王立斌，王丹妮，馬榮，張旭，田進(jìn)海，李曉菡，馮惠敏，馬芳

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 生物芯片工程研究中心，寧夏 銀川 750004，2.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004）

MicroRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性非編碼RNA，與mRNA 的3’-UTR 結(jié)合，調(diào)控mRNA 的表達(dá)，影響細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及表觀遺傳等環(huán)節(jié)，參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展[1]。miR-18a 是一個(gè)新的腫瘤相關(guān)miRNA。有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-18a 能通過調(diào)控多種靶基因影響腫瘤細(xì)胞的功能[2-4]。miR-18a 在形成過程中存在2 種形式，即miR-18a-3P 和miR-18a-5P，目前已有關(guān)于miR-18a-5P 在腫瘤發(fā)生中作用的研究報(bào)道，而miR-18a-3P 與腫瘤的關(guān)系很少報(bào)道[5]。本研究通過建立miR-18a-3P 慢病毒載體，鑒定其在人乳腺腫瘤細(xì)胞系MDA-MB-231 中的表達(dá)，為研究miR-18a-3P 對(duì)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的影響及探究機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑、儀器

人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，大腸桿菌菌株DH5α、慢病毒載體GV369 和GV280 及Polybrene 購自上海吉?jiǎng)P基因有限公司，DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）購自美國Gibco 公司；PrimeScript?RT reagent Kit、SYBR?Premix Ex Taq ? Ⅱ及Premix Ex Taq?Version2.0 等購自日本TaKaRa 公司，Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司，1 kP DNA Ladder Marker購自美國Fermentas 公司，限制性內(nèi)切酶Age Ⅰ、Nhe Ⅰ及EcoR Ⅰ購自美國NEB 公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購自德國Qiagen 公司，U6、miR-18a-3P 引物合成及質(zhì)粒測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo 公司，超凈工作臺(tái)購自新加坡藝思高科技有限公司，臺(tái)式細(xì)胞離心機(jī)購自德國Eppendorf 公司，倒置熒光顯微鏡購自德國LEICA 公司；Light Cycler480 Ⅱ型qRT-PCR 儀購自美國Roche 公司。以不轉(zhuǎn)染病毒載體作為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染病毒空載體作為陰性對(duì)照組，將轉(zhuǎn)染的miR-18a-3P 作為miR-18a-3P 轉(zhuǎn)染組。

1.2 miR-18a-3P 干擾與過表達(dá)慢病毒載體的 構(gòu)建

1.2.1 引物合成及目的基因片段獲取 為構(gòu)建miR-18a-3P 過表達(dá)慢病毒載體，首先通過miRbase 數(shù)據(jù)庫查找miR-18a-3P 成熟引物序列，依據(jù)序列組成設(shè)計(jì)合成引物，其中包含交換配對(duì)堿基、酶切位點(diǎn)及用于PCR 擴(kuò)增microRNA 的5'端部分序列。所采用的過表達(dá)載體為上海吉?jiǎng)P公司的慢病毒載體GV369，元件順序?yàn)閁bi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin。構(gòu)建miR-18a-3P 干擾表達(dá)慢病毒載體為GV280，載體的元件順序?yàn)閔U6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRESpuromycin。經(jīng)查詢和確認(rèn)，所設(shè)計(jì)反向互補(bǔ)序列分別合成2 段寡聚核苷酸，其上游為5'-，其下游把合成的引物用ddH2O 在90℃水浴中溶解稀釋，室溫自然冷卻。抽提人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的基因組DNA，并以此為模板用上述引物，PCR 擴(kuò)增miR-18a-3P，分別以限制性內(nèi)切酶Age Ⅰ/Nhe Ⅰ和Age Ⅰ/EcoR Ⅰ酶切收集目的基因片段。

1.2.2 載體的構(gòu)建與鑒定 分別用限制性內(nèi)切酶Age Ⅰ/和Nhe Ⅰ在37℃條件下酶切載體GV369，在37℃條件下，用限制性內(nèi)切酶Age Ⅰ/和EcoR Ⅰ酶切載體GV280，3 h 后獲得酶切后的線性載體。然后將1.2.1 中獲得的目的基因片段移入線性表達(dá)載體，以1 ∶2 的摩爾比將線性載體DNA 和純化的PCR 產(chǎn)物混合，16℃條件下孵育6 h，使其充分反應(yīng)。將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，在含有Amp 的LB 固體培養(yǎng)基平板上均勻涂布，37℃過夜孵育，挑取陽性的單克隆菌落，用PCR 進(jìn)行菌落鑒定，并取菌液測(cè)序，選擇PCR 鑒定陽性的克隆與測(cè)序結(jié)果，并進(jìn)行對(duì)比 分析。

1.2.3 慢病毒包裝與濃縮 采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的方法進(jìn)行病毒包裝，用質(zhì)粒抽提試劑盒分別提取GV 載體質(zhì)粒、pHelper1.0 載體質(zhì)粒和pHelper 2.0載體質(zhì)粒DNA，將提取的質(zhì)粒DNA 溶于無菌TE 中，測(cè)定其濃度及純度，確認(rèn)質(zhì)粒DNA 的純度（A260/A280）在1.8～2.1。消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T 細(xì)胞，接種于10 cm3細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)60%～70%時(shí)，更換為無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后，緩慢滴加含GV 載體質(zhì)粒20μg、pHelper 1.0載體質(zhì)粒15μg、pHelper 2.0 載體質(zhì)粒10μg 及一定體積轉(zhuǎn)染試劑的混合液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h 后，棄去轉(zhuǎn)染混和液后用PBS 液清洗1 遍，加入10%血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于48 和72 h 收集培養(yǎng)細(xì)胞上清液，4℃、12 000 r/min 離心10 min，除去細(xì)胞碎片；0.45μm 過濾后，4℃、25 000 r/min 離心2 h，棄上清，加病毒保存液，分裝，-80℃保存。

1.2.4 病毒滴度測(cè)定 取3 個(gè)無菌Ep 管，依次編號(hào)1、2、3，每管均加入無血清培養(yǎng)基90μl，在1 號(hào)管內(nèi)加入10μl 待測(cè)原液病毒，吹打混勻后取10μl 加入到2號(hào)管中；2 號(hào)管再吹打混勻后取10μl 加入到3 號(hào)管。1 號(hào)管內(nèi)加入10μl 病毒原液，計(jì)為1E+1μl；2 號(hào)管中進(jìn)行第1 次10 倍稀釋，所得病毒原液為1 號(hào)管中的1/10，計(jì)為1E+0μl；3 號(hào)管中進(jìn)行第2 次10 倍稀釋，計(jì)為1E-1μl。將293T 細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種于96 孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞融合度達(dá)60%時(shí)，棄培養(yǎng)基，加入90μl 上述稀釋好的病毒，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再添加完全培養(yǎng)基100μl，48 h 后熒光顯微鏡下觀察熒光亮度并拍照。根據(jù)綠色熒光蛋白的表達(dá)量計(jì)算病毒滴度，病毒滴度=熒光細(xì)胞數(shù)/原液病毒數(shù)。

1.3 感染復(fù)數(shù)

MDA-MB-231 細(xì)胞按1×104個(gè)/孔接種至96 孔板中，共接種8孔。將慢病毒稀釋后分別加入其中4孔，使其感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection,MOI）值分別為0、5、10 及20；另外4 孔在加入相應(yīng)濃度病毒的同時(shí)，還添加1μg/ml Polybrene。轉(zhuǎn)染12 h 后，將上層培養(yǎng)基吸除，添加新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察并拍照。通過對(duì)細(xì)胞感染效果的評(píng)估，明確MDA-MB-231 細(xì)胞的感染條件并計(jì)算MOI。

1.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選

MDA-MB-231 細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞密度達(dá)50%時(shí)病毒轉(zhuǎn)染。先將6 孔板中細(xì)胞上清液吸除，每孔中加入1 ml 無血清培養(yǎng)基配制的轉(zhuǎn)染液，培養(yǎng)24 h，待病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后吸除轉(zhuǎn)染液，加入含1μg/m1 嘌呤霉素培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，隔天更換1 次培養(yǎng)基，3 或4 d 后即可獲得能穩(wěn)定傳代的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)后，分別凍存同一批次的各組細(xì)胞5 支備用。

1.5 miR-18a-3P 在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中的表達(dá)

取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231 細(xì)胞，按照miR Neasy Mini Kit 試劑說明書提取細(xì)胞總RNA。使用microRNA cDNA Synthesis Kit 試劑盒將各細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系內(nèi)共加入200 ng 總RNA，置于-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。取cDNA 行qRT-PCR：94℃預(yù)變性2 min，92℃變性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30 個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸7 min。用2-△△CT法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。見表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 和GraphPad Prism6 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 qRT-PCR 的引物序列

2 結(jié)果

2.1 miR-18a-3P 慢病毒載體的構(gòu)建及測(cè)序結(jié)果

將miR-18a-3P 過表達(dá)及干擾慢病毒載體GV369和GV280（見圖1A、B）。將篩選出來的陽性重組克隆菌落挑于液體LB 培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序分析，并與miR-18a-3P 反向互補(bǔ)序列比對(duì)，結(jié)果完全匹配，未見堿基缺失或突變等異常（見 圖1C、D）。

2.2 慢病毒滴度測(cè)定

構(gòu)建好的miR-18a-3P 過表達(dá)慢病毒滴度為2×109TU/ml，miR-18a-3P 干擾慢病毒滴度為1× 109TU/ml。見圖2、3。

圖1 GV369 和GV280 載體結(jié)構(gòu)及測(cè)序

圖2 過表達(dá)慢病毒熒光法滴度測(cè)定 （×100）

圖3 干擾表達(dá)慢病毒熒光法滴度測(cè)定 （×100）

2.3 穩(wěn)定過表達(dá)和干擾的MDA-MB-231 細(xì)胞系建立及載體MOI 值測(cè)定

miR-18a-3P 過表達(dá)及干擾慢病毒載體感染MDA-MB-231 細(xì)胞48 h 后，當(dāng)MOI 值為10 TU/ml，Polybrene 濃度為1μg/ml 時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，且效 率＞80%，篩選后得到滿意的目的細(xì)胞。見圖4～7。

圖4 MDA-MB-231 細(xì)胞未加Polybrene 時(shí)miR-18a-3P 過表達(dá)載體感染 （光鏡×100）

圖5 MDA-MB-231 細(xì)胞加Polybrene 后miR-18a-3P 過表達(dá)載體感染 （光鏡×100）

圖6 MDA-MB-231 細(xì)胞未加Polybrene 時(shí)miR-18a-3P 干擾載體感染 （光鏡×100）

圖7 MDA-MB-231 細(xì)胞加Polybrene 后miR-18a-3P 干擾載體感染 （光鏡×100）

2.4 各組miR-18a-3P 相對(duì)表達(dá)量比較

miR-18a-3P 過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，各組miR-18a-3P 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miR-18a-3P 轉(zhuǎn)染組較其他兩組高（P＜0.05）。miR-18a-3P 干擾表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，各組miR-18a-3P 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miR-18a-3P 轉(zhuǎn)染組較其他兩組低（P＜0.05）。見表2和圖8、9。

表2 各組miR-18a-3P 相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表2 各組miR-18a-3P 相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

注：?與miR-18a-3P 轉(zhuǎn)染組比較，P ＜0.05。

miR-18a-3P 干擾 慢病毒空白對(duì)照組 1.000±0.000? 1.000±0.000?陰性對(duì)照組 1.175±0.035? 0.835±0.077?miR-18a-3P 轉(zhuǎn)染組 2.065±0.049 0.125±0.021 F 值 528.905 199.531 P 值 0.000 0.001組別 miR-18a-3P 過表達(dá)慢病毒

圖8 各組過表達(dá)miR-18a-3P 慢病毒載體轉(zhuǎn)染MDAMB-231 細(xì)胞后miR-18a-3P 的相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

圖9 各組干擾表達(dá)miR-18a-3P 慢病毒載體轉(zhuǎn)染MDAMB-231 細(xì)胞后miR-18a-3P 的相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

3 討論

miRNA 是存在于多種真核細(xì)胞生物中的一類單鏈非編碼RNA 分子，多數(shù)miRNA 由大約70 個(gè)堿基組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA 前體經(jīng)過Dicer 酶酶切加工形成。miRNA 前體在酶切過程中可以產(chǎn)生2 條有功能的成熟miRNA，以miRNA-5p 和miRNA-3p 命名[6]。miRNA通過與其靶基因配對(duì)，誘導(dǎo)靶基因mRNA降解，抑制mRNA 的翻譯。這種調(diào)控是多向發(fā)生的，一個(gè)miRNA 可以調(diào)控多個(gè)mRNA 的表達(dá)，多個(gè)miRNA 也可以分別與同一個(gè)mRNA 序列結(jié)合[7-8]。由于存在調(diào)控方式和結(jié)合位點(diǎn)的多樣性，miRNA 在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及表觀遺傳等環(huán)節(jié)調(diào)控基因組表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等過程[9]。

miR-18a 屬于miR-17-92 基因簇，通常與抑癌基因GUGC 序列結(jié)合發(fā)揮作用[10]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)miR-18a與多種疾病相關(guān)，RAO 等[11]證實(shí)四氫大麻酚通過調(diào)節(jié)miR-17-92 簇和誘導(dǎo)T 細(xì)胞，減輕葡萄球菌腸毒素B 刺激的小鼠炎性肺損傷，并防止死亡。MAO 等[12]證實(shí)在2 型糖尿病引起的腦損傷患者血清中，S100 蛋白和內(nèi)皮素-1 等生化指標(biāo)的升高與miRNA-18a 表達(dá)下調(diào)有關(guān)。YAU 等[13]發(fā)現(xiàn)miR-18a 的表達(dá)與非侵襲性結(jié)直腸腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，認(rèn)為miRNA-18a 可以成為診斷結(jié)直腸癌的一個(gè)潛在生物標(biāo)志物。在乳腺腫瘤研究中，F(xiàn)AN[14]、KRUTILINA 等[15]和QI 等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-18a 可通過干擾缺氧誘導(dǎo)因子1α 亞基和調(diào)控mTOR 信號(hào)通路的表達(dá)，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞凋亡及自噬的比率。

2 種對(duì)miR-18a 存在形式的研究中，目前只有關(guān)于miR-18a-5p 與腫瘤關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道，LIANG 等[5]發(fā)現(xiàn)miR-18a-5p 在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，并通過抑制干擾素調(diào)節(jié)因子-2 的表達(dá)，抑制非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞自噬，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。LU 等[17]證實(shí)miR-18a-5p 通過抑制IRF2 的表達(dá)，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移?，斠琅瑺枴み_(dá)吾提等[18]發(fā)現(xiàn)miR-18a-5p 通過調(diào)控其靶基因的表達(dá)，抑制SW480細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。而目前關(guān)于miR-18a-3P 與腫瘤關(guān)系的報(bào)道較少。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是目前在細(xì)胞中獲得穩(wěn)定表達(dá)載體的2 種主要方式。其中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的結(jié)果定量更加容易和快速，但該法觀察時(shí)間短，無法獲得穩(wěn)定傳氏細(xì)胞。一般用于獲得外源基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方式常用慢病毒載體，慢病毒載體包含病毒包裝、轉(zhuǎn)染和整合所需的所有遺傳信息，其通過感染細(xì)胞，并隨著宿主細(xì)胞的分裂而擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的表達(dá)。與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相比，慢病毒轉(zhuǎn)染效果更穩(wěn)定，結(jié)果定量更準(zhǔn)確[19]。

本研究首先構(gòu)建了miR-18a-3P 過表達(dá)慢病毒載體GV369 和miR-18a-3P 干擾慢病毒載體GV280，并對(duì)所構(gòu)建的載體進(jìn)行滴度測(cè)定。將構(gòu)建成功的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231 中，qRTPCR 檢測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)染載體后MDA-MB-231 細(xì)胞株中miR-18a-3P 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)慢病毒載體能顯著改變MDAMB-231 細(xì)胞內(nèi)miR-18a-3P 的表達(dá)。本研究成功構(gòu)建了miR-18a-3P 慢病毒過表達(dá)載體GV369 和干擾載體GV280，并能在乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231 內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，為后續(xù)開展miR-18a-3P 對(duì)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程的研究及其分子機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。