周晨明 朱 艷 孟 麗 閆 靜 徐彥楠

河北醫(yī)科大學(xué) 1 電鏡實(shí)驗(yàn)中心 2 教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北省石家莊市 050017

電子顯微鏡技術(shù)廣泛應(yīng)用于科研和醫(yī)療中，在日常的工作過(guò)程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)學(xué)生送的標(biāo)本因取材或固定不當(dāng)而影響最終超微結(jié)構(gòu)的觀察。取材固定是電鏡樣品制備的第一步，也是最關(guān)鍵的一步，直接影響觀察結(jié)果。所以在此筆者對(duì)經(jīng)常出現(xiàn)的問(wèn)題進(jìn)行分析總結(jié)。

1 取材前的準(zhǔn)備工作

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 大量閱讀文獻(xiàn)，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程，合理安排取材時(shí)機(jī)[1]。戊二醛影響抗原性，若課題需要做免疫性的實(shí)驗(yàn)，就必須每組單獨(dú)準(zhǔn)備一只做電鏡的動(dòng)物。對(duì)于未進(jìn)行灌流固定的動(dòng)物最好先進(jìn)行電鏡標(biāo)本的取材，以免組織自溶，影響超微結(jié)構(gòu)的觀察。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要避免刺激以及環(huán)境的改變，盡量保持其生理狀態(tài)，增加實(shí)驗(yàn)的可比性和可靠性[2]。取材時(shí)，務(wù)必做到相同條件下取材，相同人員平行操作，分別平行取每一組相同序號(hào)的動(dòng)物[3]。一般每組動(dòng)物至少取3份標(biāo)本，避免個(gè)體差異，增加結(jié)論的可靠性。

1.2 固定液的選擇 固定的作用是在分子水平上使細(xì)胞保存生活狀態(tài)的超微結(jié)構(gòu)，減少細(xì)胞死后的變化。化學(xué)固定劑可以和蛋白質(zhì)結(jié)合形成交聯(lián)，將蛋白質(zhì)固定下來(lái)，也可以將糖、脂肪等物質(zhì)保存在生存時(shí)的狀態(tài)和位置，因此固定液的選擇極為重要。

取材后固定的操作由學(xué)生進(jìn)行，固定液的選擇至關(guān)重要。一般細(xì)胞固定液為2.5%的戊二醛，組織固定液為4%的戊二醛，灌流固定選用3%多聚甲醛1%戊二醛，固定液應(yīng)為清澈透明的液體，若見白色渾濁或絮狀物則固定液不合格，影響最后的固定效果。固定液的酸堿度可以引起組織pH值的變化，不僅可以從根本上改變蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，而且還會(huì)影響細(xì)胞質(zhì)的化學(xué)成分、膜的大分子排列及酶的生物活性，所以固定液的酸堿度必須與被固定的組織酸堿度基本一致[4]。大多數(shù)動(dòng)物組織酸堿度的平均值是7.4，所以固定液的pH值必須在7.2～7.4之間。

1.3 實(shí)驗(yàn)器械、標(biāo)本固定容器的準(zhǔn)備 固定組織的容器最好為青霉素小瓶，不宜使用Eppendorf 管，因?yàn)榍嗝顾匦∑康牡酌姹容^大，組織可以充分地與固定液進(jìn)行接觸，固定效果更好。對(duì)取材用器材及試劑，進(jìn)行清潔及預(yù)冷，寫好取材的標(biāo)簽。

2 取材

2.1 正常對(duì)照組的取材 正常對(duì)照組應(yīng)與模型組、治療組同時(shí)取材。在工作中經(jīng)常出現(xiàn)先用空白對(duì)照組進(jìn)行練手，以致其結(jié)構(gòu)變化，最終導(dǎo)致無(wú)法作為正常對(duì)照組。

2.2 組織標(biāo)本的取材原則 組織標(biāo)本的取材遵循快、小、輕、準(zhǔn)、冷五原則?？欤阂蠼M織在斷血1min內(nèi)浸入固定液。取材時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜破裂，組織自溶。在操作過(guò)程中必須目標(biāo)明確動(dòng)作迅速，若多部位取材，須多人配合。?。簺](méi)有方向的組織一般為取材尺寸為1mm×1mm×1mm，有方向的組織為1mm×1mm×3mm為宜，3mm為長(zhǎng)軸的方向。因?yàn)楣潭ㄒ旱拇┩改芰χ挥?.5mm，若樣品過(guò)大會(huì)使內(nèi)部固定不良；但也不能太小，樣品過(guò)小時(shí)觀察的目標(biāo)將受到局限。輕：取材刀片要鋒利，多選用雙面剃須刀片，操作應(yīng)始終貫徹動(dòng)作輕柔。只做直線切割，避免對(duì)組織的擠壓及拉鋸，以免引起的組織結(jié)構(gòu)的人工損傷性變化。準(zhǔn)：部位準(zhǔn)確可靠，根據(jù)研究目的要考慮到定位和定向的問(wèn)題。冷：低溫下操作，低溫下保存，低溫下送樣。為了降低水解酶的活性，盡量在低溫下操作，所用容器和器械應(yīng)預(yù)冷，取好的標(biāo)本放在4℃冰箱保存。送樣時(shí)最好放到冰盒里，但應(yīng)注意在小瓶與冰之間應(yīng)用紗布隔開，以免固定液結(jié)冰，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

2.3 取材具體操作 將動(dòng)物急性處死(或麻醉)，暴露出所需要的器官，用鋒利的解剖剪剪取一小塊組織，放在預(yù)先預(yù)冷的4%戊二醛固定液中。然后取出放在下面鋪有冰袋的蠟板上，滴1滴預(yù)冷的固定液，用雙面刀片將材料切成大約1mm寬，2～3mm長(zhǎng)的小條，剪刀剪過(guò)的部位盡量不保留，對(duì)于沒(méi)有定向要求的標(biāo)本再將其切成約的1mm3小塊。最后用牙簽將組織塊逐一放入固定液的小瓶中。放入4℃冰箱，固定2～4h。若不能及時(shí)往電鏡室送樣，每周更換固定液，放置最好不要超過(guò)2周。

2.4 特殊部位的取材 腦：因?qū)θ毖醣容^敏感，所以最好先進(jìn)行灌流固定，待組織硬化后進(jìn)行取材。視網(wǎng)膜：常規(guī)的取材方法易造成視網(wǎng)膜組織脫離、皺褶，不符合電鏡觀察的要求。應(yīng)該灌流固定后取整個(gè)眼球，將角膜剪開用注射器注入固定液，再將整個(gè)眼球放入固定液中固定。管狀組織：取1cm左右的一段，再將兩端上翻的組織用雙面刀片去除，再進(jìn)行固定。睪丸：因白膜下均為精曲小管，若取材太小則容易散開，所以取材應(yīng)大一點(diǎn)，待固定一段時(shí)間后再進(jìn)行修塊，去除白膜，取白膜下的部分再進(jìn)行固定。胰島：若觀察胰島，取材應(yīng)在胰腺的胰尾部。肺：因肺密度較小，固定時(shí)經(jīng)常漂在上面，可以用小紗布將其包裹，再放入固定液中即可下沉。腎：若觀察腎小球，應(yīng)選擇腎皮質(zhì)部位進(jìn)行取材。

2.5 培養(yǎng)細(xì)胞的取材固定 收集細(xì)胞的數(shù)量因細(xì)胞體積的大小而定，一般(2～5)×106即可。收集懸浮細(xì)胞時(shí)，將含有細(xì)胞的培養(yǎng)液倒入離心管，進(jìn)行離心。貼壁細(xì)胞先將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿上輕輕地刮下來(lái)或者用胰酶消化下來(lái)，收集到離心管中離心。如果觀察細(xì)胞凋亡，則應(yīng)注意凋亡細(xì)胞或凋亡小體主要漂浮在培養(yǎng)液中，在收集樣品過(guò)程中不能將培養(yǎng)液全部棄掉，應(yīng)該將刮下的細(xì)胞和培養(yǎng)液中的細(xì)胞一同離心固定[5]。若僅保留貼壁細(xì)胞，將很難找到理想的凋亡細(xì)胞。

為了獲得更理想的超微結(jié)構(gòu)，可在離心前加入等量的2.5%的戊二醛，再進(jìn)行離心。不同細(xì)胞離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間不同，應(yīng)查閱文獻(xiàn)進(jìn)行確定。棄上清后沿管壁緩慢加入固定液，在4℃冰箱內(nèi)靜置固定1～2h，然后送樣。若固定后，在送樣時(shí)又散開，且再次離心不易成團(tuán)，可以棄固定液，加入小滴10%牛血清白蛋白，再離心成團(tuán)，再棄上清加固定液送樣。

3 討論

在多年電鏡工作中發(fā)現(xiàn)，學(xué)生在做電鏡實(shí)驗(yàn)中準(zhǔn)備不充分，沒(méi)有閱讀文獻(xiàn)，對(duì)自己實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟幻鞔_，前期實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不合理、取材操作不規(guī)范，導(dǎo)致后續(xù)工作都是徒勞。所以，作為電鏡工作人員要做好前期的教學(xué)、幫助學(xué)生進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、指導(dǎo)取材等工作。身為學(xué)生，在電鏡實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，務(wù)必做到虛心學(xué)習(xí)、多查、多問(wèn)、多思考、多練習(xí)，以使實(shí)驗(yàn)順利完成。