羅彬彬 王 鵬 陳 永 張紅艷

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷科，江西 南昌 330006 ）

我國(guó)的糖尿病發(fā)病率正逐漸增加。據(jù)估計(jì)，2015年全球糖尿病人數(shù)已達(dá)到4.15億;到2019年，全球有4.63億糖尿病患者(20～79歲)。預(yù)計(jì)到2045年，這一數(shù)字將增至6.93億，糖尿病患病率將升至9.9%[1]。糖尿病足潰瘍（DFU）是糖尿病最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的并發(fā)癥，傳統(tǒng)療法包括清除壞死組織、血管重建手術(shù)、控制感染、控制血糖、足部護(hù)理教育、肢體抬高等[2]。然而，這些治療往往不能確保令人滿意的傷口愈合效果，仍有很高的風(fēng)險(xiǎn),致殘率、致死率偏高，且容易復(fù)發(fā)。DFU嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和護(hù)理質(zhì)量。因此，亟需探索新的治療方法促進(jìn)DFU患者創(chuàng)面的愈合，改善患者的預(yù)后。

DFU的發(fā)病與糖尿病所致血管和神經(jīng)病變有關(guān)，但確切的機(jī)制尚未完全闡明。持續(xù)高血糖狀態(tài)可以通過(guò)不同的機(jī)制影響傷口愈合，如真皮萎縮、成纖維細(xì)胞數(shù)量減少和增殖能力下降、前膠原合成減少、創(chuàng)面中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)水平增加等，使膠原纖維的破壞速度比它們的形成速度更快，從而延緩了足夠肉芽組織的形成。糖尿病也可能通過(guò)激活多聚ADP核糖聚合酶(PARP)而損害皮膚結(jié)構(gòu)和破壞皮膚微血管功能，PARP的增加，膠原蛋白合成和分泌的減少、破壞的增加，都可導(dǎo)致DFU的發(fā)生[3]。高血糖狀態(tài)可以通過(guò)不同的機(jī)制阻礙傷口愈合，糖尿病神經(jīng)病變導(dǎo)致的感覺(jué)缺失可以加重DFU患者足部皮膚的損傷,使DFU遷延難愈；此外，細(xì)胞增殖受損和對(duì)生長(zhǎng)因子的抵抗都可能會(huì)延遲DFU傷口的愈合。糖尿病患者中巨噬細(xì)胞遷移受損和信號(hào)分子釋放不足也抑制了新血管的形成。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)各種干細(xì)胞移植治療下肢缺血性相關(guān)疾病進(jìn)行了大量的研究，并取得了顯著的療效。本文主要從干細(xì)胞移植治療DFU的理論機(jī)制，以及不同類型的干細(xì)胞移植治療DFU的研究進(jìn)展作一綜述，為糖尿病足的治療提供參考。

1 干細(xì)胞用于治療DFU的理論依據(jù)

傷口愈合是一系列復(fù)雜的生理反應(yīng)，大致分為3個(gè)階段：急性炎癥期，細(xì)胞增殖期，創(chuàng)面重塑期。機(jī)體受傷后，進(jìn)入急性炎癥期，首先是血小板聚集，凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)啟動(dòng)止血，其次趨化因子血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)釋放并吸引巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞到傷口周圍，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞清除傷口的碎片和病原體。在細(xì)胞增殖期，細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素1 (IL - 1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的釋放，促進(jìn)傷口周圍的細(xì)胞增殖[4-5]。在創(chuàng)面重塑期，纖維連接素和透明質(zhì)酸(HA)組成的臨時(shí)基質(zhì)在毛囊細(xì)胞和鄰近表皮干細(xì)胞的幫助下發(fā)生上皮化，成纖維細(xì)胞將以纖維連接素為基礎(chǔ)的微纖維轉(zhuǎn)化為富含膠原蛋白的纖維，成纖維細(xì)胞還負(fù)責(zé)產(chǎn)生纖維連接蛋白和蛋白多糖，這些物質(zhì)形成細(xì)胞外基質(zhì)，在細(xì)胞外基質(zhì)上發(fā)生再上皮化和愈合[6]。而發(fā)生DFU 后，DFU誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞在生長(zhǎng)因子的作用下增殖能力下降，巨噬細(xì)胞功能下降，膠原積累減少，角質(zhì)形成細(xì)胞和纖維母細(xì)胞遷移和增殖能力低下，表皮干細(xì)胞能力受損，血管生成減少。血管生成重建了受傷組織的灌注，并為組織提供關(guān)鍵的營(yíng)養(yǎng)，是傷口愈合的重要機(jī)制之一。此外，糖尿病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞向損傷部位的遷移潛能減弱，進(jìn)一步抑制了血管生成潛能。內(nèi)皮細(xì)胞是血管形成和VEGF表達(dá)上調(diào)的關(guān)鍵。這些因素最終都會(huì)影響DFU的傷口愈合[7]。

目前，DFU的常規(guī)治療包括藥物治療、物理治療和外科治療，多存在患者住院時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用昂貴、傷口很難完全恢復(fù)的問(wèn)題。干細(xì)胞是一種未分化細(xì)胞，具有自我更新的能力。干細(xì)胞被移植到傷口后，能夠促進(jìn)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的分泌；以直接和旁分泌的方式促進(jìn)細(xì)胞聚集、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)和血管生成；并且在一定的條件下，可以分化成功能細(xì)胞，并生成多種組織器官[8]。因此，干細(xì)胞移植成為治療DFU的新希望。干細(xì)胞可以通過(guò)合成和分泌細(xì)胞因子以及分化成各種類型的細(xì)胞如肌成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等參與創(chuàng)面的愈合[9-11]。因此，我們可以利用干細(xì)胞具有分化潛能這一特點(diǎn)，通過(guò)干細(xì)胞移植促進(jìn)DFU患者血管內(nèi)皮細(xì)胞因子的表達(dá)和新生毛細(xì)血管的形成，以達(dá)到改善患肢血供、治療DFU的目的[12-13]。

2 干細(xì)胞的來(lái)源和分類

目前，用于移植治療DFU的干細(xì)胞主要分為同種異體干細(xì)胞和自體干細(xì)胞。

2.1 同種異體干細(xì)胞 同種異體干細(xì)胞包括臍帶血干細(xì)胞（UCB-MSCs）、胚胎干細(xì)胞(ESCs)、人脫落的乳牙干細(xì) 胞（stem cells from human exfoliated deciduous teech,SHED）以及胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（PDMSCs），它們是間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）獲得的主要來(lái)源。MSCs具有較強(qiáng)的再生和分化能力。目前，有關(guān)MSCs治療DFU的研究最為廣泛。

2.1.1 UCB-MSCs UCB-MSCs與人的其他干細(xì)胞具有相似的形態(tài)學(xué)和相似的細(xì)胞表面抗原，具有分化成骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)的潛能[14]。此外，UCB-MSCs具有細(xì)胞倍增時(shí)間短、存活時(shí)間長(zhǎng)、抗炎活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。因此，UCB-MSCs被認(rèn)為是一種非常方便和具有多種用途的干細(xì)胞。動(dòng)物研究表明，人UCB-MSCs通過(guò)在DFU大鼠腓腸肌和股神經(jīng)中表達(dá)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，能夠預(yù)防或治療DFU[15]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，將異種UCB-MSCs注入DFU患者創(chuàng)面，可在體內(nèi)產(chǎn)生VEGF和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF），使糖尿病創(chuàng)面更具有愈合的能力[16]。在移植UCB-MSCs后，DFU患者整體愈合率為87.5%，高于傳統(tǒng)方法治療DFU的愈合率，也高于其他治療模式的愈合率[17]，提示UCB-MSCs可能有助于改善此類慢性傷口的愈合。與其他來(lái)源的干細(xì)胞相比，從人臍帶血中分離出的MSCs很容易獲得和精制，但由于目前臍帶血的保存成本很高，以及涉及隱私和倫理方面的問(wèn)題，UCB-MSCs在DFU中的應(yīng)用較少[18]。

2.1.2 ESCs 胚胎干細(xì)胞是一種具有多分化潛能、自我更新強(qiáng)的細(xì)胞，來(lái)自于體外受精胚胎的內(nèi)部細(xì)胞群。胚胎干細(xì)胞可以作為未分化細(xì)胞系保存在細(xì)胞培養(yǎng)基中,并可以被誘導(dǎo)分化成任何細(xì)胞系。從胚胎干細(xì)胞中提取的內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞可以分泌生長(zhǎng)因子，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。在大鼠糖尿病模型實(shí)驗(yàn)研究中，Lee等[19]通過(guò)在創(chuàng)面局部應(yīng)用未分化ESCs，證實(shí)了其可加速糖尿病大鼠的創(chuàng)面愈合。此外，與未予治療的傷口相比，使用ESCs治療的傷口表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、VEGF和纖維連接蛋白水平顯著增加，促進(jìn)了傷口愈合。但目前ESCs應(yīng)用于DFU臨床治療的報(bào)道較少，部分報(bào)道提示其存在安全性等方面的風(fēng)險(xiǎn)。因此，還需要更多的實(shí)驗(yàn)研究以確定其安全性與可行性。

2.1.3 SHED 大多數(shù)MSCs，來(lái)源于骨髓或臍帶，這對(duì)于供體來(lái)說(shuō)是個(gè)侵入性的過(guò)程，對(duì)供體有傷害，并且臍帶來(lái)源非常有限。近年來(lái)，來(lái)自SHED的干細(xì)胞作為一種新型干細(xì)胞來(lái)源引起了廣泛的關(guān)注，它可以減輕對(duì)供體的侵襲性和骨髓抽吸時(shí)的創(chuàng)傷，并解決了供體來(lái)源有限的問(wèn)題。SHED具有多向分化、自我更新和高度增殖的能力，還具有較強(qiáng)的神經(jīng)修復(fù)和血管再生的能力，是一種組織再生醫(yī)學(xué)中前景較好的干細(xì)胞[20-21]。經(jīng)SHED處理的施萬(wàn)細(xì)胞含有多種細(xì)胞因子和趨化因子，可以通過(guò)復(fù)雜的過(guò)程促進(jìn)周圍神經(jīng)的再生，施萬(wàn)細(xì)胞自身的增殖、遷移能力增強(qiáng)，并且部分神經(jīng)元、細(xì)胞外基質(zhì)和血管生成相關(guān)基因的表達(dá)顯著增強(qiáng)，可觀察到細(xì)胞活力明顯增加，其分泌的多種營(yíng)養(yǎng)因子可通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)周圍神經(jīng)的再生[22]。SHED為周圍神經(jīng)再生創(chuàng)造了更理想的細(xì)胞外微環(huán)鏡，因此，SHED可能為創(chuàng)面修復(fù)提供新的治療方法。SHED還可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，分泌多種生長(zhǎng)因子，加速新生毛細(xì)血管生成[23]。但目前，有關(guān)SHED用于人體DFU治療的臨床研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

2.1.4 PDMSCs 骨髓是MSCs的主要細(xì)胞來(lái)源，而人類胎盤是更好的選擇。首先，PDMSCs容易獲得，不會(huì)引起倫理沖突；其次，也是最重要的一點(diǎn)，與骨髓相比，人類胎盤中可以分離出更多的干細(xì)胞；第三，人類胎盤具有較低的免疫原性。PDMSCs具有多向分化能力以及分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)創(chuàng)面愈合的能力。將PDMSCs加海藻酸鈉粉制成PDMSCs水凝膠，可以維持PDMSCs的活性和細(xì)胞相容性；將其覆蓋于DFU患者創(chuàng)面，可以明顯促進(jìn)糖尿病患者創(chuàng)面愈合并改善創(chuàng)面狀況[24]。PDMSCs促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的可能機(jī)制：一方面，PDMSCs通過(guò)誘導(dǎo)潰瘍組織中的新生血管生成以及增加膠原蛋白生成，促進(jìn)傷口愈合；另一方面，PDMSCs還可以分泌大量的血管生長(zhǎng)因子，包括VEGF、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、bFGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）等，促進(jìn)潰瘍的修復(fù)[25-26]。此外，糖尿病動(dòng)物模型創(chuàng)面研究結(jié)果也表明，PDMSCs能顯著改善缺血肢體的血流量、毛細(xì)血管密度和肢體功能，減少氧化應(yīng)激和內(nèi)皮損傷[27]。

2.2 自體干細(xì)胞 目前，干細(xì)胞移植的來(lái)源，主要以骨髓、外周血、臍帶血為多。其中，又以自體干細(xì)胞移植為多。自體干細(xì)胞包括自體BMSCs、自體外周血干細(xì)胞和自體脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞（ADSCs）。自體干細(xì)胞移植主要以自體BMSCs和自體外周血干細(xì)胞為多。

2.2.1 自體BMSCs 骨髓是獲得MSCs最常見(jiàn)的組織之一，BMSCs不受免疫限制，不易被細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞識(shí)別消滅，并且可以減少細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的形成，介導(dǎo)創(chuàng)面局部免疫功能，通過(guò)免疫調(diào)節(jié)、分泌多種生長(zhǎng)因子刺激細(xì)胞增殖和分化，改善DFU的微循環(huán)，促進(jìn)DFU修復(fù)。因此，BMSCs移植是DFU的一種安全方法，具有較好的療效。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明， BMSCs無(wú)論是經(jīng)創(chuàng)緣皮下移植還是經(jīng)小腿肌內(nèi)移植，都能夠向皮膚受傷部位周邊遷移，通過(guò)旁分泌生長(zhǎng)因子，促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，通過(guò)增加血管生成因子IGF-1、EGF和白細(xì)胞介素-8，刺激血管生成和增加周圍組織再生，促進(jìn)細(xì)胞增殖，降低炎癥反應(yīng)，加速創(chuàng)面愈合；并可通過(guò)表達(dá)角化細(xì)胞特異性蛋白和細(xì)胞角蛋白，增強(qiáng)創(chuàng)面的再上皮化，促進(jìn)大鼠糖尿病潰瘍的愈合[28]。尤其是經(jīng)小腿肌內(nèi)移植后，在創(chuàng)面愈合的后期，VEGF的表達(dá)水平顯著高于其他大鼠。臨床研究也表明，BMSCs移植可促進(jìn)患者血流重建和創(chuàng)面愈合，表明BMSCs可能是治療DFU的可靠治療方案[29]。

2.2.2 自體外周血干細(xì)胞 自體外周血干細(xì)胞移植已被提供給世界各地越來(lái)越多的患者，其操作并不復(fù)雜，易為患者所接受。在正常生理情況下，人體外周血干細(xì)胞含量很少，一般通過(guò)人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)來(lái)動(dòng)員來(lái)自骨髓的外周血干細(xì)胞，促進(jìn)其釋放到外周血。這是干細(xì)胞移植治療中動(dòng)員干細(xì)胞的主要方法，也可用于外周血干細(xì)胞移植治療下肢缺血性疾病。一般G-CSF給藥后4～5 d，外周血CD34+細(xì)胞數(shù)量可達(dá)到動(dòng)員前的40～80倍；然而，如果G-CSF停藥1周，外周血CD34+細(xì)胞數(shù)量會(huì)逐漸恢復(fù)到基線水平[30]。此外，G-CSF可調(diào)動(dòng)骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)進(jìn)入外周血中，促進(jìn)缺血區(qū)血管生成。近年來(lái)，隨著血細(xì)胞分離技術(shù)的發(fā)展，促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞進(jìn)入外周血液中后對(duì)其進(jìn)一步分離純化成為可能。經(jīng)過(guò)骨髓干細(xì)胞的釋放、外周血細(xì)胞的分離和濃縮，可用于治療的干細(xì)胞的濃度和數(shù)量顯著增加。Xu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病足壞疽患者應(yīng)用自體外周血干細(xì)胞后，其疼痛、患肢冷感、間歇性跛行、潰瘍等癥狀明顯改善；移植后1個(gè)月，激光多普勒掃描檢測(cè)外周血流量幅值和血流灌注量較移植前明顯改善；下動(dòng)脈數(shù)字減影血管造影（DSA）成像顯示新的側(cè)支血管形成明顯增加。這表明，應(yīng)用自體外周血干細(xì)胞能極大地改善DFU的血運(yùn)情況,增加患肢血流量，緩解患肢疼痛，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，是一種潛在的有效治療方式。

2.2.3 自體ADSCs 脂肪組織傳統(tǒng)上被認(rèn)為是一種儲(chǔ)能組織，由脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及其他細(xì)胞組成。ADSCs可從人體脂肪組織中大量分離，與BMSCs相比，ADSCs具有在人體組織中含量豐富、不斷更新，且易于分離、擴(kuò)增快、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)。從患者自身皮下脂肪組織中分離出來(lái)的ADSCs稱為自體ADSCs。ADSCs也可以從同種的另一個(gè)個(gè)體或異種的脂肪組織中獲得。研究表明，ADSCs具有增加肉芽組織形成和增強(qiáng)組織上皮化的能力，并釋放體內(nèi)生長(zhǎng)因子， TGF -β1、TGF-β3 、VEGF、HGF、bFGF-2等，促進(jìn)新生血管的形成[31-32]；還可通過(guò)增加創(chuàng)面膠原蛋白的分泌和沉積，參與受損組織再生；并刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和分化，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎的作用，促進(jìn)DFU創(chuàng)面潰瘍的修復(fù)[33]。因此，未來(lái)ADSCs移植可能是改善糖尿病患者足部潰瘍的一種新策略。

3 總 結(jié)

干細(xì)胞來(lái)源豐富，增殖能力強(qiáng)，易于分離。移植的干細(xì)胞在一定條件下分泌大量細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，并可以分化成內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)毛細(xì)血管形成，增加外周血供，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。MSCs對(duì)糖尿病足的改善涉及多種作用機(jī)制，如BMSCs通過(guò)促進(jìn)胰島β細(xì)胞功能改善胰島素抵抗，并通過(guò)部分重建胰島功能，有效改善2型糖尿病患者高血糖狀況；在糖尿病早期輸注MSCs不僅可促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素降血糖功能，還可以減弱機(jī)體胰島素抵抗，而晚期輸注MSCs僅能減弱機(jī)體胰島素抵抗[34]。自體干細(xì)胞由于具有免疫原性低、倫理問(wèn)題較少、細(xì)胞來(lái)源豐富、易于分離提取等優(yōu)勢(shì)，成為一種很有前途的DFU治療方法，但其具體機(jī)制尚不明確，其遠(yuǎn)期療效還需長(zhǎng)時(shí)間的觀察研究。因此，未來(lái)需要進(jìn)一步探討如何優(yōu)化干細(xì)胞治療的程序，如確定最佳劑量、移植頻率、移植途徑以及干細(xì)胞的原始亞群。此外，干細(xì)胞移植治療DFU的安全性和有效性還需要更大的樣本量和更全面的臨床試驗(yàn)來(lái)確定。