徐海 鮑熹 董洪燕 郭長(zhǎng)明 鄧碧華 盧宇 朱善元

摘要：為研究T7噬菌體穿孔素（Holin）蛋白對(duì)宿主細(xì)菌的增殖性能的影響，根據(jù)T7噬菌體gene 17.5設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增Holin基因和序列分析，將該基因插入原核表達(dá)載體構(gòu)建重組表達(dá)菌BL-Holin。IPTG誘導(dǎo)Holin蛋白表達(dá)，SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)目標(biāo)蛋白。分光光度法測(cè)定Holin蛋白對(duì)宿主細(xì)菌增殖性能的影響，掃描電鏡觀察重組菌誘導(dǎo)后表面結(jié)構(gòu)的損傷情況。結(jié)果表明，成功擴(kuò)增Holin基因，構(gòu)建的重組菌能高效表達(dá)Holin蛋白。T7噬菌體Holin蛋白含有1個(gè)跨膜區(qū)，氨基端位于胞外、羧基端位于胞內(nèi)。Holin蛋白的表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，細(xì)菌濃度從誘導(dǎo)0 h至2 h逐漸升高，2 h后細(xì)菌濃度開始下降，直至6 h，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)菌表面塌陷、皺縮進(jìn)而死亡。研究結(jié)果顯示，Holin蛋白具有抑菌活性，這為進(jìn)一步開發(fā)噬菌體抗菌制劑提供應(yīng)用基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：穿孔素;表達(dá);宿主損傷;T7噬菌體

中圖分類號(hào)： S188 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）24-0045-04

噬菌體是分子生物學(xué)起源與發(fā)展的模式生物，在發(fā)現(xiàn)之初就被用于細(xì)菌感染性疾病的治療，隨著人類進(jìn)入抗生素時(shí)代使得噬菌體逐漸淡出人們的視野。近年來，細(xì)菌的耐藥性已然成為全球范圍內(nèi)的公共健康問題，每年有近百萬因耐藥菌感染引起的死亡病例，面對(duì)這一嚴(yán)峻問題，人們開始尋找新的抗菌產(chǎn)品，這其中噬菌體作為細(xì)菌的天然殺手再次受到研究人員的關(guān)注[1-2]。然而，利用噬菌體防控細(xì)菌感染也面臨一個(gè)棘手問題，噬菌體宿主識(shí)別譜窄，一種噬菌體往往只侵染一種或一類細(xì)菌，這限制了噬菌體在抗菌領(lǐng)域推廣與應(yīng)用[3]。烈性噬菌體裂解系統(tǒng)中的溶菌酶、穿孔素等蛋白作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，引起細(xì)菌裂解，效率高且不受宿主譜的限制，對(duì)細(xì)菌具有廣譜的裂解活性，已成為開發(fā)新型抗菌制劑的熱點(diǎn)之一[4-6]。

烈性噬菌體裂解宿主細(xì)菌的過程有著緊密的調(diào)控、遵循著嚴(yán)格的時(shí)間順序[7-9]。溶菌酶-穿孔素二元裂解模型的提出對(duì)這一過程給予系統(tǒng)的解析。穿孔素是控制裂解時(shí)間的小分子量疏水性跨膜蛋白，在特定時(shí)間以寡聚體形式聚集于細(xì)胞內(nèi)膜上并形成穩(wěn)定的跨膜孔道，是噬菌體啟動(dòng)裂解步驟的“定時(shí)器”[10-12]。溶菌酶是一種胞質(zhì)水解酶，隨著孔道的打開，溶菌酶被釋放到胞外，對(duì)肽聚糖層進(jìn)行高效的切割[13-14]。近年來發(fā)現(xiàn)的Spanin蛋白對(duì)二元裂解模型做了進(jìn)一步完善，該蛋白定位在細(xì)菌外膜，通過構(gòu)象變化破壞細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)[15-16]。在溶菌酶、穿孔素和Spanin的共同作用下，被侵染細(xì)菌徹底崩解。因此，研究上述3種蛋白與宿主細(xì)菌的作用關(guān)系，探明各自對(duì)宿主的損傷機(jī)制，才能更科學(xué)地加以利用。

T7噬菌體是侵染大腸桿菌的小型烈性噬菌體，具有良好的生長(zhǎng)性能，侵染宿主細(xì)菌1～2 h即能完全裂解。對(duì)T7噬菌體的生物學(xué)背景已有相對(duì)全面的研究，其全部基因序列己經(jīng)測(cè)定，是噬菌體研究的理想模型。本研究通過原核系統(tǒng)表達(dá)T7噬菌體穿孔素蛋白，分析其結(jié)構(gòu)特征，揭示該蛋白對(duì)宿主的損傷作用，并測(cè)定其抑菌活性，以期為新型抗菌制劑的開發(fā)提供有益探索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

質(zhì)粒、菌株與噬菌體：質(zhì)粒pET-28a（+）為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌BL21-DE3、T7 select 415-1b噬菌體購(gòu)自Merck公司。

主要試劑：限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄酶為大連寶生物公司產(chǎn)品;HRP標(biāo)記抗His標(biāo)簽二抗購(gòu)自Abcom公司;引物由金斯瑞生物公司合成，引物序列為：Holin-F：5′-ATACCATGGGCGTGCTATCATTAGACT-3′，Holin-R：5′-AGACTCGAGTCACTCCTTATTGGCT-3′，引入中下劃線分別表示限制酶切位點(diǎn)（NcoⅠ和 BamHⅠ）;其余試劑均為分析純。

1.2 Holin基因分析

將Holin基因翻譯成對(duì)應(yīng)蛋白序列，利用在線分析工具TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）對(duì)其進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè);在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.xfam.org）進(jìn)行比對(duì)，分析Holin蛋白所屬的家族;Protparam工具（https：//web.expasy.org/protparam）分析蛋白的理化性質(zhì);SOPMA工具（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.3 重組菌構(gòu)建

以T7 select415-1b噬菌體基因組為模板，PCR擴(kuò)增Holin基因。根據(jù)預(yù)設(shè)的酶切位點(diǎn)將基因片段插入原核表達(dá)載體pET-28a（+），構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-Holin，NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定及測(cè)序分析。將序列正確的重組表達(dá)質(zhì)?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌BL21-DE3感受態(tài)細(xì)胞，篩選表達(dá)Holin蛋白的重組菌BL-Holin。

1.4 Holin蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定

挑取單菌落BL-Holin接入含有1 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過夜培養(yǎng)。取 50 μL 過夜培養(yǎng)菌液至5 mL新鮮卡那霉素抗性LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)2 h，加入工作濃度為0.5 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。同時(shí)，設(shè)BL21和BL-Holin未誘導(dǎo)對(duì)照。從誘導(dǎo)起始點(diǎn)開始，每隔2 h取樣，經(jīng)12% SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。轉(zhuǎn)印蛋白至NC膜，用HRP標(biāo)記的羊抗His tag二抗鑒定Holin蛋白。

1.5 Holin蛋白表達(dá)對(duì)宿主菌增殖的影響

以1 ∶ 100比例轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)的BL21、BL-Holin至新鮮培養(yǎng)基，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期往重組菌 BL-Holin 中加入工作濃度為0.5 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)設(shè)BL21和未誘導(dǎo)對(duì)照組，于37 ℃、200 r/s搖床持續(xù)培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)接起始點(diǎn)開始每隔1 h取200 μL培養(yǎng)液測(cè)定D600 nm，繪制3組細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。

1.6 Holin蛋白表達(dá)對(duì)宿主菌表面結(jié)構(gòu)的影響

以1 ∶ 100比例轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)的BL-Holin重組菌，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，持續(xù)誘導(dǎo)3 h，同時(shí)設(shè)未誘導(dǎo)對(duì)照。5 000 r/min，10 min收集重組菌，PBS重懸洗滌1次，再次離心后收集沉淀，采用4%多聚甲醛固定。樣品送至揚(yáng)州大學(xué)檢測(cè)中心，掃面電鏡觀察細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 Holin蛋白序列分析

利用多種生物學(xué)軟件對(duì)T7噬菌體Holin蛋白進(jìn)行分析：Protparam工具顯示T7噬菌體Holin蛋白由67個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為7 359，穩(wěn)定系數(shù)為7.71，總平均親水性為0.464，為穩(wěn)定、疏水性蛋白質(zhì)。Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果表面T7噬菌體Holin蛋白屬于Phage_holin_2_2家族（PF10746）。TMHMM軟件分析表明其氨基酸端1～36 aa位于胞外區(qū)，37～55 aa為跨膜區(qū)，56～67 aa的羧基端為胞內(nèi)區(qū)。SOPMA工具顯示，holin蛋白。α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、延長(zhǎng)鏈、和無規(guī)則卷曲分別占氨基酸總數(shù)的56.72%、0.00%、7.46%、10.45%和2537%（圖1）。

2.2 Holin基因的克隆及重組質(zhì)粒構(gòu)建

由圖2-A和2-B可知，以T7噬菌體基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增出約250 bp的Holin基因，測(cè)序結(jié)果表明獲得基因片段序列正確。將該基因片段插入pET-28a（+）載體，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒載體pET-Holin，NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定正確。

2.3 Holin蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

由圖3-A可知，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期的重組菌BL-Holin經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后細(xì)菌濃度并未迅速上升，相反隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，重組菌出現(xiàn)裂解現(xiàn)象，培養(yǎng)液變清亮且泡沫增多。由圖3-B可知，SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)菌有蛋白表達(dá)。由圖3-C可知，利用Holin蛋白羧基端融合表達(dá)的His標(biāo)簽進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，進(jìn)一步確定誘導(dǎo)產(chǎn)生Holin蛋白，并且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)Holin蛋白的累積量逐漸增加。

2.4 Holin蛋白的表達(dá)對(duì)宿主細(xì)菌增殖的影響

IPTG誘導(dǎo)重組大腸桿菌BL-Holin表達(dá)Holin蛋白，通過對(duì)重組表達(dá)菌不同時(shí)間點(diǎn)的濁度測(cè)定來評(píng)價(jià)Holin蛋白對(duì)宿主細(xì)菌增殖能力的影響，由圖4可知，BL-Holin轉(zhuǎn)接后2 h開始誘導(dǎo)，細(xì)菌濁度緩慢上升至4 h，然后濁度逐漸下降，6～8 h濁度維持在較低水平，8 h后濁度開始緩慢上升。而未經(jīng)誘導(dǎo)的BL-Holin表現(xiàn)出與BL21相似的增殖性能，表明Holin蛋白的表達(dá)抑制宿主的正常增殖。

2.5 Holin蛋白對(duì)宿主細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)的損傷

通過掃面電鏡觀察經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的BL-Holin 重組菌表面結(jié)構(gòu)變化，評(píng)價(jià)Holin蛋白對(duì)宿主的損傷情況。由圖5-B可知，誘導(dǎo)表達(dá)Holin蛋白的重組菌表面塌陷，菌體皺縮，而未誘導(dǎo)的重組菌保持完整的表面結(jié)構(gòu)（圖5-A）。由此可知，重組菌表達(dá)Holin蛋白后造成胞膜的損傷，其結(jié)構(gòu)完整性被破壞致使內(nèi)容物釋放到胞外，引起菌體死亡。

3 討論

上世紀(jì)40年代開始，噬菌體研究進(jìn)入早期的黃金時(shí)代，以λ噬菌體和T4噬菌體作為模式生物的相關(guān)研究為現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立作出了卓越貢獻(xiàn)。Young于1992年首次提出了著名的穿孔素-溶菌酶二元裂解系統(tǒng)理論，清晰地闡明了λ噬菌體裂解宿主的過程[17]。當(dāng)然，這一理論將肽聚糖層的破壞作為裂解宿主菌的主要標(biāo)志，卻忽視了細(xì)菌外膜對(duì)裂解過程的阻礙。近年來，第三類裂解相關(guān)蛋白Spanin的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步完善了該理論，至此λ噬菌體裂解宿主的過程可分為3個(gè)步驟：Holin蛋白在細(xì)菌內(nèi)膜打孔，釋放胞內(nèi)溶菌酶切割肽聚糖層，Spanin通過構(gòu)象變化撕裂細(xì)菌外膜，最終導(dǎo)致細(xì)菌的徹底崩解。參與這一過程的穿孔素、溶菌酶和Spanin均能造成細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)的損傷，因此被視為開發(fā)新型抗菌制劑的候選物質(zhì)而備受關(guān)注。

T7噬菌體裂解系統(tǒng)研究報(bào)道較少，現(xiàn)已明確溶菌酶（gene3.5）、穿孔素（gene17.5）以及可能發(fā)揮Spanin功能的gene18.5/18.7構(gòu)成了T7噬菌體裂解系統(tǒng)[15，18]。本研究對(duì)T7噬菌體Holin蛋白進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白分子僅有1個(gè)跨膜區(qū)，屬于Phage_holin_2_2家族（PF10746），氨基酸端位于胞外，羧基端位于胞內(nèi)，這與報(bào)道的T4、T5噬菌體的Holin蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相同。為了不影響T7噬菌體Holin蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，選擇位于胞內(nèi)的羧基端融合表達(dá)His標(biāo)簽用于Western-blot檢測(cè)。結(jié)合圖3-C和圖4，重組菌誘導(dǎo)后2 h內(nèi)Holin蛋白處于積累階段，此時(shí)細(xì)菌濃度緩慢上升，當(dāng)Holin蛋白量積累到一定閾值后造成細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)損傷，此時(shí)細(xì)菌濃度逐漸下降并維持在較低水平。繼續(xù)誘導(dǎo)后期至8 h，此時(shí)Holin蛋白積累量仍然增加，而細(xì)菌濃度也逐步增加，對(duì)于這一現(xiàn)象尚需要進(jìn)一步研究分析。由圖5可見，Holin蛋白在細(xì)菌內(nèi)膜聚集并形成孔道，由于缺少溶菌酶的釋放，并不會(huì)對(duì)胞外結(jié)構(gòu)造成直接破壞，但此時(shí)胞內(nèi)可溶性蛋白、電解質(zhì)等可通過孔道流失，菌體呈現(xiàn)塌陷、皺縮狀態(tài)，最終死亡。

作為噬菌體裂解系統(tǒng)，穿孔素、溶菌酶無論單獨(dú)使用還是聯(lián)合使用，均能起到有效抑制細(xì)菌增殖的作用[19]。穿孔素還可以作為轉(zhuǎn)運(yùn)載體，輔助藥物、核酸、蛋白質(zhì)進(jìn)入菌體內(nèi)部，進(jìn)一步提高抗菌效率[20-21]。此外，噬菌體在入侵宿主時(shí)需要在菌體表面開孔注入核酸物質(zhì)，例如T7噬菌體的gp16能夠水解細(xì)胞壁啟動(dòng)感染，這類蛋白也可以用作抗菌制劑的開發(fā)[22]。本研究對(duì)T7噬菌體的穿孔素進(jìn)行原核表達(dá)，分析該蛋白的結(jié)構(gòu)、評(píng)價(jià)其抑菌活性，并初步解析其損傷細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)的機(jī)制，這可為進(jìn)一步研究穿孔素的抑菌機(jī)制以及開發(fā)利用穿孔素的抗菌活性做出有益的探索。

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