陳 婷，趙九陽，劉玉梅*

（新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，煤炭清潔轉(zhuǎn)化與化工過程自治區(qū)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830046）

環(huán)境惡化是人類生存面臨最嚴峻的挑戰(zhàn)，塑料包裝生物降解性差，在環(huán)境中會產(chǎn)生大量塑料廢物。與其相比，利用可再生資源制備的生物聚合物，具有天然無毒、可再生和可生物降解性等優(yōu)點[1-2]。可食用薄膜是利用天然來源的無毒原料制備的一類包裝材料，這類材料通常不含有生物有害成分，且容易降解；它不僅有助于解決環(huán)境問題，還可通過添加天然抗菌成分，在防止水分流失的同時，起到阻止和延緩氧化酸敗和微生物腐敗的效果，在延長食品保質(zhì)期方面發(fā)揮重要作用[3]。因此，對于生物聚合物可食用薄膜的需求日益增長[4]。

目前，基于不同生物聚合物原料所制成的薄膜主要分為蛋白質(zhì)膜、多糖膜、脂質(zhì)膜及其復(fù)合膜[5]。明膠是膠原蛋白部分水解的產(chǎn)物，具有無毒性、生物降解性、生物相容性和低成本的獨特優(yōu)點[6-7]，但其阻水性能和力學(xué)性能較差，幾乎沒有任何抗菌活性，這是明膠基薄膜用于食品包裝的主要缺點[8]。為了克服這些限制，將明膠與其他生物材料復(fù)合，并添加適宜的抗菌劑，可以明顯改善薄膜的功能。殼聚糖是甲殼素脫N-乙酰基的產(chǎn)物，具有生物降解性、生物相容性、抗菌和抗氧化活性，無毒性、成膜能力佳[9-10]，且與明膠具有良好的生物混溶性。已有研究報道將其與明膠混合制備的復(fù)合膜可明顯改善單一薄膜的功能缺陷[11-13]。啤酒花是啤酒釀造的重要原料，其主要作用之一是為啤酒提供防腐抗菌功能。啤酒花浸膏是采用超臨界CO2萃取得到的啤酒花提取物，主要由α-酸和β-酸組成。許多研究表明啤酒花α-酸、β-酸和啤酒花浸膏具有很強的抗菌活性，且其主要成分α-酸、β-酸的抗菌活性存在一定的差異[14-17]。

前期研究表明，以啤酒花浸膏、α-酸或β-酸為抗菌劑制備的明膠-殼聚糖可食性薄膜用于包裝草莓等水果可明顯延長保鮮期，而抗菌薄膜中抗菌劑的釋放則與薄膜的防腐保鮮效果有著密切關(guān)系[18]?？咕鷦┯砂b介質(zhì)擴散到食品中并最終達到平衡，從而發(fā)揮抗菌作用[19-20]。食品基質(zhì)的特性會影響抗菌劑的釋放速率和釋放量，進而影響包裝材料對食品的保鮮效果；同時環(huán)境溫度、光照、輻射、氧氣等因素也會對抗菌膜的穩(wěn)定性產(chǎn)生一定影響[21]。已有不少研究關(guān)注薄膜中活性成分的釋放行為。Benbetta?eb等[22]將阿魏酸和酪醇加入到明膠-殼聚糖薄膜中，研究其在水性食品模擬液中的釋放行為；Rezaee等[23]將沒食子酸加入到明膠-殼聚糖薄膜中，研究其在食品脂肪模擬液中的釋放速率。因此，以食品模擬體系來研究包裝材料中抑菌劑的釋放行為對預(yù)測包裝材料對不同食品體系的抗菌效果非常重要。

本研究在前期工作基礎(chǔ)上，制備了含有啤酒花浸膏、α-酸或β-酸的明膠-殼聚糖可食性抗菌包裝膜，通過比較啤酒花浸膏、α-酸和β-酸在食品模擬液中的釋放行為，并以Peleg方程進行擬合，確定抗菌劑的釋放規(guī)律，以期為其進一步的開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖（脫乙酰度＞90%） 上海藍季科技發(fā)展有限公司；明膠 天津致遠化學(xué)試劑有限公司；啤酒花浸膏（含質(zhì)量分數(shù)52.5%的α-酸、質(zhì)量分數(shù)19.3%的β-酸） 新疆三寶樂農(nóng)業(yè)科技有限公司；α-酸、β-酸（純度≥95%）為實驗室自制，從啤酒花浸膏中分離得到[24]；甘油（純度≥98.0%） 西安化學(xué)試劑廠；乙酸、無水乙醇等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-Ⅱ型集熱式磁力加熱攪拌器 金壇市醫(yī)療儀器廠；FAH04N型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；DPH-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京市永光明儀器儀器廠；KQ5200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV-5300PC型紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；Vertex 70傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）儀 德國Bruker公司；1430VP掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 德國里奧電鏡有限公司。

1.3 方法

1.3.1 明膠-殼聚糖可食性抗菌膜的制備

稱取2 g明膠溶解于50 mL水中，于60 ℃下攪拌30 min至完全溶解，再攪拌加入0.4 g甘油，30 ℃繼續(xù)攪拌1 h，制得質(zhì)量濃度4 g/100 mL的明膠膜液。將1 g殼聚糖溶解于50 mL體積分數(shù)2%的乙酸溶液中，70 ℃下攪拌至完全溶解，再攪拌加入1.0 g甘油，30 ℃繼續(xù)攪拌1 h，制得質(zhì)量濃度2 g/100 mL的殼聚糖膜液。將殼聚糖膜液與明膠膜液按質(zhì)量比1∶1混合，30 ℃下攪拌1 h得到明膠-殼聚糖成膜液。結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果，確定在上述成膜液中分別加入質(zhì)量濃度為0.15 g/100 mL啤酒花浸膏、0.15 g/100 mLα-酸或0.20 g/100 mLβ-酸，30 ℃下攪拌1 h后靜置24 h，超聲脫氣2 h，將成膜液用流延法鋪在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，37 ℃下干燥20 h，得到明膠-殼聚糖抗菌膜，并以不含抗菌劑的明膠-殼聚糖薄膜為對照膜[25-26]。

1.3.2 明膠-殼聚糖可食性抗菌膜的FT-IR分析

使用FT-IR儀分析薄膜紅外光譜圖。分辨率4 cm-1，掃描范圍4 000～500 cm-1。

1.3.3 明膠-殼聚糖可食性抗菌膜的微觀結(jié)構(gòu)觀察

將薄膜粘貼于金屬圓臺上，真空狀態(tài)下噴金，采用SEM觀察薄膜表面微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.4 抗菌劑標準曲線繪制

分別準確稱取10 mg啤酒花浸膏、α-酸或β-酸，用無水乙醇溶解并定容至100 mL，得抗菌劑標準溶液。分別移取抗菌劑標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，由于啤酒花浸膏中同時含有α-酸和β-酸，且α-酸含量明顯高于β-酸，為方便計算，啤酒花浸膏和α-酸均選取α-酸的最大吸收波長329 nm處測定吸光度，β-酸則在其最大吸收波長352 nm處測定吸光度。以吸光度（y）對抗菌劑溶液質(zhì)量濃度（x，μg/mL）進行擬合，得到在0～10 μg/mL線性范圍內(nèi)：啤酒花浸膏線性方程為y＝0.036 8x+0.004 6，R2＝0.999 3；α-酸線性方程為y＝0.023 0x+0.005 0，R2＝0.999 1；β-酸線性方程為y＝0.040 1x+0.004 9，R2＝0.999 0。

1.3.5 釋放實驗

根據(jù)GB/T 31604.1ü2015《食品安全國家標準 食品接觸材料及制品遷移試驗通則》中規(guī)定，選用體積分數(shù)10%的乙醇溶液為水性食品模擬液，體積分數(shù)50%的乙醇溶液為含乙醇類食品模擬液，體積分數(shù)95%的乙醇溶液為高脂肪類食品模擬液[27]完成釋放實驗。

裁取1 cmh2 cm（約10 mg）的抗菌膜片樣品置于100 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL食品模擬液中，分別置于4、25、30 ℃恒溫環(huán)境下，間隔一定時間，準確移取1 mL釋放液分別于其最大吸收波長處測定吸光度，以相應(yīng)模擬液為參比，依據(jù)1.3.4節(jié)中所得線性方程計算食品模擬液中各抗菌劑的質(zhì)量濃度。按式（1）計算抗菌劑釋放量。

式中：ρ為t時刻食品模擬液中抗菌劑質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為食品模擬液體積/mL；m為膜片質(zhì)量/g。

1.3.6 釋放模型的建立

Peleg模型（式（2））主要用于根據(jù)實驗數(shù)據(jù)預(yù)測釋放動力學(xué)。

式中：MF,t為t時刻時抗菌劑釋放量/（mg/g）；t為釋放時間/min；k1是模型的動力學(xué)常數(shù)，與釋放過程開始時的質(zhì)量轉(zhuǎn)移率成反比關(guān)系；k2為1/MF,e（MF,e為釋放平衡時的抗菌劑釋放量），是與漸近值有關(guān)的模型常數(shù)[28-29]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

以O(shè)rigin 8.6軟件進行釋放實驗的數(shù)據(jù)處理并作圖。所有實驗平行測定3 次，結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 明膠-殼聚糖可食性抗菌膜的FT-IR分析結(jié)果

圖 1 明膠-殼聚糖可食性抗菌膜的FT-IR圖Fig. 1 Fourier transform infrared spectroscopy spectra of gelatinchitosan composite edible film

如圖1所示，明膠-殼聚糖對照薄膜的FT-IR光譜中，3 297 cm-1處的特征峰歸屬于游離水的O-H和酰胺A的N-H伸縮振動；2 941 cm-1處的特征峰為酰胺B的C-H不對稱伸縮振動；1 650 cm-1處的特征峰為C＝O伸展以及酰胺I的N-H基團彎曲振動；1 557 cm-1處的特征峰為酰胺II，是由N-H基團的彎曲振動和C-N基團的伸縮振動引起的；1 259 cm-1處的特征峰為酰胺III，是由C-N和N-H基團的平面振動和明膠中甘氨酸的-CH2基團振動引起的[30-31]。在1 039 cm-1處的特征峰是增塑劑（甘油的羥基基團）和聚合物結(jié)構(gòu)（多糖）之間所形成氫鍵的相互作用[32]。而當(dāng)明膠-殼聚糖膜中加入抗菌劑后，其酰胺A吸收帶均有所增強且增寬，表明抗菌劑中也有N-H伸縮振動。添加抗菌劑后，酰胺I、II、III帶均向低波數(shù)方向移動，表明3 種抗菌劑均和明膠-殼聚糖膜發(fā)生分子間相互作用。以上結(jié)果表明，抗菌劑成功地加入到明膠-殼聚糖可食性薄膜中。

2.2 明膠-殼聚糖可食性抗菌膜的微觀結(jié)構(gòu)

圖 2 明膠-殼聚糖可食性抗菌膜表面的SEM圖（10 000×）Fig. 2 Scanning electron microscope graphs of gelatin-chitosan edible films (10 000 ×)

可食性薄膜的微觀結(jié)構(gòu)反映了其均一性和致密性。由圖2A可知，明膠-殼聚糖對照膜的表面盡管有一些細小的顆粒，但仍然可以觀察到連續(xù)光滑的平面，這表明明膠與殼聚糖之間具有良好的相容性。由圖2B～D可知，在明膠-殼聚糖可食性薄膜中加入3 種不同抗菌劑后，其對薄膜表面結(jié)構(gòu)的影響不盡相同。其中，添加啤酒花浸膏的明膠-殼聚糖薄膜表面明顯粗糙且出現(xiàn)一些紋路，這可能與啤酒花浸膏的疏水性有關(guān)，但相對而言，薄膜表面結(jié)構(gòu)仍然較均一；而添加了α-酸的薄膜表面可觀察到細小顆粒明顯增多，這可能是由于α-酸并不能與明膠-殼聚糖形成均相體系，而是分散在膜中，這在添加疏水性更強的β-酸的明膠-殼聚糖薄膜中表現(xiàn)更為明顯，該薄膜表面β-酸的棒狀晶體清晰可見，說明疏水性強的添加劑不易于薄膜基材形成網(wǎng)絡(luò)緊密的結(jié)構(gòu)。Ramziia等[33]將原花青素添加到明膠-殼聚糖薄膜中也出現(xiàn)類似的結(jié)果。

2.3 抗菌劑在食品模擬液中的釋放行為

抗菌劑從薄膜中釋放的主要影響因素包括薄膜基材溶脹性、抗菌劑因極性和溶解度等，這些因素的差異導(dǎo)致抗菌劑在食品模擬液中的擴散不同。

圖 3 啤酒花浸膏在不同食品模擬液中的釋放曲線Fig. 3 Release curves of hop extract in different food simulants

如圖3所示，啤酒花浸膏在不同食品模擬液中的釋放速率均較快，釋放初期呈快速上升趨勢，釋放達到平衡后趨于平緩。釋放時間相同時，環(huán)境溫度越高，釋放量越大。

在相同食品模擬液中，隨著釋放環(huán)境溫度的升高，釋放量總體呈逐漸增大的趨勢，在高脂肪類食品模擬體系（體積分數(shù)95%的乙醇溶液）中更為明顯。另外，釋放環(huán)境溫度越高，啤酒花浸膏達到釋放平衡的時間越快。這是因為釋放環(huán)境溫度升高，分子熱運動加劇，自由體積變大[34]，使啤酒花浸膏在食品模擬液中的溶解度增大。這一結(jié)果與六氫β-酸在不同釋放環(huán)境溫度下和不同食品模擬液中的釋放行為類似[35]。因此，在環(huán)境溫度低于25 ℃時，溫度是影響活性物質(zhì)擴散的主要因素；但在接近室溫（25 ℃或30 ℃）條件時，溫度的影響程度差異不明顯。

在相同釋放溫度下，啤酒花浸膏在體積分數(shù)95%乙醇溶液中的釋放量最大，釋放速率也最快，其次是體積分數(shù)50%的乙醇溶液，啤酒花浸膏在體積分數(shù)10%的乙醇溶液中釋放量最小，釋放速率最慢。這主要是由于啤酒花浸膏是疏水性的，食品模擬液中的水分體積分數(shù)越高其溶解度越低。因此，食品的水分含量也是影響活性物質(zhì)釋放的重要因素。

圖 4 α-酸在不同食品模擬液中的釋放曲線Fig. 4 Release curves of α-acid in different food simulants

圖 5 β-酸在不同食品模擬液中的釋放曲線Fig. 5 Release curves of β-acid in different food simulants

α-酸和β-酸在食品模擬液中的釋放行為如圖4、5所示。相較啤酒花浸膏，α-酸在體積分數(shù)10%乙醇溶液模擬液中的釋放行為與其類似，在低溫（4 ℃）時釋放量較小，隨著環(huán)境溫度的升高，釋放量及速率增大；β-酸在體積分數(shù)10%乙醇溶液模擬液中的釋放量也較小，并很快達到釋放平衡，其釋放量隨環(huán)境溫度的升高并未發(fā)生明顯變化。這是由于體積分數(shù)10%的乙醇溶液體系極性較大，β-酸疏水性極強，在水分含量高的體系中溫度的變化對其溶解度影響很小。在體積分數(shù)50%和95%的乙醇溶液模擬液中，β-酸的釋放行為和α-酸極為相似，二者的釋放速率和達到釋放平衡的時間均較為接近。β-酸達到平衡時的釋放量是3 種抗菌劑中最大的，這與其添加量略高于其余2 種抗菌劑有關(guān)。此外，啤酒花浸膏的主要成分為α-酸和β-酸，本實驗中啤酒花浸膏中α-酸質(zhì)量分數(shù)為52.5%，且啤酒花浸膏和α-酸測定時選擇的波長一致，因此，實際測得的啤酒花浸膏釋放量會小很多。另外，SEM觀察結(jié)果也表明，啤酒花浸膏與薄膜基材形成了相對均一緊密的結(jié)構(gòu)，這也會使其釋放量較?。欢?酸和β-酸因其疏水性，在膜中分散不均勻，使薄膜結(jié)構(gòu)疏松，因此在食品模擬液中更易釋放，β-酸這一現(xiàn)象尤為突出。但前期研究結(jié)果表明，盡管啤酒花浸膏的釋放量較低，但其總體抗菌活性并不低，說明啤酒花浸膏中的α-酸和β-酸之間存在一定的協(xié)同抑菌活性[18]。

2.4 釋放行為模型的建立

Peleg模型可以預(yù)測當(dāng)時間趨于無窮大時的平衡值，因此，該模型可以預(yù)測在持續(xù)時間相對較短的測試中獲得的長期值[36]。本實驗通過Peleg模型對數(shù)據(jù)進行處理，以t/MF,t對釋放時間（t）進行擬合，所得曲線如圖6～8所示，方程及相關(guān)參數(shù)見表1。

圖 6 啤酒花浸膏在不同食品模擬液中釋放機制的Peleg模型Fig. 6 Peleg model for release mechanism of hop extract in different food stimulants

圖 7 α-酸在不同食品模擬液中釋放機制的Peleg模型Fig. 7 Peleg model for release mechanism of α-acid in different food stimulants

圖 8 β-酸在不同食品模擬液中釋放機制的Peleg模型Fig. 8 Peleg model for release mechanism of β-acid in different food simulants

表 1 不同溫度下抗菌劑在不同食品模擬液中的Peleg模型相關(guān)參數(shù)Table 1 Parameters of Peleg model for release of antimicrobial agents in different food simulants at different temperatures

Peleg模型參數(shù)中，k1與抗菌劑釋放過程中初始速率的倒數(shù)相關(guān)，而k2是釋放平衡時抗菌劑釋放量的倒數(shù)（1/MF,e），其反映了抗菌劑在平衡態(tài)下的釋放總量。當(dāng)t＜t臨界值時，使用Peleg模型計算的最大釋放量與實驗數(shù)據(jù)無明顯差異。由表1可知，各方程相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.98，說明啤酒花浸膏、α-酸或β-酸在4、25、30 ℃環(huán)境溫度下在3 種食品模擬液中的釋放行為均與Peleg模型擬合較好。這一結(jié)果與多酚在海藻酸鈉-殼聚糖可食性薄膜中的釋放行為類似[37]。

由表1可知，食品模擬液水分體積分數(shù)影響抗菌劑的釋放，食品模擬液水分體積分數(shù)越大，k1值越大，釋放初始速率越慢。在不同食品模擬液中，Peleg模型k1值的總體趨勢為體積分數(shù)10%乙醇溶液＞體積分數(shù)50%乙醇溶液＞體積分數(shù)95%乙醇溶液，這與抗菌劑在乙醇溶液中的溶解度有關(guān)。Han Yingying等[38]的研究表明，食品模擬液中水分體積分數(shù)的變化對抗菌劑的釋放具有較大影響。釋放環(huán)境溫度也影響抗菌劑的釋放，在不同釋放環(huán)境溫度中，Peleg模型k1值的總體趨勢為4 ℃＞25 ℃＞30 ℃，表明釋放環(huán)境溫度越高，釋放速率越快，這是由于溫度越高，分子熱運動越劇烈，抗菌劑越易溶解。同時，食品模擬液水分體積分數(shù)和釋放環(huán)境溫度也影響著達到平衡時的釋放量，食品模擬液中的水分體積分數(shù)越高，釋放環(huán)境溫度越低，達到平衡時的釋放量越小。當(dāng)釋放條件相同時，3 種抗菌劑Peleg模型k1值的總體趨勢為啤酒花浸膏＞α-酸＞β-酸，表明啤酒花浸膏在食品模擬液中的釋放相對較慢。

3 結(jié) 論

本研究以啤酒花浸膏、α-酸或β-酸為抗菌劑，制備明膠-殼聚糖可食性抗菌薄膜，研究抗菌劑在不同環(huán)境溫度下不同食品模擬液中的釋放行為，驗證了明膠-殼聚糖可食性抗菌薄膜中啤酒花浸膏、α-酸或β-酸在食品模擬液中釋放機制Peleg模型的有效性。在不同食品模擬液中，食品模擬液水分體積分數(shù)越大，抗菌劑釋放越慢，且釋放平衡時釋放量越??；在不同釋放環(huán)境溫度下，溫度越高，抗菌劑釋放越快，且釋放平衡時釋放量越大。通過擬合Peleg模型發(fā)現(xiàn)，抗菌劑在4、25、30 ℃環(huán)境溫度下食品模擬液中的釋放行為均很好地符合Peleg模型。結(jié)果表明，該類可食性抗菌薄膜中的抑菌劑啤酒花浸膏、α-酸或β-酸在含酒精類食品和高脂食品中均能很好地釋放，滿足抑菌要求，而在水性食品體系中，僅添加β-酸可能不能滿足抑菌要求，這為該抗菌薄膜的開發(fā)應(yīng)用提供了理論參考。