黎程鳳，秦磊磊 ，楊年華 ，李素媛 ，王應(yīng)喜 ，胡飛飛，鄧張雙，，*

(1.三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002；2.三峽公共檢驗檢測中心，國家磷產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，湖北 宜昌443002；3.湖北土老憨調(diào)味食品股份有限公司，湖北 宜都 443302)

柑橘醋是以宜昌市出產(chǎn)的新鮮、成熟的柑橘類水果為原料，經(jīng)多重工藝發(fā)酵而得，具有柑橘的獨特風(fēng)味和天然色澤[1]。柑橘果醋相比糧食釀制的食醋營養(yǎng)更豐富，維生素及生物活性物質(zhì)更多，具有很好的抗氧化能力[2]，產(chǎn)品附加值高，商業(yè)價值高，同時對促進(jìn)我國柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也具有積極意義。

柑橘作為柑橘醋的發(fā)酵原料，其大部分的營養(yǎng)成分也將在柑橘醋中保留，研究顯示柑橘類水果多富含黃酮類化合物[3]，具有增強人體免疫能力、抑菌消炎、預(yù)防糖尿病以及心血管疾病等功效[4]。黃酮類化合物指的是兩個具有酚羥基的苯環(huán)同中間三碳相互連接而成的一系列化合物[5]，大多數(shù)具有2-苯基色原酮(C6-C3-C6)的基本骨架，目前在柑橘中已鑒定出來約60多種黃酮類化合物，主要歸屬于黃烷酮、黃酮、黃酮醇和花青苷四大類[6]。柑橘果實中還存在一系列多甲氧基黃酮(PMFs)，該系列化合物在黃酮骨架上含有4個以上甲氧基基團(tuán)，其中橘皮素、川陳皮素、5-去甲基川陳皮素等多甲氧基黃酮是柑橘屬植物表皮的特有成分[7]，柑橘類果實中由于黃酮以及多甲氧黃酮含量分布的差異，果實營養(yǎng)成分以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也存在一定的差異[8]。

本實驗中將對柑橘醋中指標(biāo)性黃酮類化合物進(jìn)行分離和鑒定，同時對柑橘醋中指標(biāo)性化合物含量及總黃酮含量進(jìn)行檢測，分析黃酮類化合物含量與總黃酮含量的關(guān)系，更好地了解柑橘醋的特性，對醋的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控，提高產(chǎn)品的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

柑橘醋原漿(成品)：由湖北省宜昌市湖北土老憨生態(tài)農(nóng)業(yè)集團(tuán)出品。

1.1.2 材料與試劑

乙酸乙酯(分析純)：天津市恒興化學(xué)試劑有限公司；甲醇(分析純)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇(分析純)：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜純)：美國Tediatedia公司；水：華潤怡寶飲料(中國)有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號161219)：北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；亞硝酸鈉(分析級)、硝酸鋁(分析級)：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；氫氧化鈉(分析級)：天津市博迪化工有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(實驗室自制)：現(xiàn)存于湖北省宜昌市三峽大學(xué)天然產(chǎn)物重點實驗室；濃度1 mol/L H+福林-酚顯色劑(分析純)：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；碳酸鈉(分析純)：西隴化工股份有限公司；蒸餾水。

1.1.3 儀器與設(shè)備

FA2204B萬分之一電子分析天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本EYELA儀器公司；1525EF 高效液相色譜儀 美國Waters公司；Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀 美國DIONEX公司；Bruker-ARX-400核磁共振波譜儀；微孔濾膜(有機(jī)相，0.22 μm)；25 μL微量進(jìn)樣針 上海高鴿工貿(mào)有限公司；分析型色譜柱(YMC-Pack ODS-A C18，100 ?，4.6 mm×250 mm×5 μm)；制備型色譜柱(YMC-Pack ODS-A C18，100 ?，10 mm×250 mm×5 μm)；柱層析硅膠(200～300目)；D-101大孔吸附樹脂；薄層層析硅膠板(200 mm×200 mm) 青島海洋化工廠；10 mL容量瓶、100 mL容量瓶、移液管、天波量筒；石英比色皿；UV-3010型紫外可見分光光度計 日本Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1 黃酮類化合物分離鑒定

對于柑橘醋中黃酮類化合物的分離提取方法有很多，包括溶劑萃取法、超聲波輔助醇提法、微波輔助醇提法、二氧化碳超臨界流體萃取法等[9-12]，由于本實驗樣品為液態(tài)，因此采用有機(jī)溶劑乙酸乙酯對柑橘醋樣品進(jìn)行萃取。

取4 L柑橘醋樣品，采用10 L乙酸乙酯溶劑對樣品反復(fù)萃取、靜置、濃縮，得到乙酸乙酯部分浸膏10.4 g。將乙酸乙酯浸膏通過D-101大孔吸附樹脂層析柱(流動相：乙醇和水)粗分離，經(jīng)10%、30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度沖洗，按濃度梯度旋蒸濃縮，得到Fr.1～Fr.6號粗浸膏，分別取適量樣品用60%甲醇溶解，微孔濾膜過濾后各取10 μL通過高效液相色譜儀進(jìn)行分析(流動相：甲醇/水10%～100%，紫外吸收波長：220 nm，運行時間：30 min)，選取其中化合物含量較多的Fr.2號和Fr.3號片段進(jìn)行正向硅膠柱二次分離(流動相：甲醇/二氯甲烷)，梯度沖洗得到Fr.2-1～Fr.2-15以及Fr.3-1～Fr.3-14共29個片段，選取Fr.2中Fr.2-12號，F(xiàn)r.3中Fr.3-3號通過高效液相色譜儀進(jìn)行制備，得到化合物2-12-1、3-3-2、3-3-3，核磁共振鑒定3個化合物結(jié)構(gòu)，經(jīng)與文獻(xiàn)對比分析可知3種化合物分別為：柚皮苷[13]、柚皮素[14]、橙皮素[15]。

將柑橘醋乙酸乙酯萃取物通過高效液相色譜儀進(jìn)行分析(流動相：甲醇/水10%～100%梯度沖洗，紫外吸收波長：220 nm，運行時間：60 min)，分析結(jié)果見圖1。在同一樣品中，柚皮苷、柚皮素、橙皮素這3個化合物分離度好，基線分離效果好，保留時間同標(biāo)準(zhǔn)品對比差異小，樣品峰純度高，證明上述液相分析條件可用于柑橘醋中黃酮類化合物柚皮苷、柚皮素、橙皮素含量的測定，3個化合物各自保留時間分別為28.07，36.54，37.44 min。

圖1 柑橘醋半成品乙酸乙酯浸膏高效液相分析色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram analysis of semi-finished ethyl acetate extract of citrus vinegar

1.2.2 黃酮類化合物含量測定

1.2.2.1 柚皮苷含量檢測方法

a.標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的配制

將分離出的2.6 mg柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品用60%色譜甲醇溶液稀釋定容至1 mL容量瓶中，得到柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品母液濃度為2.6 mg/mL。

取柑橘醋原漿溶液25 mL，用100 mL乙酸乙酯進(jìn)行萃取，劇烈振搖3 min后，靜置1 min，取乙酸乙酯部分，干燥濃縮得到浸膏，用60%甲醇溶液稀釋定容至10 mL容量瓶中，得到樣品溶液。

b.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

用移液槍從柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品母液中精確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液25，50，100，150，200 μL，分別置于1 mL容量瓶中用60%甲醇溶液定容，得到0.065，0.13，0.26，0.39，0.52 mg/mL 5個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取10 μL樣品進(jìn)入高效液相經(jīng)分析柱按上述分析條件進(jìn)行分析，標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為28.0 min。每份標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣2次，其峰面積平均值為縱坐標(biāo)(Y軸)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X軸)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.0035x-0.0052；R2=0.9991。

c.樣品含量測定

取10 μL樣品溶液進(jìn)入高效液相分析，分析條件同上，保留時間28 min左右的色譜峰即為柚皮苷樣品峰。將測量峰面積帶入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，測得濃度，經(jīng)計算得樣品柚皮苷含量。

d.計算

樣品柚皮苷含量計算公式：

1.2.2.2 柚皮素含量檢測方法

a.標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的配制

將分離出的12.5 mg柚皮素標(biāo)準(zhǔn)品用色譜甲醇溶液稀釋定容至10 mL容量瓶中，得到柚皮素標(biāo)準(zhǔn)品母液濃度為1.25 mg/mL。

樣品溶液的配制方法同上。

b.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

用移液槍從母液中精確吸取100，250，500，1000 μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用100%甲醇溶液定容，得到0.0125，0.03125，0.0625，0.125，0.1875 mg/mL 5個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取10 μL樣品進(jìn)入高效液相經(jīng)分析柱按上述分析條件進(jìn)行分析，標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為36.0 min。每份標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣2次，其峰面積平均值為縱坐標(biāo)(Y軸)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X軸)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.0023x+0.001；R2=0.9999。

c.樣品含量測定

樣品溶液按上述條件分析，保留時間36 min左右的色譜峰即為柚皮素樣品峰。將測量峰面積帶入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，測得濃度，經(jīng)計算得樣品柚皮素含量。

d.計算

樣品柚皮素含量計算公式：

1.2.2.3 橙皮素含量檢測方法

a.標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的配制

將分離出的橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品5.7 mg用色譜甲醇溶液將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋定容至10 mL容量瓶中，得到橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品母液濃度為0.57 mg/mL。

樣品溶液的配制方法同上。

b.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

用移液槍從母液中精確吸取250，500，1000 μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.5，2 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用100%甲醇溶液定容，得到0.01425，0.0285，0.057，0.0855，0.114 mg/mL 5個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取10 μL樣品進(jìn)入高效液相經(jīng)分析柱按上述分析條件進(jìn)行分析，標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為36.0 min。每份標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣2次，其峰面積平均值為縱坐標(biāo)(Y軸)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X軸)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.0027x+0.0024；R2=0.9992。

c.樣品含量測定

樣品溶液按上述條件分析，保留時間37 min左右的色譜峰即為橙皮素樣品峰。將測量峰面積帶入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，測得濃度，經(jīng)計算得樣品橙皮素含量。

d.計算

樣品橙皮素含量計算公式：

1.2.3 總黃酮含量測定方法

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物柚皮苷，為黃色粉末(CH3OH)，化合物分子式為C27H32O14。13C NMR (100 MHz,DMSO-d6) δ:198.2(C-4),163.9(C-7),166.0(C-2),163.7(C-4′),163.6(C-5),158.8(C-9),129.526(C-2′), 129.4(C-6′),116.2(C-1′),116.2(C-3′,5′),106.2(C-10),104.3(C-3),101.6(C-1?),100.3(C-6),100.3(C-1″),96.4(C-8),79.6(C-3?),79.5(C-2″),77.2(C-3″),76.5(C-5″),73.9(C-5?),73.0(C-4?),71.7(C-2?),71.2(C-4″),66.9(C-6″),18.8(C-6?)。

化合物柚皮素，為黃色粉末(CH3OH) ，化合物分子式為C15H12O5。13C NMR (DMSO-d6,100 MHz) δ:196.6(C-4),167.8(C-7),163.9(C-5),163.4(C-9),158.2(C-4′),129.4(C-1′),128.8(C-2′,6′), 115.6(C-3′,5′), 102.0(C-10),96.4(C-6),95.6(C-8),78.8(C-2),42.5(C-3)。

化合物橙皮素，為黃色粉末(CH3OH) ，化合物分子式為C16H14O6。13C NMR (DMSO-d6,100 MHz)δ:196.6(C-4),167.3(C-7),163.9(C-5),163.3(C-9),148.4(C-4′),146.9(C-3′),131.6(C-1′),118.1(C-6′),114.5(C-2′),112.4(C-5′),102.2(C-10),96.3(C-6),95.5(C-8),78.7(C-2),56.1(4′-OCH3),42.6(C-3)。

2.2 黃酮類化合物含量

2.2.1 樣品柚皮苷含量

取9個批次樣品溶液各3份進(jìn)入高效液相按上述檢測條件分析，將3次樣品測得峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 y=0.0035x-0.0052，測得濃度，帶入公式進(jìn)行換算，取其平均值即為樣品柚皮苷含量，見表1。

表1 9個不同批次柑橘醋樣品柚皮苷含量Table 1 Content of naringin in 9 different batches of citrus vinegar

測得9個批次柑橘醋樣品柚皮苷含量最高為134.1 mg/L，最低為57.7 mg/L，9個批次樣品相對標(biāo)準(zhǔn)偏差平均值為0.22%，該檢測方法準(zhǔn)確性與重復(fù)性高。

2.2.2 樣品柚皮素含量

取9個批次樣品溶液各3份進(jìn)入高效液相按上述檢測條件分析，將3次樣品測得峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0023x+0.001，測得濃度，帶入公式進(jìn)行換算，取其平均值即為樣品柚皮素含量，見表2。

表2 9個不同批次柑橘醋樣品柚皮素含量Table 2 Content of naringenin in 9 different batches of citrus vinegar

測得9個批次柑橘醋樣品柚皮素含量最高為28.3 mg/L，最低為9.9 mg/L，9個批次樣品相對標(biāo)準(zhǔn)偏差平均值為0.88%，該檢測方法準(zhǔn)確性與重復(fù)性高。

2.2.3 樣品橙皮素含量

取9個批次樣品溶液各3份進(jìn)入高效液相按上述檢測條件分析，將3次樣品測得峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0027x+0.0024測得濃度，帶入公式進(jìn)行換算，取其平均值即為樣品橙皮素含量，見表3。

表3 9個不同批次柑橘醋樣品橙皮素含量Table 3 Content of hesperitin in 9 different batches of citrus vinegar

測得9個批次柑橘醋樣品橙皮素含量最高為20.7 mg/L，最低為6.1 mg/L，9個批次樣品相對標(biāo)準(zhǔn)偏差平均值為0.99%，該檢測方法準(zhǔn)確性與重復(fù)性高。

2.3 總黃酮含量

取9個批次柑橘醋(成品)按上述方法檢測，將5次測得樣品吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=16.858x-0.2014，測得濃度，帶入公式進(jìn)行換算，取其平均值即為樣品總黃酮含量，見表4。

表4 9個批次柑橘醋(成品)總黃酮含量Table 4 Total flavonoids content of 9 batches of citrus vinegar (finished product)

測得9個批次柑橘醋樣品總黃酮含量最高為640.9 mg/L，最低為449.1 mg/L，9個批次樣品相對標(biāo)準(zhǔn)偏差平均值為1.85%，該檢測方法準(zhǔn)確性與重復(fù)性高。

3 結(jié)論

本實驗采用大孔吸附樹脂、正相硅膠色譜以及制備型HPLC等分離方法，從柑橘醋乙酸乙酯萃取物中分離鑒定出柑橘醋中指標(biāo)性化合物柚皮苷、柚皮素、橙皮素，證明這3種化合物的含量及比例分配可以有效地反映出柑橘醋發(fā)酵質(zhì)量。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法對柑橘醋成品中總黃酮含量進(jìn)行測定。通過對9個批次柑橘醋成品總黃酮含量進(jìn)行測定測得：9個批次柑橘醋樣品總黃酮含量為449.1～640.9 mg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差平均值為1.85%，證明該檢測方法重復(fù)性高，加標(biāo)回收率測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.96%，<2%，證明該方法具有良好的準(zhǔn)確性，適用于柑橘醋中總黃酮含量的測定。

對9個批次樣品中柚皮苷、柚皮素、橙皮素含量及總黃酮含量進(jìn)行分析。其中4號和8號兩個批次總黃酮含量較其他批次高，其柚皮素與橙皮素含量與其他批次相比較低，柚皮苷含量較高；2號和9號兩個批次樣品總黃酮含量較其他批次低，其柚皮素與橙皮素含量與其他批次相比較高，柚皮苷含量偏低。證明樣品總黃酮含量的高低與樣品中柚皮苷、柚皮素、橙皮素的含量及比例分配存在一定關(guān)系，總黃酮含量的高低與柚皮苷含量呈正比例關(guān)系，與柚皮素、橙皮素的含量呈反比例關(guān)系。但其中3號批次樣品實驗結(jié)果不符合上述結(jié)論，其總黃酮含量低于其他批次樣品，但其柚皮苷高于部分批次樣品，柚皮素與橙皮素含量也較低。對于這一反常情況，我們通過文獻(xiàn)調(diào)研了解到，柚皮素和橙皮素兩種化合物均難溶于水，根據(jù)實驗研究顯示，在柑橘醋發(fā)酵的過程中能溶于水的柚皮苷會轉(zhuǎn)化為難溶于水的柚皮素、橙皮素產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致柑橘醋成品中柚皮素與橙皮素含量低。因此，柑橘醋中黃酮類化合物的含量與總黃酮含量的關(guān)系還需要多項實驗結(jié)果綜合分析，并對更多批次樣品檢測結(jié)果統(tǒng)計分析進(jìn)行確定。

在后期實驗中還需要對柑橘醋發(fā)酵過程中的沉淀物進(jìn)行分析，了解柑橘醋發(fā)酵過程中化合物的變化。同時對大量批次的柑橘醋樣品進(jìn)行上述實驗分析，得到統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)以驗證目前所得的結(jié)論，對于分析柑橘醋中黃酮類化合物的含量與總黃酮含量的關(guān)系以及在工業(yè)上對柑橘醋質(zhì)量分析進(jìn)行進(jìn)一步的研究。