謝定剛， 叢麗娜， 李若凡， 趙 金， 何媛媛

大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一，其突出的特征是能夠產(chǎn)生耐熱、抗逆的芽孢，在自然界分布非常廣泛。它可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，其中抗菌脂肽是通過(guò)非核糖體合成途徑產(chǎn)生的具有抗菌作用的脂肽類(lèi)化合物[1-3]。由于其具有廣譜、高效、安全無(wú)毒、不易產(chǎn)生耐藥性，并可以被生物降解、不會(huì)導(dǎo)致殘留引起環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，目前抗菌脂肽在食品和化妝品行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、農(nóng)業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用得到了廣泛的重視[4-6]。

黃曲霉是日常生活中常見(jiàn)的病原真菌，易在谷類(lèi)、豆類(lèi)等糧食和堅(jiān)果上生長(zhǎng)，是糧油食品中最常見(jiàn)的霉菌之一。由于黃曲霉對(duì)生活環(huán)境要求不高，只需要有一點(diǎn)碳與氮就能生長(zhǎng)繁殖，并產(chǎn)生致癌性很強(qiáng)的黃曲霉毒素，其對(duì)人體健康及畜牧業(yè)造成很大的威脅[7]。目前，在防治黃曲霉引起的糧食作物霉變主要以化學(xué)防腐劑為主[8]，但化學(xué)防腐劑引起的人體健康問(wèn)題日漸突出，研究和開(kāi)發(fā)新的天然防腐劑已成為當(dāng)今急切的需求，而枯草芽孢桿菌所產(chǎn)抗菌脂肽中的桿菌霉素D組分是目前唯一從微生物中得到并且已經(jīng)鑒定的具有抗黃曲霉毒性的活性物質(zhì)[9-11]。因抗菌脂肽其對(duì)人體健康沒(méi)有造成影響，因此，桿菌霉素D是目前替代化學(xué)防腐劑的熱點(diǎn)研究物質(zhì)[12]。

本研究所用的枯草芽孢桿菌是從大連海域海參腸道中分離獲得，其發(fā)酵產(chǎn)物中的抗菌脂肽對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物致病菌如副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌及日常生活常見(jiàn)的黃曲霉具有顯著的抑制作用[13-15]。但從自然中分離出的野生菌株其抗菌脂肽產(chǎn)量較低，而對(duì)枯草芽孢桿菌采用原生質(zhì)體紫外誘變育種的研究尚未見(jiàn)報(bào)道[16]。以原生質(zhì)體作為紫外誘變育種材料，在沒(méi)有細(xì)胞壁的保護(hù)下，細(xì)胞對(duì)紫外線(xiàn)更為敏感，而且原生質(zhì)體再生過(guò)程中有一個(gè)優(yōu)存劣亡的自然篩選作用，代謝旺盛的原生質(zhì)體得以再生，從而提高了正突變率[17,18]。所以本研究采用原生質(zhì)體紫外誘變育種的手段篩選出高產(chǎn)抗菌脂肽的誘變菌株。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1出發(fā)菌株和指示菌

出發(fā)菌株：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)mutHS-301，由本實(shí)驗(yàn)室自主分離保藏的菌株(GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索號(hào)：GQ466597)。

指示菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、副溶血性弧菌(Vibroparachaemolyticus)和黃曲霉菌(Aspergillus flavus)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉 5.0，胰蛋白胨 10.0，NaCl 10.0，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基添加17～18 g/L瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 10.0，牛肉膏15.0，磷酸氫二鉀 5.0，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

再生培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母浸粉 5.0，牛肉膏 5.0，NaCl 5.0，六水氯化鎂 4.07，順丁烯二酸2.32，甘露醇 91.1，瓊脂粉17～18，pH 6.7，115 ℃滅菌30 min。

PDA培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯 200，葡萄糖 20，瓊脂粉 17～18，自然pH，115 ℃滅菌30 min。

1.1.3試劑

高滲溶液A：用0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)配制1 mol/L 的NaCl溶液，115 ℃滅菌30 min備用。

溶菌酶溶液：用無(wú)菌高滲溶液A配制不同濃度的溶菌酶溶液，過(guò)水系0.22 μm膜，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌株mutHS-301生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

從LB菌種斜面上取一環(huán)出發(fā)菌株mutHS-301接種至裝有10 mL的LB液體培養(yǎng)基，在30 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)16 h ～18 h。按2%的接種量接種至裝有100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃，180 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)，每間隔2 h取樣測(cè)定培養(yǎng)液的OD600值。

1.2.2原生質(zhì)體的制備及條件優(yōu)化

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的細(xì)胞菌液于滅菌的離心管中，4 000 r/min離心15 min，棄上清液，用高滲溶液洗滌2次，離心并收集細(xì)胞。采用單因素實(shí)驗(yàn)法測(cè)定不同的溶菌酶濃度、酶解時(shí)間和酶解溫度條件下對(duì)原生質(zhì)體形成率和再生率的影響。選擇最適酶解條件對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行酶解破壁，酶解后離心使原生質(zhì)體沉淀，棄上清液。獲得的原生質(zhì)體用高滲溶液洗滌2次并離心，最后定容于高滲緩沖液中，通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法調(diào)整原生質(zhì)體濃度為105CFU/mL。

原生質(zhì)體形成率 =(A-B)/A×100%

原生質(zhì)體再生率 =(C-B)/(A-B)×100%

式中，A為酶解前LB培養(yǎng)基上的菌落數(shù)；B為酶解后LB培養(yǎng)基上的菌落數(shù)；C為酶解后再生培養(yǎng)基上的菌落數(shù)。

1.2.3原生質(zhì)體紫外誘變處理

取制備好的原生質(zhì)體懸浮液10 mL，置于直徑為9 mm的無(wú)菌培養(yǎng)皿(內(nèi)置磁棒)中，并在磁力攪拌下用紫外燈照射(功率15 W，照射距離30 cm)，照射時(shí)間分別為0 s、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s，光恢復(fù)10 min。取不同照射時(shí)間的原生質(zhì)體處理液，按10倍系列梯度稀釋后涂布在高滲再生培養(yǎng)基上，30 ℃條件下恒溫避光培養(yǎng)18 h～24 h。待長(zhǎng)出菌落，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)并計(jì)算原生質(zhì)體紫外誘變的致死率。

原生質(zhì)體致死率 =(D-E)/D×100%

式中，D為誘變處理前再生培養(yǎng)基上的菌落數(shù)；E為誘變處理后再生培養(yǎng)基上的菌落數(shù)。

1.2.4高產(chǎn)抗菌脂肽菌株篩選及其遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

將經(jīng)誘變后在再生培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落接種在LB固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，30 ℃培養(yǎng)12 h ～14 h。連續(xù)轉(zhuǎn)接3代培養(yǎng)后，各菌株分別接種到做好編號(hào)的試管發(fā)酵液中，于30 ℃，180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)48 h，離心收集上清液，采用牛津杯法測(cè)定發(fā)酵上清液對(duì)指示菌的抑菌圈直徑大小。選取抑菌圈較大的誘變菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，固體平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)9代，并進(jìn)行隔代搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)48 h，離心收集上清液，采用牛津杯法測(cè)定其對(duì)指示菌的抑菌圈直徑大小，并與出發(fā)菌株作比較。同時(shí)用稀鹽酸將上清液調(diào)至pH為2進(jìn)行酸沉，離心收集沉淀物，再用甲醇抽提后過(guò)膜收集濾液，將濾液于40 ℃恒溫旋蒸得到抗菌脂肽提取物。最后計(jì)算該誘變菌株抗菌脂肽產(chǎn)量的變化。

1.2.5制備型硅膠板純化抗菌脂肽單組分及分析

以氯仿∶甲醇∶水∶氨水的比例為60∶30∶3∶3作為展開(kāi)劑，利用薄層色譜法對(duì)抗菌脂肽提取物各組分進(jìn)行初步鑒定，并采用制備型硅膠板(GF254)對(duì)抗菌脂肽提取物進(jìn)行單組分分離純化。稱(chēng)取適量抗菌脂肽提取物溶于1 mL甲醇中，用毛細(xì)管充分點(diǎn)樣于制備型硅膠板上，在層析缸中經(jīng)展開(kāi)劑展開(kāi)后，分別刮取同行分離單組分斑點(diǎn)的硅膠，用甲醇對(duì)硅膠中的單組分進(jìn)行抽提，離心收集上清液，旋干后溶于1 mL甲醇。采用RP-HPLC對(duì)單組分進(jìn)行分析檢測(cè)，并測(cè)定各單組分對(duì)黃曲霉的抑制作用。

1.2.6抗菌脂肽提取物對(duì)黃曲霉菌菌絲生長(zhǎng)的影響

分別取1mL不同濃度抗菌脂肽提取物加入到19 mL已融化并冷卻至50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，充分混勻后倒入無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，制成分別含抗菌脂肽終濃度為0.20 mg/mL、0.18 mg/mL、0.16 mg/mL、0.14 mg/mL、0.12 mg/mL、0.10 mg/mL和0.08 mg/mL的系列培養(yǎng)基平板，以加入等體積無(wú)菌水的PDA平板作為對(duì)照(A)。用直徑為9 mm打孔器沿外緣鉆取在PDA培養(yǎng)基上已培養(yǎng)約48 h的黃曲霉菌落塊，分別接種于上述已經(jīng)凝固的含抗菌脂肽培養(yǎng)基平板中央，菌絲面朝下，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待A組霉菌菌絲長(zhǎng)至平板邊緣，采用十字交叉法測(cè)量含肽培養(yǎng)基上的菌落直徑，與對(duì)照組比較計(jì)算出不同濃度處理對(duì)該黃曲霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=[(對(duì)照組菌落直徑-含肽組菌落直徑)/對(duì)照組組菌落直徑]×100%

1.2.7抗菌脂肽提取物對(duì)黃曲霉孢子致死濃度的測(cè)定

分別取1mL不同濃度抗菌脂肽提取物加入到19mL已融化并冷卻至約50 ℃的PDA培養(yǎng)基中，充分混勻后倒入無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，制成分別含抗菌脂肽終濃度為1.0 mg/mL、0.8 mg/mL、0.6 mg/mL、0.4 mg/mL、0.2 mg/mL、0.1 mg/mL和0.05 mg/mL的系列培養(yǎng)基平板，以加入等體積無(wú)菌水的PDA平板作為對(duì)照(a)。取100 μL濃度為104CFU/mL黃曲霉孢子液涂布于各濃度梯度培養(yǎng)皿中，于37 ℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)至第8 d時(shí)，即對(duì)照組(a)培養(yǎng)皿霉菌長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)平板且產(chǎn)生大量孢子，以此時(shí)無(wú)霉菌生長(zhǎng)的最小濃度培養(yǎng)皿為最小致死濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株mutHS-301生長(zhǎng)曲線(xiàn)

本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法對(duì)枯草芽孢桿菌mutHS-301生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)圖1可以看出菌株的生長(zhǎng)經(jīng)歷了延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期幾個(gè)階段。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大概在培養(yǎng)時(shí)間為2 h～14 h之間，此時(shí)期的菌體繁殖迅速，DNA復(fù)制頻繁，菌株生長(zhǎng)代謝較為旺盛及細(xì)胞壁對(duì)破壁酶較為敏感，形成的原生質(zhì)體對(duì)紫外線(xiàn)等物理因子的刺激較為敏感且較為容易長(zhǎng)出細(xì)胞壁而得到再生，所以本實(shí)驗(yàn)選擇處于對(duì)數(shù)中后期10 h的菌株作為研究對(duì)象。這樣既保證誘變實(shí)驗(yàn)時(shí)健壯的菌體細(xì)胞足夠多以增加變異細(xì)胞的細(xì)胞總數(shù)，又可以減少分離性表型延遲現(xiàn)象的發(fā)生，從而使得誘變結(jié)果突變率較高且重現(xiàn)性較好。

圖1 枯草芽孢桿菌mutHS-301生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.2 原生質(zhì)體的制備和再生

(1)酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成率和再生率的影響。以溶菌酶濃度為0.5 mg/mL，酶解溫度為37 ℃，測(cè)定酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備的影響。由表1可知，在10 min ～30 min范圍內(nèi)，原生質(zhì)體形成率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，而原生質(zhì)體再生率則呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。酶解時(shí)間為15 min時(shí)，原生質(zhì)體形成率為98.23%，再生率達(dá)到31.51%。

(2)溶菌酶濃度對(duì)原生質(zhì)體形成率和再生率的影響。由表1可知，隨著酶解濃度的增加，原生質(zhì)體的形成率不斷提高，而再生率則呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。酶解濃度為0.5 mg/mL時(shí)，原生質(zhì)體形成率為97.85%，再生率達(dá)到31.83%。

(3)酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體形成率和再生率的影響。由表1可知，隨著酶解溫度的升高，原生質(zhì)體的形成率不斷提高，而再生率則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。酶解溫度為37 ℃時(shí)，原生質(zhì)體形成率為98.12%，再生率達(dá)到29.94%。

表1 原生質(zhì)體制備的條件優(yōu)化

2.3 紫外誘變致死率曲線(xiàn)

對(duì)枯草芽孢桿菌mutHS-301的原生質(zhì)體進(jìn)行不同時(shí)間紫外照射，并計(jì)算出原生質(zhì)體致死率(圖2)?？梢钥闯觯丈鋾r(shí)間為20 s時(shí)，致死率為47.3%，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率也跟著升高，當(dāng)照射時(shí)間為100 s時(shí)，致死率接近100%。高致死率往往伴隨著高突變率，能夠起到篩選出高產(chǎn)菌株的目的。近年來(lái)有傾向于致死率在80%～90%的誘變劑量的誘變效果較好，其正突變率較高[19]。故本實(shí)驗(yàn)中紫外線(xiàn)照射時(shí)間選擇為60 s，其致死率為88.6%。

2.4 高產(chǎn)抗菌脂肽突變菌株的篩選

經(jīng)紫外誘變獲得的突變菌株進(jìn)行初篩和復(fù)篩，得到6株對(duì)指示菌抑菌圈有明顯提高的菌株，分別命名為mutHS-501、mutHS-530、mutHS-539、mutHS-561、mutHS-580和mutHS-596。結(jié)果如圖3所示。

圖2 枯草芽孢桿菌mutHS-301致死率曲線(xiàn)

圖3 誘變菌株篩選結(jié)果

由圖3可以看出，6株突變菌株對(duì)指示菌抑菌直徑較出發(fā)菌株mutHS-301有明顯提高，其中mutHS-539對(duì)副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌抑菌直徑較mutHS-301分別提高了21.49%和21.05%。

2.5 高產(chǎn)抗菌脂肽菌株遺傳穩(wěn)定性研究

將復(fù)篩得到的高產(chǎn)抗菌脂肽突變菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性測(cè)定，經(jīng)傳9代后，并通過(guò)隔代發(fā)酵測(cè)定突變菌株產(chǎn)抗菌脂肽的量的變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，突變株mutHS-539產(chǎn)抗菌脂肽的量最高，其產(chǎn)量較出發(fā)菌株mutHS-301提高了40%左右，而且它的產(chǎn)量波動(dòng)較小，并在誤差范圍內(nèi)無(wú)明顯差異(圖4)。由此可以看出，菌株mutHS-539是一株遺傳性狀十分穩(wěn)定的突變菌株。

圖4 誘變菌株mutHS-539的遺傳穩(wěn)定性

2.6 抗菌脂肽單組分的分離及對(duì)黃曲霉抑菌活性檢測(cè)

通過(guò)TLC點(diǎn)板，發(fā)現(xiàn)獲得的突變株mutHS-539發(fā)酵提取物主要含有4種組分(圖5A)，分別為a、b、c和d，其RT值相應(yīng)為0.83、0.74、0.56、0.28。利用制備型硅膠板對(duì)各個(gè)組分進(jìn)行分離純化，并對(duì)黃曲霉進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。發(fā)現(xiàn)獲得的4種組分中只有組分d對(duì)黃曲霉有明顯的抑制作用(圖5B)。并經(jīng)高效液相RP-HPLC檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)組分d中有3組主峰存在，通過(guò)已測(cè)定的液質(zhì)聯(lián)用數(shù)據(jù)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)1、2和3號(hào)峰物質(zhì)相對(duì)分子量分別為1 031.54、1 045.56和1 059.57，它們是抗菌脂肽Iturin家族桿菌霉素Bacillomycin D的C14、C15和C16同系物(圖6)[15]。另外，根據(jù)峰面積歸一化法可求得組分d中的桿菌霉素D含量達(dá)到95%以上。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物抗菌脂肽中只有桿菌霉素D成分對(duì)黃曲霉有顯著的抑制作用。

圖5 抗菌脂肽單組分分離純化及對(duì)黃曲霉抑菌作用

圖6 組分d高效液相色譜圖

2.7 抗菌脂肽提取物對(duì)黃曲霉菌菌絲生長(zhǎng)的影響

抗菌脂肽提取物對(duì)黃曲霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用如圖7所示。采用十字交叉法測(cè)量含肽培養(yǎng)基上的菌落直徑，結(jié)果如表2所示。研究發(fā)現(xiàn)隨著抗菌脂肽濃度的提高，抑制作用越來(lái)越明顯。當(dāng)抗菌脂肽的濃度為0.14 mg/mL時(shí)，其對(duì)黃曲霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率超過(guò)了50%，而當(dāng)抗菌脂肽的濃度達(dá)到0.20 mg/mL時(shí)，其對(duì)黃曲霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到了74.22%，這說(shuō)明抗菌脂肽提取物對(duì)黃曲霉的菌絲生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用。

抗菌脂肽濃度/(mg·mL-1)：A.0；B.0.08；C.0.10；D.0.12；E.0.14；F.0.16；G.0.18；H.0.20

表2 抗菌脂肽對(duì)黃曲霉菌菌絲的抑制率

2.8 抗菌脂肽提取物對(duì)黃曲霉孢子致死濃度的測(cè)定

以平板法測(cè)定抗菌脂肽提取物對(duì)黃曲霉孢子的致死濃度。結(jié)果如圖8所示，培養(yǎng)至第8 d時(shí)，對(duì)照組(a)培養(yǎng)皿中有明顯的霉菌生長(zhǎng)且產(chǎn)生孢子，此時(shí)抗菌脂肽濃度為0.8 mg/mL的平板未發(fā)現(xiàn)有霉菌生長(zhǎng)，即抗菌脂肽提取物對(duì)黃曲霉孢子的致死濃度為0.8 mg/mL。

抗菌脂肽濃度/(mg·mL-1)：a.0；b.0.05；c.0.1；d.0.2；e.0.4；f.0.6；g.0.8；h.1.0

3 結(jié)論

采用紫外誘變方法對(duì)枯草芽孢桿菌mutHS-301的原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，通過(guò)篩選獲得一株性狀良好的突變菌株mutHS-539，其在抑制病原指示菌及抗菌脂肽產(chǎn)量上較出發(fā)菌株均有顯著提高。進(jìn)一步對(duì)其所產(chǎn)的抗菌脂肽提取物進(jìn)行單組分分離純化，獲得的4種組分中只有組分d對(duì)黃曲霉有顯著的抑制作用，經(jīng)數(shù)據(jù)對(duì)比和分析，發(fā)現(xiàn)該組分為桿菌霉素D。本文的研究為今后將其開(kāi)發(fā)為天然防腐劑奠定理論基礎(chǔ)。