王思雅 徐方旭 柳葉飛 王升厚*

（1沈陽師范大學生命科學學院，遼寧沈陽110034；2沈陽師范大學實驗教學中心，遼寧沈陽110034）

腸道菌群是人體腸道的正常微生物，能合成多種人體生長發(fā)育必需的維生素，如B族維生素、維生素K、煙酸、泛酸等，還能利用蛋白質殘渣合成必需氨基酸，參與糖類和蛋白質的代謝，同時還能促進鐵、鎂、鋅等礦物元素的吸收[1]。這些營養(yǎng)物質對人類健康有重要作用，一旦缺少會引起多種疾病。人體腸道內寄生著10萬億個細菌，它們能影響體重和消化能力、降低感染和自身免疫疾病的患病風險，還能控制人體對癌癥治療藥物的反應[2]。其中益生菌主要包括雙歧桿菌和乳酸桿菌，其有促進腸道蠕動，抑制致病菌群生長，分解有害、有毒物質等作用[3]。此外，人體腸道內也存在某些致病菌如腸球菌、大腸桿菌等，當它們大量繁殖就會引發(fā)多種疾病。

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又名北冬蟲夏草，為我國傳統(tǒng)滋補性食藥用藥，是蟲草屬的模式種[4]。硒（Se）具有抗癌、抗氧化、保護機體免受活性氧自由基損傷、保護心臟、解毒、提高免疫力、延緩衰老等多種藥理作用。富硒蛹蟲草通過自然生長富硒，既含有蛹蟲草全精華，又能補充人體硒蛋白，價值更勝一籌[5]。賈俊杰[6]等表明，蛹蟲草可以緩解小鼠腸道菌群失調的癥狀，但關于小鼠正常狀態(tài)下飲用蛹蟲草溶液對腸道菌群變化的研究較少，試驗首次探討富硒蛹蟲草對小鼠腸道菌群影響，為醫(yī)療、臨床研究提供依據，為新藥物開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

（1）試驗小鼠：昆明小鼠59只，5～6周齡，雌29只、雄30只，18～22 g[7]。飼養(yǎng)于沈陽師范大學動物房。

（2）蛹蟲草：沈陽師范大學實驗室內普通蛹蟲草、富硒蛹蟲草各一種。

（3）培養(yǎng)基：雙歧桿菌（BBL培養(yǎng)基）：蛋白胨15 g，葡萄糖20 g，酵母浸粉2 g，可溶性淀粉0.5 g，氯化鈉 5 g，L-半胱氨酸 0.5 g，番茄浸粉 5 g，肝浸粉2 g，瓊脂20 g，吐溫80 1 mL，pH 7.0[8]。

乳酸桿菌（MRS培養(yǎng)基）：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，檸檬酸氫二銨[（NH4）2HC6H5O7]2.0 g，葡萄糖（C6H12O6·H2O）20.0 g，吐溫80 1 mL，乙酸（CH3COONa·3H2O）5.0 g，磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）2.0 g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.58 g，硫酸錳（MnSO4·H2O）0.25 g，瓊脂 18.0 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.0～6.5[9]。

腸球菌（膽鹽－七葉苷－疊氮鈉瓊脂）：牛肉浸粉3 g，胰酪蛋白胨17 g，酵母粉5 g，牛膽粉10 g，氯化鈉5 g，七葉苷1 g，檸檬酸鐵銨0.5 g，疊氮化鈉0.25 g，檸檬酸鈉1 g，瓊脂13.5 g，pH 7.1±0.2。

大腸桿菌（EMB培養(yǎng)基）：蛋白胨10 g，乳糖10 g，磷酸氫二鉀2 g，瓊脂25 g，2%伊紅水溶液20 mL，0.5%亞甲藍水溶液13 mL，pH 7.4。

1.2 主要儀器設備

試驗主要儀器設備：臺式離心機（美國Sigma）；高壓滅菌鍋（日本Sanyo公司）；顯微鏡（日本Nikon）；生物超凈工作臺（美國Baker公司）；恒溫培養(yǎng)箱（江蘇太倉市實驗設備廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 小鼠分籠及喂養(yǎng)方法

表2 雌鼠分籠情況 g位

表3 雄鼠分籠情況 g位

本試驗共分7組，0倍組為空白對照組，1倍組至10倍富硒組為試驗組[10]，具體操作方法如下：

0倍組：灌喂生理鹽水，每日灌喂20 mL/（kg·BW），灌喂21 d。

1倍組至10倍富硒組：根據60 kg成人日攝入2 g蛹蟲草固體溶液換算小鼠為0.303 mg/g[11]，配制成 1倍（0.303 mg/g）、2倍（0.606 mg/g）、5倍（1.515 mg/g）、10倍（3.033 mg/g）不同質量濃度的蛹蟲草溶液，每日灌喂20 mL/（kg·BW），灌喂21 d[12]。雌、雄鼠重控制在±3 g之間（表2和表3），適應性喂養(yǎng)一周[13]。

1.3.2 腸道菌群數量測定

1.3.2.1 小鼠腸道內容物的采集

分別在第0天、第10天和第21天早晨對小鼠稱重，并采集小鼠的新鮮糞便樣0.05 g于滅菌試管中。取5 mL滅菌的磷酸鹽緩沖液加入糞樣試管中，充分振蕩混勻，成糞樣勻質液，再用10倍稀釋法稀釋，待測[14]。

1.3.2.2 腸道菌群的培養(yǎng)

根據待分離菌種的活菌數，選擇相應適宜稀釋度，每個稀釋度吸取0.1 mL稀釋液，用涂布棒進行平板涂布，每個稀釋度3個重復，培養(yǎng)條件如表4[15]。

厭氧培養(yǎng)方法：將厭氧菌接種于相應平板上，套上聚丙烯袋，置于CO2培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)。按表4方法[16]進行計數后，換算出每克腸道內容物中所含菌落數，以第0天的菌落數為對照觀察各組益生菌和致病菌數量的變化情況。每克腸道內容物菌落數以1 g（CFU/g內容物）表示，計算公式如下：每克腸道內容物菌落數=1 g（菌落數×稀釋倍數×每次稀釋取樣體積）/（接種用樣品體積×樣品質量）[17]。

表4 腸道菌群培養(yǎng)條件及鑒定方法

1.3.2.3 數據處理

試驗數據經Excel進行初步處理后用SPSS軟件進行統(tǒng)計，單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行差異顯著性檢驗，多重比較采用最小顯著差數法（LSD），結果以平均值±標準差表示[18]。

1.3.3 高通量方法測定

取靠近回盲部的小腸段，平鋪于濾紙上，縱向剖開，取腸腔內成形糞便于凍存管中，置液氮中6～8 min，于-80℃保存[19]，將雄鼠樣本0倍組（0 C）和普通5倍組（5 C）送上海生工生物公司檢測。

2 結果與分析

2.1 腸道菌群菌落形態(tài)的鑒定

由圖1可知，在同一稀釋度下雙歧桿菌和乳酸桿菌的數量要多于其他兩種菌，且雙歧桿菌菌落較小為瓷白色，顯微鏡下多呈X或Y型；乳酸桿菌菌落較大為微白色，顯微鏡下常為鏈狀；腸球菌菌落有明顯褐色圈；大腸桿菌菌落有綠色金屬光澤。

圖1 菌落形態(tài)的鑒定

2.2 蛹蟲草溶液對小鼠生命活動的影響

圖2 A、B雌雄鼠體重除10倍富硒組外均增加，且對照組增加量最大，說明灌胃不同濃度及不同品種的蛹蟲草會使小鼠體重增長減慢，而10倍富硒濃度導致小鼠體重下降，可能已影響小鼠生命活動。此外，灌胃15 d后，5倍組雌性小鼠體重降低，可能是到灌胃后期小鼠口味變差，飲食飲水量都減少，因此體重下降。

圖2 各組小鼠體重、日飲水及日食量變化

雌雄鼠日飲量（圖2C、D）和日食量（圖2E、F）除10倍富硒組外趨勢相近，可認為這幾組不同濃度的普通蛹蟲草對小鼠飲水量和進食量沒有顯著影響。但雄鼠10倍富硒組可能是由于蟲草濃度大，富硒營養(yǎng)多，導致其飲水量降低。對于雌鼠來說，灌喂后進食量大多數都比對照組增加的小，說明灌喂蛹蟲草對雌鼠進食有微弱影響。

2.3 小鼠各臟器指數測定結果

表5 小鼠各臟器指數 %單

由表5可以看出，不同組各臟器指數變化不大，均到萬分之一才有少量變化，且進行單因素方差分析，不存在差異顯著性（P＞0.05），因而可以認為灌喂不同濃度蛹蟲草對小鼠的臟器無明顯影響。

2.4 蛹蟲草溶液對小鼠腸道菌群的影響

表6 小鼠腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌的菌量變化（X±SD）1 g（CFU/g）中

2.4.1 益生菌數量變化

統(tǒng)計學上，各組雙歧桿菌數量，與對照組相比差異都極顯著（P＜0.01）。從菌落數據來看（表6），0倍組雙歧桿菌的數量隨灌胃天數增加逐漸降低，小鼠經灌胃各濃度普通蛹蟲草21 d后，除10倍普通組雙歧桿菌量均降低外，富硒蛹蟲草組雙歧桿菌量增加，即10倍普通和10倍富硒組灌喂21 d后，雙歧桿菌數量增加。

乳酸桿菌分析，5倍富硒組和10倍富硒組P＞0.05，即該濃度灌喂21 d后小鼠乳酸桿菌數量無明顯變化。其他各組P＜0.05，差異顯著；同雙歧桿菌，0倍組乳酸桿菌數量逐漸降低，10倍普通組和10倍富硒組灌喂21 d后，乳酸桿菌數量比灌喂前增加，其余組菌量減少。

表7 小鼠腸道腸球菌和大腸桿菌的菌量變化（X±SD）1 g（CFU/g）中

2.4.2 致病菌數量變化

腸球菌分析，0倍組和5倍富硒組P＞0.05，即這兩組灌喂21 d后對于腸球菌數量無明顯影響，其他各組P＜0.01，差異都極其顯著。從菌落數據分析（表7），蛹蟲草濃度越高腸球菌數減少量越小。即1倍組腸球菌減少量最大，10倍組減少量最小，且10倍富硒組小鼠經灌胃21 d后腸球菌數量增加。

大腸桿菌分析，可能由于培養(yǎng)基配制不當，或培養(yǎng)環(huán)境不適宜，許多濃度組未長出菌落。10倍富硒組P＜0.05，有顯著差異，灌喂21 d后大腸桿菌數量減少，說明灌喂蛹蟲草對大腸桿菌數量有影響，隨著灌喂時間增加菌量減少，具體是哪一濃度影響最大需要再進行后續(xù)試驗。

2.5 高通量檢測

根據OTU分布韋恩圖（圖3A）、多樣性指數分析（圖3B）和群落結構組分圖（圖3C）可看出普通5倍組OTU數目比對照0倍組多，多樣性增加，且根據5種Alpha指數分析證明5倍組微生物種類增多。在相同灌喂21 d時，乳酸桿菌數量減少，與菌落計數結果相同：隨著蛹蟲草濃度增加，益生菌數量先減少后增加，即普通5倍組益生菌數量最小。

3 結論與討論

雌雄鼠體重除10倍富硒組外均增加，趨勢為蛹蟲草濃度越高，體重增加的量越小，且高濃度富硒可能影響小鼠生長。小鼠的日食量及日飲量整體變化不明顯。根據單因素方差分析，各臟器指數P＞0.05，無統(tǒng)計學意義，因此可知灌喂不同濃度蛹蟲草不會對臟器造成損傷。

圖3 高通量檢測

灌喂21 d后，10倍普通組和10倍富硒組小鼠腸道中益生菌雙歧桿菌和乳酸桿菌數量增加，其余組菌量減少，且致病菌腸球菌數量減少，其余組菌量增多。根據數據推測和大腸桿菌菌數也是灌喂高濃度蛹蟲草時減少較多（10倍組），同時結合高通量對5倍組和0倍組腸道內容物的檢測結果，證明灌胃蛹蟲草后腸道菌群多樣性增加。

通過以上數據分析，可證明蛹蟲草可以改善小鼠腸道菌群：增加雙歧桿菌和乳酸桿菌等益生菌的數量，減少腸球菌和大腸桿菌等致病菌數量；0倍組及10倍富硒組有最佳效果，可推測小鼠食用蛹蟲草適宜濃度是3.033 mg/g，且總體上普通蛹蟲草調節(jié)小鼠腸道菌群的效果要優(yōu)于富硒蛹蟲草。