvIL-10不能誘導stat3的磷酸化，并且其下調(diào)MHC II不能通過hIL-10R的中和抗體拮抗，提示其可能通過其他途徑發(fā)揮功能[18]。未剪切形式蛋白編碼包含兩個內(nèi)含子序列的78個氨基酸，其終止密碼子在第一個內(nèi)含子內(nèi)，這與先前的報道的ORF79高度同源，ORF79是HCMV Towne病毒株上的形態(tài)改變區(qū)域（mtr II），可以發(fā)揮致癌作用誘導惡性形成[19]。之前有研究報道[20]，在AD169病毒感染的MRC-5細胞中，共發(fā)現(xiàn)8種轉(zhuǎn)錄本，但是關于各自生物學功能尚未進行深入研究。我們只發(fā)現(xiàn)其中3種轉(zhuǎn)錄本，可能是由于其他轉(zhuǎn)錄本存在極少，因此未能檢測到。UL111A基因編碼的cmvIL-10蛋白最早是在感染Towne株病毒的MRC-5細胞和感染AD169病毒的HEL299細胞的增殖性感染階段被發(fā)現(xiàn)[4，6]，而其編碼的LAcmvIL-10蛋白則是在感染Toledo株病毒的人粒-巨噬祖細胞的潛伏感染階段被發(fā)現(xiàn)，隨后的研究也證明了LAcmvIL-10蛋白同樣存在于感染了Toledo株病毒的HFF細胞的增殖性感染階段[5，21]。

圖3 UL111A 3種不同轉(zhuǎn)錄本mRNA和氨基酸模式圖

圖4 感染AD169病毒HFF細胞RT-nest PCR圖

表2 UL111A基因在AD169感染HFF細胞中的轉(zhuǎn)錄本情況

圖5 UL111A 3種轉(zhuǎn)錄本所構(gòu)建的真核表達載體Western blot驗證圖

總的來說，我們的研究闡明了感染AD169病毒的HFF在HCMV增殖性感染不同時間點的轉(zhuǎn)錄本特征及其變化，但關于其機制還有待進一步研究。