侯鈞杰，邵雙運，郭學(xué)謙，何玉環(huán)，彭燔，王萍

1. 北京交通大學(xué) 理學(xué)院，北京 100044；2. 首都醫(yī)科大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院（首都醫(yī)科大學(xué)臨床生物力學(xué)應(yīng)用研究北京市重點實驗室），北京 100069

引言

許多眼病，比如年齡相關(guān)性黃斑變性、色素性視網(wǎng)膜炎、青光眼和糖尿病視網(wǎng)膜病變等都會產(chǎn)生視網(wǎng)膜神經(jīng)功能障礙，如果不及時采用適當(dāng)?shù)母深A(yù)措施，可能會導(dǎo)致完全失明。視網(wǎng)膜感光細胞或內(nèi)層視網(wǎng)膜神經(jīng)的病理生理性發(fā)生改變以后，都有可能導(dǎo)致上述的眼病，當(dāng)患者檢查出視野缺損之前，就已經(jīng)有大量的視網(wǎng)膜節(jié)細胞凋亡，對視網(wǎng)膜造成了不可逆的傷害。

近年來，成像技術(shù)的發(fā)展為臨床醫(yī)生和研究人員提供了高空間分辨率的手段來揭示視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)[1-4]。雖然這些技術(shù)具有檢測視網(wǎng)膜疾病相關(guān)的解剖學(xué)變化的潛力，但它們不能提供視網(wǎng)膜活動的功能評估。視網(wǎng)膜電圖是在臨床環(huán)境和實驗室中研究視網(wǎng)膜功能的最常用方法[5-8]，然而，這種方法的空間分辨率比較低。內(nèi)源光信號（Intrinsic Optical Signals，IOSs）探測技術(shù)是一種無創(chuàng)非接觸光學(xué)探測方法，具有高時間分辨率和空間分辨率特征，它直接探測由生物組織反射、散射或者透射光信號的變化，無需對組織染色或施加熒光標記等外源性物質(zhì)，不會影響生物體的正常活動，是一種非常有前景的生物體功能檢查技術(shù)[9]。IOSs 探測技術(shù)前期應(yīng)用到了大腦皮質(zhì)活動的研究方面，并表現(xiàn)出了極大的優(yōu)越性[10-11]，于是該技術(shù)被研究者應(yīng)用到視網(wǎng)膜的功能研究中。

然而，這種方法在視網(wǎng)膜研究和診斷的實際應(yīng)用中具有挑戰(zhàn)性。IOSs 比較微弱，容易被各種噪聲所干擾。實驗系統(tǒng)中照明光源的光強波動、拍攝相機的內(nèi)部噪聲、光路的機械振動等，都會影響成像的質(zhì)量。因此，除了有效地提高設(shè)備的穩(wěn)定性外，另外一個重要的方法就是利用去噪算法對信號進行處理來最大限度地提高信號的信噪比。為了提高信噪比，多組數(shù)據(jù)疊加取平均[12]、中值濾波[13]、均值濾波、高斯濾波[14]等用來對信號進行去噪，在應(yīng)用上述濾波時，都是結(jié)合多組數(shù)據(jù)疊加取平均對信號進行去噪。Zhang 等[15]為了降低數(shù)據(jù)采集的次數(shù)，開發(fā)了一種新的數(shù)據(jù)處理方法，選取可見光刺激的區(qū)域，在該區(qū)域中設(shè)置光強閾值，將滿足閾值的像素點提取出來進行平均得出高信噪比的IOSs，不需要多組數(shù)據(jù)疊加取平均，單次實驗數(shù)據(jù)就實現(xiàn)對信號的提取，但是該方法是對圖像中每一個像素逐一進行計算，處理過程比較耗時。

目前最常用的方法是連續(xù)采集多組數(shù)據(jù)疊加取平均，而且平均數(shù)據(jù)的組數(shù)相對較多（10～15 組）[12-14]，這種方法在采集數(shù)據(jù)時比較耗時。本文選取Symlets 小波函數(shù)對IOSs 進行處理，降低了數(shù)據(jù)平均組數(shù)的同時，不會降低信號的信噪比。

1 IOSs的探測

采集圖像的實驗裝置如圖1 所示。成像系統(tǒng)由兩路光組成，近紅外光用來照明視網(wǎng)膜樣本并記錄信號，可見光用來刺激視網(wǎng)膜。本文選取的相機型號為PIKE F032 B，最大分辨率為640×480，傳輸速度為800 Mb/s，滿足實驗所需。近紅外光是由850 nm 的LED 來產(chǎn)生，功率為13 mW，可見光由波長范圍492～577 nm 的綠光LED 來提供，光強大小為9 LUX。選取四倍物鏡以獲得清晰大鼠視網(wǎng)膜圖像，采用CCD 相機進行信號的采集，相機前加紅外濾光片可以有效降低可見光透過率，提高圖像質(zhì)量。

圖1 透射式內(nèi)源光信號采集系統(tǒng)以及光路圖

本研究以SD 成年大鼠離體視網(wǎng)膜為研究對象，體重300～400 g。實驗前對大鼠進行12 h 暗處理，并在暗室中將大鼠麻醉。充分麻醉后取下眼球，將眼球浸沒于視網(wǎng)膜活性保持液中，快速剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜樣本，視網(wǎng)膜取出后放置在提前準備好的載玻片上，并令視網(wǎng)膜充分浸潤在視網(wǎng)膜活性保持液中以保持視網(wǎng)膜活性。

本文中CCD 相機采集頻率為250 幀/s，分辨率為320×240，采集總時長為8 s，包括500 ms 刺激前記錄階段，刺激時間為100 ms 的刺激階段，刺激后的圖像記錄階段。實驗在暗室中完成，除記錄光源常亮，可見光源刺激階段亮外，無任何其他光源，探測流程如圖2 所示。

圖2 數(shù)據(jù)采集流程圖

2 信號處理

2.1 IOSs的獲取

IOSs 通過ΔI/I 來獲得，其中ΔI 是視網(wǎng)膜受刺激后產(chǎn)生的動態(tài)光強變化，I 是背景光強[16]。

首先，將可見光刺激開始前所記錄的圖像進行像素平均，每個像素的像素平均強度作為其對應(yīng)像素的背景光強。

其中，Iref表示可見光刺激前m 幀連續(xù)的圖像在刺激前平均得到的背景光強，作為計算IOSs 差分的參考基準。

其次，將同組的每幀圖像都減去背景光強，得到每個像素的光強變化。

其中，It(x,y)是坐標為(x,y)的像素點在t 時刻的光強大小，ΔIt(x,y)即為該時刻坐標為(x,y)的像素點的光強變化。

最后，ΔIt(x,y)/Iref(x,y)圖像序列用來顯示與視網(wǎng)膜活動相關(guān)的動態(tài)光學(xué)變化，即IOSs。

2.2 小波去噪

2.2.1 小波基函數(shù)的選取

小波變換是對時域進行處理的一種方法，具有對稱性、正交性、緊支性等基本性質(zhì)。與標準傅立葉變換相比，小波變換具有十分明顯的特點：同時具有信號在時間和頻率上的局部特性，這一特征又稱之為小波變換的“時-頻”定位特性[17]。小波就是滿足公式(4)的函數(shù)通過伸縮平移而產(chǎn)生的一個函數(shù)簇[18]。

在信號處理過程中，小波基的選擇是一個首要的問題，不同的小波基函數(shù)處理同一個信號，會得到不一樣的變換結(jié)果。目前常用的小波函數(shù)有：Haar 小波、Daubechies（dbN）小波、Symlets（sym N）小波、Morlet（morl)小波、MexicanHat（mexh）小波、Meyer（meyr）小波等。表1列出了這幾種常用小波函數(shù)的性質(zhì)。

表1 常用小波函數(shù)的主要性質(zhì)

由于IOSs 信噪比比較低。適合對IOSs 去噪的小波函數(shù)一定要具有對稱性、緊支性以及正交性的特點。對稱性是為了確保信號在分解和重構(gòu)時不會產(chǎn)生信號的失真；緊支性，可以保證比較好的“時-頻”局部特性；正交性好是為了保證小波分解后信號重構(gòu)的精度，而雙正交性小波能夠同時具有緊支性和對稱性等優(yōu)點，因此也可以選擇具有雙正交性小波函數(shù)。

根據(jù)表1 中給出的常用的小波函數(shù)的性質(zhì)可以看出，滿足上述條件的有Haar 小波、Daubechies（dbN）小波以及Symlets（sym N）小波。而Haar 小波就是Daubechies（dbN）小波N=1 時的情況，因此，初步判斷Daubechies（dbN）小波和Symlets（sym N）小波適合用于IOSs 的處理。在眾多的小波基中，Symlets 小波函數(shù)具有線性相位，光滑性好并且計算簡單等優(yōu)點。與db 小波相比，在連續(xù)性、支撐長度以及濾波器長度等一致，但是Symlets 小波具有更好的對稱性，是對db 小波的一種提升，在圖像處理中具有非常好的應(yīng)用價值[19]。因此本文選取的小波基函數(shù)為Symlets小波函數(shù)。

2.2.2 Symlets小波函數(shù)及分解層數(shù)的確定

為有效降低信號噪聲，將得到的視網(wǎng)膜圖像（320×240）分為16×12 個區(qū)域，如圖3a 所示，對各個區(qū)域（20×20）進行像素平均，即可以觀察視網(wǎng)膜每個分區(qū)內(nèi)的IOSs，如圖3b 所示。

將連續(xù)采集的兩組實驗數(shù)據(jù)進行平均后得到如圖3b樣式每個分區(qū)內(nèi)的IOSs 圖像，選取其中一個分區(qū)內(nèi)的IOS 圖像視為原始信號（圖4：橫坐標為相機采集數(shù)據(jù)所需時間8 s；縱坐標為ΔIt(x,y)/Iref(x,y)比值大小，代表與視網(wǎng)膜活動相關(guān)的動態(tài)光學(xué)變化）。確保時域和頻域局部性能之間的平衡，選取Sym3～Sym8 小波函數(shù)對原始信號進行6層和7 層小波分解，并計算各個小波函數(shù)處理后信號的信噪比，如表2 所示。

圖3 視網(wǎng)膜分區(qū)圖

圖4 原始信號

表2 SymN小波函數(shù)對原始信號處理后的信噪比

信噪比計算的公式如下：

公式中，SNR 為信噪比，Ps 為處理后的信號，Pn 為帶噪信號。本節(jié)中原始信號為帶噪信號。

由表2 可知，Sym 族中任一小波函數(shù)對原始信號6 層分解后信噪比均大于7 層分解，Sym5 小波在Sym 族中信噪比最大。因此，Sym 族中Sym5 小波表現(xiàn)最好，分解層數(shù)為6 層。如圖5 所示，使用Sym5 小波對原始信號進行處理后信號的細節(jié)比原始信號更加清晰。

圖5 Sym5小波去噪后IOS圖像

2.3 平滑去噪

2.3.1 直線滑動平均法

該方法主要根據(jù)某一點臨近點的波幅來對該點進行波幅修正，從而達到去噪的目的。分為簡單平均法以及臨近點加權(quán)平均，一般選取5 個數(shù)據(jù)點，基本計算公式為：

x 為采樣數(shù)據(jù)，y 為平滑處理后的數(shù)據(jù)，m 為數(shù)據(jù)點數(shù)，N 的取值為臨近采樣點數(shù)的一半，hn為加權(quán)平均因子，且滿足

對于簡單平均法

該方法就是利用最小二乘法原理對離散數(shù)據(jù)進行線性平滑得到方法。5 點滑動平均(N=2)的計算公式為：

其中，i=3,4,…,m-2。

2.3.2 五點三次平滑法

該方法是利用最小二乘法對離散數(shù)據(jù)進行三次最小二乘多項式平滑的方法，該方法的公式如下：

其中，i=3,4,…,m-2。

使用上述兩種平滑去噪對原始信號進行處理，結(jié)果如圖6 所示。對比可以看出直線滑動平均法（圖6a）的去噪效果要比五點三次平滑（圖6b）去噪后效果要好，因此平滑去噪中選取直線滑動平均法來對信號進行去噪。

3 信號分析及討論

在某些情況下，離體視網(wǎng)膜會受損并且存在空白區(qū)域（圖7a），在有視網(wǎng)膜（圖7b）和無視網(wǎng)膜（圖7c）的區(qū)域中顯示的IOS 圖像表明探測系統(tǒng)穩(wěn)定良好。

圖6 平滑去噪后IOS圖像

圖7 不同視網(wǎng)膜分區(qū)內(nèi)的內(nèi)源光信號

在相同的實驗條件下，不同去噪方式的結(jié)果對比如圖8 所示，圖8a 是五組連續(xù)試驗中的數(shù)據(jù)取平均值得出的結(jié)果，數(shù)據(jù)處理時間平均為285 s，圖8b 為兩組連續(xù)試驗數(shù)據(jù)平均+6 層Sym5 小波去噪處理結(jié)果，數(shù)據(jù)處理時間平均為210 s，圖8c 為兩組連續(xù)試驗數(shù)據(jù)平均+直線滑動平均法去噪處理結(jié)果，數(shù)據(jù)處理時間平均為232 s。因此，利用Sym5 小波對信號進行去噪處理所用時間最短，較5 組數(shù)據(jù)平均縮短75 s。在數(shù)據(jù)采集時，每組數(shù)據(jù)采集時間為8 s。因此，利用Sym5 小波函數(shù)對信號處理較5 組數(shù)據(jù)平均在數(shù)據(jù)采集過程中所需的時間縮短24 s。對比發(fā)現(xiàn)，在減少平均數(shù)據(jù)組數(shù)的條件下，Sym5 小波函數(shù)處理信號后的效果更好。

利用上述三種去噪方法對信號處理后得到如圖3b 樣式每個分區(qū)內(nèi)的IOSs 圖像，隨機選取10 個分區(qū)內(nèi)的IOSs 進行信噪比的計算。信噪比計算公式如公式(5)所示，本節(jié)中帶噪信號是在相同實驗條件下處理一組實驗數(shù)據(jù)后得到的信號。不同去噪方法對信號處理后的信噪比，如表3 所示。

對比信噪比發(fā)現(xiàn)Sym5 小波函數(shù)處理信號后信號的信噪比是最高的，較5組數(shù)據(jù)平均的信噪比最高可提升3.56倍。利用上述三種去噪方法處理了8 次實驗的實驗數(shù)據(jù)，取相同位置計算信噪比（表4）?？梢钥闯鲈诙啻螌嶒炛蠸ym5小波函數(shù)處理信號后信號的信噪比均高于其他兩種方法。

圖8 不同去噪方式的結(jié)果對比

表3 不同去噪方法對信號處理后的信噪比

表4 三種去噪方法的信噪比

4 結(jié)論

IOSs 探測技術(shù)適合于臨床醫(yī)學(xué)研究，能夠成為視網(wǎng)膜疾病診斷和治療結(jié)果評估的有力工具。然而這種技術(shù)一直受到低信噪比的影響，在臨床使用上仍然具有一定的挑戰(zhàn)性。本文對比多組數(shù)據(jù)疊加取平均、平滑去噪以及小波去噪的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sym5 小波函數(shù)對信號進行處理后，減少了數(shù)據(jù)采集的組數(shù)，縮短了數(shù)據(jù)采集以及信號處理的時間，并且信噪比得到了提高。本文研究結(jié)果對于視網(wǎng)膜IOSs 的研究具有一定的意義，為進一步研究SD 大鼠視網(wǎng)膜IOSs奠定了基礎(chǔ)。