張成云，何興興，龐廣昌，張德權，張春暉，關文強,*

（1.天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134；2.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

鮮肉富含人體所需要的各種營養(yǎng)物質，特別是動物性蛋白質，在人們的飲食生活中，肉類食品具有重要地位[1-3]。動物屠宰后會經(jīng)歷僵直、成熟等一系列復雜的生理生化反應，完成從肌肉到食用肉的轉變。機體的生命結束后，其組織細胞在一段時間內(nèi)仍然存活，細胞中酶系統(tǒng)仍具有活性，可以對相應底物進行作用，繼續(xù)其生理代謝活動。但由于血液循環(huán)中斷，供氧停止，組織細胞的呼吸途徑被迫改變，從有氧呼吸變?yōu)闊o氧呼吸，這時體內(nèi)的糖酵解途徑（Embden-Meyerhof pathway，EMP）變成了主要供能方式。而EMP產(chǎn)生的乳酸又不能被轉運到肝臟重新利用，導致大量乳酸積累在肌肉中，最終被運送到肌肉纖維外，使宰后胴體的pH值由弱堿性慢慢降到酸性極限值[4-6]。pH值的下降導致宰后肌肉出現(xiàn)僵直狀態(tài)，使得肉的韌性增強、食用度降低，口感香氣也受到影響，使肉的品質下降[7]，pH值的變化速率與極限pH值是影響肉品品質的關鍵因素，乳酸的積累是導致pH值下降的主要原因。乳酸是EMP的終產(chǎn)物，該途徑在生物體內(nèi)廣泛存在，被認為是對生物體具有重要意義的中心代謝途徑。因此，乳酸在貯藏保鮮中具有重要作用[8]，而乳酸代謝通量在代謝網(wǎng)絡途徑中不僅可以反映呼吸代謝的受限情況，還能反映合成代謝的增強情況，進而能反映出鮮肉品質在貯藏過程中的變化，因此對于宰后鮮肉乳酸代謝通量的研究是有意義且有必要的。

研究發(fā)現(xiàn)，溫度是多數(shù)生物體代謝活動的重要環(huán)境因子，溫度對肌肉的成熟進程和肉品質有重要影響，宰后成熟溫度越低，肉品最終感官品質和衛(wèi)生指標越好[9-11]。最常見的保鮮方法是將鮮肉冷藏在4 ℃左右，但近年來，國內(nèi)外對鮮肉、果蔬和水產(chǎn)品等食品冰溫保鮮的研究也逐漸增多[12-14]，在合適的冰溫區(qū)域能夠將機體的生理活性降到最低程度，又不損害內(nèi)部結構，還能維持其正常的新陳代謝[15]。王正榮等[16]報道，雞胸肉在冰溫貯藏下可以將成熟進程延緩大約2～6 h；許立興等[17]研究發(fā)現(xiàn)，鴨胸肉在冰溫下貯藏比冷藏能夠更好地延緩其腐敗變質，使保鮮期延長15 d。

近幾年，采用代謝通量分析的方法來研究乳酸在水果貯藏保鮮中的作用已有很多報道，王會松等[18]研究發(fā)現(xiàn)適當?shù)馁A藏溫度會增加乳酸代謝通量，有利于降低甜瓜的呼吸代謝，增強合成代謝，達到延長果蔬保鮮的效果；與此同時，蔡修臻[19]也發(fā)現(xiàn)溫度會影響乳酸代謝通量的升高或降低，并得出5 ℃是哈密瓜貯藏的最佳溫度，在此溫度下，分解代謝最低，合成代謝最高。但目前關于宰后肌肉的乳酸代謝通量變化的研究鮮有報道。而在代謝工程中一種重要的量化分析方法就是代謝通量分析（metabolic flux analysis，MFA），目的是定量分析生物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)狀態(tài)下代謝途徑中的通量，獲得生物化學系統(tǒng)的代謝通量、反應速率等量化信息，評估系統(tǒng)代謝能力和極限[20]。因此，本實驗通過對貯藏不同溫度和不同時間豬里脊肉乳酸代謝通量的變化情況進行研究，旨在尋找宰后鮮肉在貯藏過程中代謝通量的變化規(guī)律，為進一步通過代謝分析從生理生化方面提高鮮肉品質質量，延長鮮肉貯藏期。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大白豬小里脊條購自天津肉聯(lián)廠；聚乙烯自封袋購自河源市華豐塑膠有限公司。

4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）、1,3-二磷酸甘油酸（1,3-diphosphoglycerate，1,3-BPG）、二羥基苯乙酮（dihydroxyacetophenone，DHAP） 美國Sigma公司；KCl、MgSO4生工生物工程（上海）股份有限公司；NaCl 天津市化學試劑供銷公司。

1.2 儀器與設備

SBA-40C生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所；FA25勻漿機 上海FLUKO公司；ME204電子天平梅特勒-托利多（儀器）上海有限公司；GQB-700KB溫度梯度箱 天津捷盛東輝保鮮科技有限公司；TG16-WS臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；Fluoroskan Ascent FL熒光-化學發(fā)光檢測儀美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 材料處理

適齡生豬屠宰后立即取出脊椎骨內(nèi)側的完整條狀嫩肉（小里脊條）共8 條，放入已裝好碎冰的13 L便攜式保溫箱（28 cmh20 cmh25 cm），1 h內(nèi)運回實驗室，及時剔除表面脂肪、筋膜，分割成質量40 g左右的肉塊（6 cmh4 cmh2 cm）共24 塊，裝入標記好的蘋果牌5號食品級保鮮自封袋（100 mmh140 mm）中，分別放入-1 ℃和4 ℃條件下貯藏。在0.5、2、6、12、24、72、120、168 h取樣，取樣時采用液氮迅速將樣品凍結，立即凍存于-80 ℃冰箱備用[4]。

1.3.2 葡萄糖、乳酸和NADH含量的測定

準確稱取10 g肉樣，冰浴研磨，加入90 mL、質量分數(shù)0.86%的生理鹽水，進行勻漿（勻漿時間10 s/次，間隔30 s，連續(xù)3～5 次），并將勻漿好的液體全部移入離心管，用8 000 r/min的轉速在設定溫度為4 ℃條件下離心10 min，取適量離心后的上清液分別移入離心管中，每次取25 μL樣液，采用生物傳感器分析儀分別測定葡萄糖和乳酸的質量濃度，每組取3 個平行，結果取平均值。之后分別對其進行時間微分，以測定出變化速率（單位：mg/（mLgh）），用于通量的計算。

NADH含量采用Fluoroskan Ascent FL熒光-化學發(fā)光檢測儀，根據(jù)酶偶聯(lián)法的原理進行測定，參考Schaefer等[21]的研究，其反應體系為0.25 mmol/L HEPES/EDTA緩沖液、100 mmol/L KCl、10 mmol/L MgSO4、0.4 U/mL GAPDH、0.5 mmol/L DHAP、3 mmol/L 1,3-BPG。

1.3.3 乳酸代謝網(wǎng)絡圖的構建

基于豬肉宰后僵直變化規(guī)律及乳酸代謝途徑，并依據(jù)EMP、三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)和磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）3 個重要中心代謝途徑，構建如圖1所示的豬肉宰后乳酸代謝通量的網(wǎng)絡圖（本實驗不考慮涉及范圍以外的代謝途徑，把沒有分叉的直線反應統(tǒng)一合并為一個反應，減少代謝網(wǎng)絡的反應數(shù)目）。

圖 1 豬里脊肉中心代謝網(wǎng)絡圖Fig. 1 Central metabolic network of pork tenderloin

1.3.4 乳酸代謝通量的測定

通過圖1創(chuàng)建的代謝網(wǎng)絡可知，共有9 個未知的代謝速率需要測定（表1），同時可以確定在胞內(nèi)的6 個質量平衡方程，具體如表2所示。

假設中間代謝途徑產(chǎn)生的代謝物在胞內(nèi)均處于一種擬穩(wěn)定的狀態(tài)，那么這6 個途徑的代謝物沒有積累，即這6 個途徑的代謝速率均為0，此時就有6 個約束向量可以得到。這時該系統(tǒng)的自由度F＝3，也就是只需求出3 個未知量（表3），此方程有唯一解（式（1））。而3 個所求速率P1、P2和P3分別為葡萄糖、乳酸和NADH的變化速率，均可通過實驗測得，最后通過計算方程得到乳酸的代謝通量[22-24]。

表 1 豬里脊肉的中心代謝途徑生化反應方程式Table 1 Biochemical reactions involved in central metabolic pathway of pork tenderloin

表 2 豬里脊肉的質量平衡方程式Table 2 Metabolic flux model equations of pork tenderloin

表 3 豬里脊肉代謝過程所需要測定的代謝物速率的平衡方程Table 3 Rate equations of measurable extracellular metabolites in the metabolism of pork tenderloin

式中：P1、P2和P3分別表示葡萄糖、乳酸和NADH水平的變化速率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進行整理，采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，不同處理組間采用獨立樣本T檢驗、不同時間點的同一處理組間采用F檢驗以及Duncan’s多重比較進行差異顯著性分析，顯著水平為P＜0.05，采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏溫度對豬里脊肉葡萄糖含量的影響

圖 2 不同貯藏溫度對豬里脊肉葡萄糖含量的影響Fig. 2 Effect of different storage temperatures on glucose content of pork tenderloin

動物宰后糖原是肌肉中的重要能量貯備物質。在活體狀態(tài)下，肌糖原（葡萄糖）分解后通過有氧呼吸形成大量的能量物質，供肌肉運動之用。但在宰后，葡萄糖則通過無氧呼吸進入EMP生成乳酸來維持機體的穩(wěn)定[25-26]。由圖2可知，宰后豬里脊肉在-1 ℃和4 ℃貯藏條件下，葡萄糖含量均先逐漸降低最終趨于穩(wěn)定，于168 h后分別達到0.40 mg/g和0.35 mg/g，從圖2可以看出，-1 ℃貯藏下的葡萄糖含量明顯高于4 ℃（P＜0.05），且葡萄糖在整個貯藏過程中的下降速率低于4 ℃，結果表明宰后貯藏溫度越低，葡萄糖分解速率越慢，越有利于豬肉的保鮮，與李培迪等[4]的研究結果一致。

2.2 不同貯藏溫度對乳酸含量的影響

圖 3 不同貯藏溫度對豬里脊肉乳酸含量的影響Fig. 3 Effect of different storage temperatures on lactic acid content of pork tenderloin

EMP在生物體內(nèi)廣泛存在，被認為是對生物體具有重要意義的中心代謝途徑，乳酸是動物宰后EMP的最終產(chǎn)物,其含量是評價無氧EMP程度與肉品質的重要指標[27-29]。由圖3可知，宰后豬里脊肉在-1 ℃和4 ℃貯藏條件的乳酸含量均先逐漸增加后緩慢下降，在0.5～12 h貯藏期間4 ℃貯藏下豬里脊肉的乳酸含量高于-1 ℃（P＜0.05），是因為在無氧條件下，葡萄糖通過EMP生成大量乳酸，且溫度越高代謝速率越快，乳酸生成速率越快。在24～120 h貯藏期間豬肉乳酸含量上升，是因為后期EMP終止，氨基酸蛋白質分解導致pH值上升，且微生物也開始入侵，因此乳酸含量有所下降；且-1 ℃貯藏組豬肉乳酸含量高于4 ℃貯藏組，是因為后期-1 ℃低溫延緩了乳酸的下降速率。因此，-1 ℃貯藏的保鮮效果要好于4 ℃。由圖2、3可知，乳酸含量與葡萄糖含量的結果大致呈相反趨勢，說明貯藏過程中葡萄糖被消耗，乳酸積累。且溫度越低乳酸含量變化速率越慢[30]。

2.3 不同貯藏溫度對NADH含量的影響

圖 4 不同貯藏溫度對豬里脊肉NADH含量的影響Fig. 4 Effect of different storage temperatures on NADH content of pork tenderloin

NADH不僅是EMP和細胞呼吸作用中的主要電子供體，還是EMP中的重要代謝產(chǎn)物。在有氧條件下乳酸在乳酸脫氫酶的作用下結合NAD+生成丙酮酸和NADH，丙酮酸進入TCA循環(huán)。而無氧條件下丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下發(fā)生脫羧和還原反應，其中還原劑是NADH，最終生成乳酸和氧化態(tài)的NAD+，提供了EMP所需要的NAD+，NADH和NAD+在EMP途徑中相互轉化，在維持機體代謝網(wǎng)絡平衡中起到了重要作用。由圖4可以看出，NADH含量在0.5～12 h貯藏過程中呈下降趨勢，與此段時間乳酸含量趨勢相反，因為4 ℃貯藏下乳酸含量下降要快于-1 ℃，所以消耗的NADH多，因此在貯藏的0.5～12 h，-1 ℃貯藏下的NADH含量高于4 ℃。說明機體中NADH與乳酸之間存在一定相互關系，并且溫度的變化會影響宰后機體的代謝物的變化。

2.4 不同溫度、不同時間貯藏下宰后豬里脊肉的乳酸代謝通量

通過測定不同溫度、不同時間貯藏下宰后豬里脊肉組織中葡萄糖、乳酸和NADH含量的變化速率，并通過平衡方程（表3）求出代謝圖中其他未知變化速率，運用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)整理并進行歸一化處理（統(tǒng)一為100），然后對數(shù)據(jù)進行通量分析，得到4 ℃和-1 ℃貯藏條件下的乳酸代謝通量圖，代謝網(wǎng)絡屬于有向加權網(wǎng)，整個代謝網(wǎng)絡以代謝底物、代謝產(chǎn)物或者中間代謝物為網(wǎng)絡節(jié)點，以實際的反應為邊線，反應方向為箭頭的方向，通過代謝網(wǎng)絡圖可以清楚地看到每一條代謝途徑的流向和趨勢，結果如圖5所示。

圖 5 不同溫度對豬里脊肉作用所產(chǎn)生的乳酸代謝通量圖Fig. 5 Lactic metabolic flux map of lactic acid in pork tenderloin stored at different temperatures

從圖5中可以看出，根據(jù)構建的代謝網(wǎng)絡圖以及相應的速率計算，可以得到宰后豬里脊肉在不同溫度、不同時間貯藏下的乳酸代謝網(wǎng)絡通量變化情況。在不同溫度相同貯藏時間下的乳酸代謝通量明顯不同，并且在同一溫度下不同貯藏時間的乳酸代謝通量也明顯不同。溫度的變化使豬酮體中EMP的速率發(fā)生了變化。從圖5可以看出，葡萄糖大多數(shù)進入了EMP途徑，說明EMP途徑在碳源的代謝上具有重要的作用。從丙酮酸節(jié)點來看，大部分丙酮酸生成乳酸，很少部分生成AcCoA進入TCA循環(huán)。-1 ℃貯藏時進入PPP的通量要高于4 ℃，說明4 ℃條件下機體的分解代謝速率比-1 ℃貯藏條件下要快，-1 ℃條件下合成代謝增強。這與Marsh等[31]報道的提高肌肉溫度可以加快代謝速率結論一致。這表明溫度對代謝通量具有明顯的調(diào)節(jié)作用，溫度越低分解代謝速率越低，這對于實際的理論研究具有一定的指導意義。

為了進一步分析不同溫度不同貯藏時間下，宰后豬里脊肉乳酸代謝通量的變化趨勢及乳酸代謝通量的分布規(guī)律，建立如圖6所示的柱狀圖。

圖 6 不同貯藏溫度對豬里脊肉乳酸代謝通量的影響Fig. 6 Effect of different storage temperatures on lactic acid metabolic flux in pork tenderloin

由圖6可知，隨著貯藏時間的延長，在4 ℃和-1 ℃貯藏下的乳酸代謝通量均顯示先上升后緩慢下降的趨勢，且宰后豬里脊肉的乳酸代謝通量在4 ℃貯藏12 h時已經(jīng)達到最大值，而在-1 ℃貯藏下的乳酸代謝通量24 h才達到最大值，比4 ℃貯藏延遲12 h 。4 ℃貯藏0.5～12 h的豬里脊肉乳酸代謝通量之間差異顯著，這一結果與朱學伸[3]的報道結果類似。-1 ℃貯藏下豬里脊肉的乳酸代謝通量在0.5～12 h之間出現(xiàn)顯著上升的趨勢（P＜0.05），24 h后開始降低，72～168 h之間差異不顯著（P＞0.05）。在貯藏0.5～12 h時4 ℃和-1 ℃的乳酸代謝通量具有顯著差異（P＜0.05）。結果表明：-1 ℃貯藏比4 ℃能夠更有效地減緩EMP的速率，同時對乳酸含量的降低也有一定的延緩作用。溫度可以影響EMP的速率，低溫可以抑制或者減緩乳酸的積累，這與王會松等[32]研究發(fā)現(xiàn)某些原因（如常規(guī)的低溫貯藏或適當溫度的熱處理等）可以使甜瓜呼吸代謝受到限制從而產(chǎn)生較多的乳酸，此時機體的分解代謝降低，更有利于延長果蔬的貨架期有相似之處。

3 結 論

本實驗通過對宰后豬里脊肉在不同溫度和不同貯藏時間下的乳酸代謝通量進行分析，發(fā)現(xiàn)宰后豬里脊肉在冰溫-1 ℃貯藏下葡萄糖、乳酸、NADH的含量均與4 ℃貯藏條件下的明顯差異，且-1 ℃貯藏下的保鮮效果好于4 ℃，從代謝網(wǎng)絡圖中發(fā)現(xiàn)，在不同溫度相同貯藏時間下的乳酸代謝通量明顯不同，并且在同一溫度下不同貯藏時間的乳酸代謝通量也顯著不同，且在貯藏0.5～12 h期間，-1 ℃貯藏的豬里脊肉乳酸代謝通量比4 ℃貯藏時低，而在貯藏12～168 h期間，-1 ℃的乳酸代謝通量高于4 ℃，表明低溫有利于降低葡萄糖的分解代謝，延緩了葡萄糖在EMP途徑中轉化為乳酸的速率，從而延緩了乳酸的積累。通過對乳酸代謝通量的分析，期望從基本的代謝水平來揭示宰后鮮肉受到外部環(huán)境影響后機體的變化，以便為尋找適合鮮肉貯藏的最佳溫度條件提供更為科學的理論和依據(jù)。