陰美嬌 金香子 Amit Sinha 金光明

[摘要] 目的 利用超聲結合聚乙二醇化多西他賽白蛋白納米粒（PEG-DANPs）治療裸鼠非小細胞肺癌模型，為臨床治療人非小細胞肺癌提供一種新思路。 方法 建立BALB/c裸鼠人非小細胞肺癌皮下移植瘤及原位癌模型，分別用多西他賽白蛋白納米粒（DANPs）、PEG-DANPs及PEG-DANPs結合超聲波（US）照射對兩組裸鼠進行治療，單次療程為7 d，共4個療程，超聲波輻照強度為1 MHz，每次時長30 s。全部療程給藥結束2 d后，將全部造模裸鼠處死，取皮下組瘤塊進行TUNEL實驗觀察癌細胞凋亡情況，對原位癌組裸鼠的肺及肝組織進行HE染色病理實驗及病理半定量分析。 結果 與其他給藥組相比，US+PEG-DANPs組裸鼠瘤塊體積最小（P<0.05，P<0.01）;同時其體重保持最好，提示其毒性最?。≒<0.05）。從NSCLC原位癌裸鼠肺組織和肝組織病理圖來看，US+PEG-DANPs抑制原位癌、抗轉移作用最為明顯;對其肺組織和肝組織病理圖進行半定量分析，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。根據(jù)TUNEL 法檢測結果，US+PEG-DANPs組誘導癌細胞凋亡的能力最強。 結論 超聲波結合PEG-DANPs對裸鼠非小細胞肺癌模型的治療效果明顯，有望成為治療非小細胞肺癌的一種新選擇。

[關鍵詞] 非小細胞肺癌;超聲波;多西他賽;白蛋白納米粒;聚乙二醇

[中圖分類號] R944? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）33-0043-05

[Abstract] Objective To treat non-small cell lung cancer model in nude mice by ultrasound combined with docetaxel loaded PEG-albumin nanoparticles（PEG-DANPs），so as to provide a new idea for clinical treatment of human non-small cell lung cancer. Methods The models of subcutaneous transplanted tumor and carcinoma in-situ of human non-small cell lung cancer in BALB/c nude mice were established. Docetaxel loaded albumin nanoparticles（DANPs），PEG-DANPs and PEG-DANPs combined with ultrasound（US） were used to treat the two groups of nude mice，with a single course of treatment of 7 days and a total of 4 courses of treatment. The intensity of ultrasound irradiation was 1 MHz and the duration of each time was 30 s. Two days after the administration of the whole course of treatment， all the nude mice were sacrificed， and the tumor mass of the subcutaneous group was taken for TUNEL test to observe the apoptosis of cancer cells. The lung and liver tissues of nude mice of the in-situ cancer group were subjected to pathological experiment of HE staining and semi-quantitative pathological analysis. Results Compared with other groups，the tumor volume of nude mice in the US combined with PEG-DANPs group was the smallest（P<0.05，P<0.01）. At the same time，its weight kept the best，suggesting that its toxicity was the smallest（P<0.05）. From the pathological images of lung tissue and liver tissue of nude mice with NSCLC carcinoma in-situ，US combined with PEG-DANPS have the most obvious efficacy on inhibiting carcinoma in-situ and resisting metastasis. Semi-quantitative analysis was given to the pathological images of lung and liver，and the difference was statistically significant（P<0.05）. According to TUNEL method，the ability of inducing apoptosis of cancer cells in the US combined with PEG-DANPs group was the strongest. Conclusion Ultrasound combined with PEG-DANPs have obvious therapeutic efficacy on non-small cell lung cancer model in nude mice，which is expected to be a new choice for the treatment of non-small cell lung cancer.

[Key words] Non-small cell lung cancer; Ultrasonic wave; Docetaxel; Albumin nanoparticles; Polyethylene glycol

非小細胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC）在所有肺癌的分型中最為常見，占肺癌總數(shù)的75%以上[1]，其5年總生存率不足15%[2]，嚴重危害人類健康。通過本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，聚乙二醇化多西他賽白蛋白納米粒（Docetaxel loaded PEG-albumin nanoparticles，PEG-DANPs）可有效抑制NSCLC的生長和轉移，然而，如何進一步提升納米粒的靶向性及療效仍是我課題組需要研究的方向。

超聲波（Ultrasound，US）是指高于20 000 Hz的聲波，特點是方向性好、穿透能力強、聲能集中，在醫(yī)學、軍事、工業(yè)、農(nóng)業(yè)各領域中應用廣泛。國外研究[3]表明，超聲波可以提升納米抗癌藥的治療效果，其主要作用機制為超聲波的一些物理效應，如空化及彌散作用。

本研究將建立BALB/c裸鼠NSCLC皮下移植瘤及原位癌模型，利用US結合PEG-DANPs對上述模型進行治療，旨在進一步提升納米制劑靶向性，同時闡明超聲波作用的機制，為治療NSCLC提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 動物和細胞株

人非小細胞肺癌A549細胞系（延邊大學附屬醫(yī)院中心實驗室提供）。SPF級BALB/c裸鼠（北京維通利華有限公司）共50只，生產(chǎn)許可證編號為SCXK （京）2016-0006，使用許可證編號為SYXK（京）2014-0023，均為雌性，周齡4～7周，均重20 g。在延邊大學附屬醫(yī)院中心試驗室SPF級別動物房飼養(yǎng)，環(huán)境溫度18～22℃，濕度50%～60%。所有實驗嚴格遵守倫理3R原則。

1.2 儀器與試劑

AIRTECH超凈臺（蘇凈安泰有限公司）;RDN-1000型細胞培養(yǎng)箱（中國楊輝生物儀器）;Frontier 5000 Multi Pro多功能離心機（中國OHAUS公司）;Acuson S2000微型超聲儀（德國 SIEMENS 公司）。DANPs和PEG-DANPs （自制）;胎牛血清、胰蛋白酶、杜爾伯科極限必需培養(yǎng)基（DMEM）;磷酸緩沖液（北京朗潤科技有限公司）;所用有機溶劑均為分析純。

1.3 裸鼠NSCLC皮下移植瘤模型建立

實驗前24 h Matricgel融化成液體;胰酶消化A549細胞，終止反應后搖勻制成細胞懸液，以1500 r/min離心，加入PBS液，調(diào)整細胞濃度至1×105個/mL，將Matricgel液加入細胞（1∶1） 制成造模用注射液。取20只BALB/c裸鼠，平均分成4組，在裸鼠左腋窩下注射0.1 mL（約3×106個細胞 ），待形成皮下移植瘤模型。每日觀察荷瘤裸鼠全身狀況、活動情況，以注射處出現(xiàn)瘤體作為造模成功標準，造模成功率為100%。每隔3～4天稱量體重并用游標卡尺測量移植瘤體的長徑（L）、短徑（W）1次，取每例各小鼠腫瘤長短徑平均值，按公式V=1/2（L×W2）計算移植瘤平均體積，并繪制腫瘤生長變化曲線及裸鼠體重變化曲線。

1.4 裸鼠NSCLC原位癌模型建立

取30只裸鼠腹腔內(nèi)注射氯胺酮和甲苯噻嗪進行麻醉。使裸鼠處于右側臥位，消毒左側胸壁，在mid-axillary線（低肋線上1.5 cm處）切開5～10 mm，剝離脂肪和肌肉，通過胸膜，注入細胞懸液25～30 μL[1∶1， （1～3）×106細胞與基底膜基質(zhì)混合]，non-silk線縫合切口，形成原位癌模型[4]（圖1）。術后繼續(xù)飼養(yǎng)，自由進食，每日觀察荷瘤裸鼠全身狀況、活動情況，以裸鼠mid-axillary線最菲薄處可捫及瘤塊突起作為造模成功標準，造模成功率為76.7% （23/30）。取造模成功且一般狀況較好的20只裸鼠平均分為4組進行治療，剩余3只處死。

1.5 方法

將移植瘤模型裸鼠和原位癌模型裸鼠培養(yǎng)約13 d，直到皮下腫瘤的平均體積達到約120 mm3，分別以5%葡萄糖注射液（對照組），DANPs、PEG-DANPs及US+PEG-DANPs進行治療。將裸鼠仰臥位固定于試驗臺上，不麻醉通過尾靜脈進行藥物注射，劑量為20 mg/kg，同時右手持超聲儀探頭，探頭接觸皮下組瘤塊、原位組肺部進行超聲照射，超聲波輻照強度為1 MHz，單次輻照時間為30 s。每療程為7 d，共4個療程。當末次治療結束后48 h，將全部皮下組和原位組裸鼠以頸椎脫臼法處死，取出瘤塊、肺、肝等臟器并浸泡在10%的中性甲醛中固定，進行HE染色。

1.6 NSCLC模型裸鼠治療后HE染色半定量分析

使用圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析。癌細胞排列情況、細胞核形態(tài)、染色深淺、異型程度、肺泡內(nèi)有無癌栓形成、肝組織有無癌巢形成、有無纖維組織增生或出血、有無癌細胞變性壞死。無或正常為0分，逐漸遞進，直至重度或明顯異常為3分[5]。

1.7 TUNEL 法檢測NSCLC模型裸鼠癌細胞凋亡

嚴格按照試劑盒說明書配制反應物，將Tunel反應混合物滴加至DANPs、PEG-DANPs和US+PEG-DANPs組，將dUTP滴加至5%葡萄糖組，在避光條件下進行POD 轉化，光鏡觀察直至顏色發(fā)生變化，加入PBS 終止反應，蘇木復染后沖洗、脫水、封片。

1.8 統(tǒng)計學分析

應用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC皮下移植瘤組裸鼠瘤塊體積與各種治療方法的關系

隨著治療時間的增加，DANPs、PEG-DANPs和US+PEG-DANPs組裸鼠皮下瘤塊體積的增長均得到不同程度的抑制，而抑制腫瘤生長效果最佳的一組為US+PEG-DANPs組（*P=0.041<0.05;**P=0.001<0.01）。見圖2。

2.2 NSCLC皮下移植瘤組裸鼠體重與各種治療方法的關系

根據(jù)裸鼠體重與不同藥物組曲線來看，DANPs、PEG-DANPs和US+PEG-DANPs組裸鼠的體重在不同程度上均出現(xiàn)下降趨勢，即出現(xiàn)體重減輕的副作用，而US+PEG-DANPs組在維持裸鼠體重方面效果最佳（*P=0.039<0.05）。見圖3。

2.3 NSCLC原位癌裸鼠肺組織和肝組織病理與各種治療方法的關系

從原位癌模型的肺組織HE染色病理圖可以發(fā)現(xiàn)（封三圖3），5%葡萄糖組肺泡內(nèi)存在巨大癌栓，細胞核異型性顯著;DANPs組細胞核變淺，癌栓體積較5%葡萄糖組顯著縮小;PEG-DANPs組肺泡內(nèi)未見癌栓，可見局灶性癌細胞變性及壞死，細胞核明顯變淡;US+PEG-DANPs組細胞核呈紅色，無癌栓及核分裂相，可見纖維組織增生。提示US+PEG-DANPs抑制原位癌最為有效。A549肺癌原位癌模型的肝組織病理圖（封三圖4），5%葡萄糖組光鏡下可見肝組織內(nèi)巨大癌巢，細胞核深染，異型性顯著;DANPs組癌細胞分裂依舊典型，細胞核深藍色，但癌巢體積較5%葡萄糖組減小;PEG-DANPs組癌巢明顯縮小，細胞核顏色明顯變淺;US+PEG-DANPs組肝組織趨近正常染色，未見核分裂相。由此可知，US+PEG-DANPs療法對肝轉移的抑制作用較明顯。

2.4 NSCLC原位癌裸鼠肺組織和肝組織病理圖半定量分析

分別隨機選取原位癌裸鼠肺、肝切片各15個，利用圖像分析系統(tǒng)進行半定量評分。與其他給藥組相比，US+PEG-DANPs組凋亡指數(shù)存在顯著差異（P<0.05），提示其具有更好的抗瘤、抗轉移療效。見表1。

2.5 TUNEL 法檢測皮下移植瘤裸鼠腫瘤細胞凋亡情況

見封三圖5。5%葡萄糖組內(nèi)極少發(fā)現(xiàn)凋亡細胞，細胞體積大、深藍色，排列緊密;DANPs組：細胞較5%葡萄糖組縮小，顏色變淡;PEG-DANPs組：細胞較DANPs組進一步縮小，排列疏松，呈淡染的棕色;US+PEG-DANPs組：可見大量凋亡細胞，細胞排列疏松，呈顯著的棕黃色，可見凋亡小體的存在。

3 討論

本研究結果顯示，US結合PEG-DANPs可以有效抑制NSCLC裸鼠瘤塊的生長，同時具有較小的毒副作用，這是因為PEG-DANPs進入機體后，沒有像大多數(shù)市售抗癌藥一樣被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所吞噬，而是主動與NSCLC腫瘤細胞相結合，具有較高的靶向性。另外，其擁有較長的半衰期和良好的緩釋性，使其對腫瘤具有較好的治療效果[6]。當PEG-DANPs通過胞吞（Clathrin-mediated endocytosis）方式進入癌細胞后[7]，其攜帶的主要成分多西他賽（Docetaxel，DTX）迅速與細胞內(nèi)微管蛋白結合，破壞腫瘤細胞結構并抑制腫瘤細胞生長[8];另外，PEG-DANPs通過阻止癌細胞有絲分裂，導致癌細胞增殖減少[9]，發(fā)揮抗癌作用。

TUNEL染色技術被認為是檢測細胞凋亡的金標準。具有高敏感、高特異性等特點，于早期即可快速地檢測到細胞凋亡，是目前廣泛接受與使用的監(jiān)測細胞凋亡的實驗方法。本研究結果顯示，與其他治療方法相比，US+PEG-DANPs鏡下凋亡細胞數(shù)、凋亡面積最大（達70.35%），提示其引起A549細胞凋亡的能力最好。

本研究與前期研究的最大不同在于，創(chuàng)新性地增加US照射這一手段。本研究結果顯示，US+PEG-DANPs對裸鼠NSCLC模型的治療效果較為明顯，分析其具體機制：首先，US照射腫瘤時，腫瘤血管內(nèi)的液體在減壓作用下形成的負壓區(qū)產(chǎn)生大量真空微氣泡，而當轉換成增壓作用時，這些真空微氣泡受壓破裂，瞬間形成超過上千個大氣壓的沖擊力，使藥物制劑穿過分子間隙，直接被推入癌細胞內(nèi)發(fā)揮抗癌作用[10]，即空化作用;從化學角度來看，空化作用可產(chǎn)生巨大的壓強，能提升細胞膜對鉀、鈣離子的通透性，抗癌制劑便能夠更快地進入癌細胞[11]，即彌散作用。其次，當藥物制劑進入癌細胞后，US的機械振動效應可引起癌細胞內(nèi)的物質(zhì)運動，這也稱為超聲的“按摩作用”，通過超聲波的細微按摩，藥物制劑在細胞漿內(nèi)震蕩、摩擦、循環(huán)，使細胞內(nèi)部結構發(fā)生變化，堅硬的部分變松軟，這樣藥物便能夠充分地與細胞相接觸并發(fā)揮抗癌作用[12]。最后，US產(chǎn)生的“熱效應”也發(fā)揮著一定的作用，熱作用首先在一定程度上可以殺死腫瘤細胞，目前在臨床上應用的超聲刀等技術就是依據(jù)這種原理[13]。本研究結果顯示，照射產(chǎn)生的溫度并未達到超聲刀那樣的程度，因此這種作用是可以忽略的，熱作用在本研究中主要體現(xiàn)為促進腫瘤組織局部血液和淋巴循環(huán)加快，新陳代謝加速，使藥物更容易滲透入細胞而提高藥物吸收[14]。

另外，本研究使用的高頻探頭所產(chǎn)生的超聲波類似于以探頭為底而向組織深處延伸的圓柱體，其不會向腫瘤周邊正常的組織擴散，因此幾乎不會損害周邊正常組織[15]。肺泡中的癌栓及肝組織中的癌巢這些病灶，位置較深，單純藥物難以到達，US照射可以促進腫瘤部位血液及淋巴液的循環(huán)[16]，由此提升腫瘤局部的新陳代謝，從而更好地將藥物制劑引入深層結構中[17-19]。有學者利用US結合納米抗癌制劑對乳腺癌及前列腺癌進行治療，取得了較為滿意的效果[20-21]，以上研究也進一步證明本研究的結果。

正常肺組織為含氣器官，因氣體對聲波的全反射，一般來講，超聲束很難到達深部的肺組織。然而，有學者研究表明[22]，當肺臟病變有一部分與胸壁接觸或病灶與胸壁距離較短時，是可以形成聲窗以供超聲波照射。在本研究中，首先種植在裸鼠mid-axillary線上的瘤塊緊貼菲薄的胸壁，其次裸鼠肺部體積小，深部組織距探頭的距離極近，故本研究超聲波可以到達病灶。

綜上所述，US結合PEG-DANPs的這種治療方式，可以作為晚期NSCLC患者的一種新選擇，具有一定的推廣價值和前景。

[參考文獻]

[1] Martin R，Klaus FR. Precision diagnosis and treatment for advanced non-small-cell lung cancer[J]. New Engl J Med，2017，377（9）：849-861.

[2] Siegel RL，Miller KD，Jemal A. Cancer statistics，2016[J]. Ca A Cancer J Clin，2016，66（1）：7-30.

[3] Manolescu D，Davidescu L，Traila D，et al. The reliability of lung ultrasound in assessment of idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Clin Interv Aging，2018，22（13）：437-449.

[4] Quan XQ，Kang L，Yin XZ，et al. Synthesis of PEGylated hyaluronic acid for loading dichloro（1，2-Diaminocy-clohexane）platinum（II）（DACHPt） in nanoparticles for cancer treatment[J].Chinese Chem Lett，2015，22（26）：695-699.

[5] Silvia G，Maria IA，Emanuele D，et al. Morphological and semiquantitative kinetic analysis on dynamic contrast enhanced MRI in triple negative breast cancer patients[J].Acad Radiol， 2019，26（5）：620-625.

[6] 金光明，金明姬，尹學哲，等. 聚乙二醇化多西他賽白蛋白納米粒用于非小細胞肺癌模型的實驗研究[J].中國新藥雜志，2017，26（23）：2871-2876.

[7] 葉鵬，陳莉，李丹，等. 多西他賽固體脂質(zhì)納米?？谷橄侔┬Ч皺C制研究[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2016，16（33）：415-420.

[8] Ran R，Liu YY，Gao HL，et al. PEGylated hyaluronic acid-modified liposomal delivery system with anti-γ-Glutamylcyclotransferase siRNA for drug-resistant MCF-7 breast cancer therapy[J]. Pharl Biotech，2015，104（5）：476-484.

[9] Huang Y，Deng S，Luo X，et al. Evaluation of intestinal absorption mechanism and pharmacokinetics of curcumin-loaded galactosylated albumin nanoparticles[J]. Inter J Nanomed，2019，14（9）：9721-9730.

[10] Mahnaz A，Nima FM. Within-day and between-day reliability of thickness measurements of abdominal muscles using ultrasound during abdominal hollowing and bracing maneuvers[J]. J Body Mov Thera，2017，22（1）：122-128.

[11] Lee JH，Moon HW，Han HK，et al. Antitumor effects of intra-arterial delivery of albumin-doxorubicin nanoparticle conjugated microbubbles combined with ultrasound-targeted microbubble activation on VX2 rabbit liver tumors[J]. Cancers，2019， 11（4）：581-596.

[12] Ding W，Wu CS. Effect of ultrasonic vibration exerted at the tool on friction stir welding process and joint quality[J].J Manuf Process，2019，42（5）：192-201.

[13] Zhao G，Wang Z，Hu S， et al. Effect of ultrasonic vibration of molten pool on microstructure and mechanical properties of Ti-6Al-4V joints prepared via CMT+P welding[J]. J Manuf Process，2020，52（8）：193-202.

[14] Wang H，Yuan Y，Chen Y. Characterization and mechanism of accelerated curing of adhesives by in situ ultrasonic vibration for bonded joints[J]. J Polym Eng，2019， 40（1）：1-12.

[15] Ramon A，Beatriz A，Consuelo B，et al. Simultaneous determination of multiclass emerging contaminants in aquatic plants by ultrasound-assisted matrix solid-phase dispersion and GC-MS[J]. Envir Sci Pollu Res Inter，2017， 24（9）：1-10.

[16] Zhang Y，Wan CF，Du J，et al. The in vitro study of Her-2 targeted gold nanoshell liquid fluorocarbon poly lactic-co-glycolic acid ultrasound microcapsule for ultrasound imaging and breast tumor photothermal therapy[J]. J Bio Sci Poly，2018，29（1）：57-62.

[17] Jin GM，Jin MJ，Yin XZ，et al. A comparative study on the effect of docetaxel-albumin nanoparticles and docetaxel-loaded PEG-albumin nanoparticles against non-small cell lung cancer[J]. Inter J Oncol，2015，47（5）：1945-1953.

[18] Jin GM，Jin MJ，Jin ZH，et al. Docetaxel-loaded PEG-albumin nanoparticles with improved antitumor. Efficiency against non-small cell lung cancer[J]. Oncol Rep，2016， 36（2）： 871-876.

[19] Zhang HJ，Chen JJ，Zhu X，et al. Ultrasound induced phase-transition and invisible nanobomb for imaging-guided tumor sonodynamic therapy[J]. J Mater Chem B，2018，6（6）：156-162.

[20] Ji D，Yan D. Factors of survival rate，relapse-related pathology and ultrasound imaging of patients with breast cancer confirmed by ultrasound screen[J]. Modern Med J China，2019， 21（9）：1-5.

[21] Song C，Sun WJ，Xiao YH，et al. Ultrasmall iron oxide nanoparticles：Synthesis， surface modification，assembly，and biomedical applications[J]. Drug Discov Today，2019， 38（10）：371-380.

[22] 李長隆. 肺部疾病的彩色多普勒超聲診斷及分析[J]. 臨床肺科雜志，2013，18（3）：75.

（收稿日期：2020-07-16）