吳桂蘋，谷風林*，朱科學，李云瑩,2，李昌應,2，房一明

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所，海南 萬寧 571533；2.云南農(nóng)業(yè)大學，昆明 650201)

草果(Amomumtsao-koCrevost et Lemarie)為姜科、豆蔻屬多年生常綠草本植物，是亞熱帶山區(qū)常綠闊葉林下生長的一種重要經(jīng)濟作物，主要分布在我國云南、廣西和貴州三省部分地區(qū)，以及越南、老撾北部的部分地區(qū)。其中，云南省草果種植面積和產(chǎn)量均占全國的90%以上，至今已有300多年的栽培歷史，種植總面積達11.98×104hm2，其中怒江州草果的種植面積達5.44×104hm2，草果已發(fā)展成怒江州的特色經(jīng)濟作物之一[1]。草果藥食同源，不僅是烹飪佐料的上品，而且在中藥中有廣泛的用途，干果可作為中藥材，燥濕溫中，治療脘腹脹痛，痞滿嘔吐，瘧疾寒熱，瘟疫發(fā)熱之疾[2]。隨著香辛調(diào)味料的深入研究和加工新技術的運用，調(diào)味料產(chǎn)品形態(tài)更豐富[3]、風味更穩(wěn)定[4]、用途更廣泛[5]，但有關草果的研究報道相對較少。國內(nèi)外有部分學者研究報道了草果中揮發(fā)油的化學成分[6，7]，已初步確定了草果中的揮發(fā)性成分主要是萜烯類物質(zhì)，比較了產(chǎn)區(qū)差異[8-10]，并初步評價了其抗氧化、抗菌等活性[11-13]，水蒸氣蒸餾法常用于草果揮發(fā)油的萃取[14]，但萃取時間長，因此，借助微波輔助萃取等方法可極大縮短萃取時間[15-17]。揮發(fā)性風味物質(zhì)多使用氣相色譜-質(zhì)譜儀進行定性鑒定，但很多風味化合物存在同分異構體，很難將其區(qū)分開來，飛行時間-質(zhì)譜儀具有高靈敏度，能快速、高通量分析專一的化學結構信息[18]，目前尚未見GC-TOF-MS在草果揮發(fā)性風味物質(zhì)方面的研究報道。因此，本實驗利用微波無溶劑萃取儀萃取云南怒江州草果的揮發(fā)性風味物質(zhì)，并用氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀對其進行定性分析，為草果揮發(fā)性成分的開發(fā)和利用提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草果：由云南怒江州農(nóng)業(yè)局提供； 正己烷(分析純)：西隴化工股份有限公司。

NEOS-GR微波無溶劑萃取儀 意大利Milestone公司；Agilent 7890B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司；Pegasus 4D GC-TOF-MS 美國LECO公司；QE-300 g高速萬能粉碎機 浙江屹立工貿(mào)有限公司；HDM-100電熱套 常州國華電器有限公司；AL104電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 草果樣品的揮發(fā)油提取和含量測定

將干燥的草果全果樣品用粉碎機粉碎過篩，分別收集粒度大于20目(標記為A)、20～40目(標記為B)以及小于40目(標記為C)的草果粉于密封袋內(nèi)，待測。采用微波無溶劑萃取儀提取不同粉碎粒度的草果粉，參考Xue Feng等的方法略有修改，即將100 g草果粉，加入500 mL去離子水，微波功率600 W，提取60 min，讀取并收集揮發(fā)油，分別標記為WBA、WBB和WBC，密封保存待測。

同時采用水蒸氣蒸餾法提取作為對照，參考谷風林等的方法略有修改，即準確稱取40.00 g 粒度大于20目(標記為A)、20～40目(標記為B)和小于40目(標記為C)3種不同粉碎粒徑的草果粉樣品，加入500 mL去離子水，連接揮發(fā)油收集器皿，進行水蒸氣蒸餾4 h，利用低溫循環(huán)泵冷凝，收集揮發(fā)油，分別標記為SZQA、SZQB和SZQC，用無水硫酸鈉除去水分，保存待測。

草果樣品中的揮發(fā)油含量根據(jù)收集到揮發(fā)油的體積除以草果粉的質(zhì)量計算，以mL/100 g表示。

1.2.2 揮發(fā)性風味物質(zhì)的氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀分析鑒定

將微波無溶劑萃取和水蒸氣蒸餾萃取所得的草果揮發(fā)油，分別用正己烷稀釋300倍，經(jīng)無水硫酸鈉脫除水分后，用0.45 μm孔徑尼龍膜過濾于氣相色譜專用小瓶中，用于GC-TOF-MS分析。

1.2.2.1 GC分析條件

色譜柱為DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣：氦氣，流速：1.0 mL/min；升溫程序：50 ℃保持0.2 min，以4 ℃/min的速率升至90 ℃，以2 ℃/min的速率升至160 ℃，以20 ℃/min的速率升至220 ℃，保持2 min；進樣口溫度：250 ℃；進樣量：1.0 μL，不分流，溶劑延遲360 s。

1.2.2.2 TOF-MS分析條件

EI離子源，電離能量：70 eV，離子源溫度：200 ℃；傳輸線溫度：250 ℃，質(zhì)量數(shù)掃描范圍：35～450 m/z，采集速率：10 spec/s，溶劑延遲300 s。

通過NIST 14譜庫檢索數(shù)據(jù)，采用峰面積歸一化法計算各化合物的相對百分比含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用Excel和儀器自帶軟件分析。

2 結果與分析

2.1 粉碎粒度對草果揮發(fā)油含量的影響

圖1 不同粉碎粒徑的草果粉揮發(fā)油含量Fig.1 Volatile oil content of Amomum tsao-ko powder with different grinding particle size

由圖1可知，草果樣品C(粉碎粒徑小于40目)的揮發(fā)油含量最高，達到3.521 mL/100 g，而樣品A(粉碎粒徑大于20目)的揮發(fā)油含量最低。這說明草果的粉碎粒度對其揮發(fā)性油含量的萃取量有較大影響，草果粉碎粒度越細，揮發(fā)油的萃取量越高。由此可知，草果樣品粉碎得越細，其揮發(fā)油越容易被提取出來。與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法相比，微波無溶劑萃取法萃取量相對較低，大于20目的草果粉揮發(fā)油提取量是水蒸氣蒸餾法的94.46%，但小于40目的草果粉揮發(fā)油提取量是水蒸氣蒸餾法的60.83%，粉碎粒度越細，兩種萃取方法所得揮發(fā)油含量差異越大，這可能與微波無溶劑萃取法的萃取時間短有關，其萃取工藝仍需要進一步優(yōu)化。

2.2 草果中揮發(fā)性風味物質(zhì)的分析

草果樣品揮發(fā)油的GC-TOF-MS總離子流圖見圖2和圖3，經(jīng)軟件自動進行解卷積和譜庫匹配后，并進行手動刪除色譜柱流失化合物后，分析出匹配度大于750的化合物共97種，其中采用微波無溶劑萃取法提取揮發(fā)油中的風味化合物種類和數(shù)量略高于傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法，其揮發(fā)性風味物質(zhì)的組成見表1。

圖2 微波無溶劑萃取草果揮發(fā)性風味物質(zhì)的GC-TOF-MS總離子流圖Fig.2 The TIC of microwave solvent-free extraction of volatile flavor substances from Amomum tsao-ko by GC-TOF-MS

圖3 傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾提取草果揮發(fā)性風味物質(zhì)的GC-TOF-MS總離子流圖Fig.3 The TIC of volatile flavor substances extracted by traditional steam distillation method from Amomum tsao-ko by GC-TOF-MS

表1 草果粉中揮發(fā)性風味物質(zhì)的組成Table 1 Composition of volatile flavor substances in Amomum tsao-ko powder

續(xù) 表

續(xù) 表

注：ND表示未檢出。

根據(jù)草果中揮發(fā)性風味物質(zhì)的相對含量，將相對含量大于10%以上的作為主要風味物質(zhì)，相對含量介于1%～10%的化合物作為次要風味物質(zhì)，相對含量介于0.1%～1%的化合物作為微量風味物質(zhì)，相對含量小于0.1%的化合物作為痕量風味物質(zhì)。經(jīng)比較分析，主要風味物質(zhì)有4種化合物，分別是桉樹醇、(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛和2-甲基-3-苯基丙醛，見圖5；次要風味物質(zhì)包含14種化合物，見圖6；微量風味化合物有30種，痕量風味化合物有49種。

圖4 草果揮發(fā)性風味物質(zhì)的相對含量Fig.4 The relative content of volatile flavor substances in Amomum tsao-ko

對不同草果揮發(fā)油樣品的風味物質(zhì)種類以及主要風味物質(zhì)和次要風味物質(zhì)含量作圖，由圖4和表1可知，草果中揮發(fā)性風味物質(zhì)主要由醛類、醇類以及少量的烯類和芳香族類化合物組成，其相對面積百分含量達到98.58%。其中，醛類化合物含量最高，達到68.67%，醇類化合物含量最高，達到26.58%。醛類化合物中相對含量較高的化合物是(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛以及2-甲基-3苯基丙醛，最高含量分別為25.85%、16.16%、17.94%，醇類化合物中相對較高的是桉樹醇，最高含量為18.61%，比谷風林等研究報道的高，這不僅與原料的處理方法有關，而且與揮發(fā)性風味物質(zhì)的檢測儀器條件等密切相關，大多數(shù)采用GC-MS檢測，鑒定出的草果揮發(fā)性風味物質(zhì)數(shù)量在39種左右，目前，尚未見TOF-MS在草果揮發(fā)性風味物質(zhì)的分析檢測方面的研究報道，因此，本實驗僅對揮發(fā)性風味物質(zhì)的不同萃取方法及草果原料的粉碎粒度進行比較分析。

對草果中的主要揮發(fā)性風味物質(zhì)進行分析比較，見圖5，發(fā)現(xiàn)這些化合物的含量受草果原料的粉碎粒度、不同萃取方法的影響而存在較大差異。

圖5 草果主要揮發(fā)性風味物質(zhì)的相對含量Fig.5 The relative content of main volatile flavor substances in Amomum tsao-ko

由圖5可知，桉樹醇用水蒸氣蒸餾法萃取的量相對較高，在粉碎粒徑小于40目時相對含量最高，但其并不隨著粉碎粒徑的減小而增加。(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛和2-甲基-3-苯基丙醛2種化合物采用微波無溶劑萃取法提取的量相對水蒸氣蒸餾法高，在粉碎粒徑介于20～40目時相對含量最高，而(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛與(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛是同分異構體，但在草果粉碎粒徑介于20～40目時水蒸氣蒸餾萃取的量最高，這可能與揮發(fā)性風味化合物的性質(zhì)有關，(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛有強烈的檸檬香氣，易揮發(fā)。

對草果中次要揮發(fā)性風味物質(zhì)的相對含量進行分析比較，見圖6。

圖6 草果中次要揮發(fā)性風味物質(zhì)的相對含量Fig.6 The relative content of secondary volatile flavor substances in Amomum tsao-ko

注：1為α-蒎烯，2為β-蒎烯，3為α-水芹烯，4為檸檬烯，5為鄰-異丙基苯，6為正辛醛，7為(E)-2-辛烯醛,8為(E)-2-癸烯醛,9為α-松油醇，10為香葉醇，11為(E)-2-十二烯醛,12為4-茚滿甲醛，13為α-甲基肉桂醛，14為橙花叔醇。

由圖6可知，化合物(E)-2-癸烯醛在次要揮發(fā)性風味物質(zhì)中含量最高，且其采用微波無溶劑萃取的量高于水蒸氣蒸餾法，在微波無溶劑萃取時，隨著草果粉碎粒度的增加，萃取所得的相對含量呈緩慢增加趨勢。α-松油醇、香葉醇、4-茚滿甲醛、α-甲基肉桂醛和橙花叔醇5種次要風味化合物在微波無溶劑萃取中的量亦高于水蒸氣蒸餾法，其中，α-甲基肉桂醛和橙花叔醇2種化合物隨著草果粉碎粒徑的增加相對含量呈緩慢下降趨勢。α-蒎烯、β-蒎烯、α-水芹烯、檸檬烯、鄰-異丙基苯5種化合物用水蒸氣蒸餾法萃取所得的含量遠遠高于微波無溶劑萃取，說明這5種化合物相對比較穩(wěn)定，適合用水蒸氣蒸餾法萃取。粉碎粒徑和萃取方法對正辛醛的量影響較小，(E)-2-辛烯醛在萃取方法上差異不大，但粉碎粒徑對其萃取量有較大影響，但不呈現(xiàn)規(guī)律，這可能與該化合物的性質(zhì)有關。

草果中微量風味化合物和痕量風味化合物多達79種，在數(shù)量上遠遠多于主要和次要風味化合物，但其相對含量遠遠低于主要和次要風味化合物，僅占總風味化合物的6.76%～8.77%。這些微量風味化合物的相對含量在萃取方法上存在較大差異，特別是酸類化合物，如辛酸、壬酸、正己酸，在微波無溶劑萃取中的相對含量是水蒸氣蒸餾法的2～4倍，而且在同一種萃取方法中，酸類化合物隨著原料粉碎粒度的增加相對含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，月桂烯、羅勒烯、檜烯等微量烯類化合物采用水蒸氣蒸餾萃取的相對含量是微波無溶劑萃取法的2～10倍，且隨著原料粉碎的增加相對含量呈現(xiàn)先降低后緩慢增加的趨勢。

3 結論

采用氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀對云南怒江草果的揮發(fā)油進行分析鑒定，共鑒定出97種揮發(fā)性風味物質(zhì)，遠遠高于國內(nèi)外的研究報道,相對含量低于1%以下的微量風味化合物和痕量風味化合物多達79種，在數(shù)量上遠遠多于主要和次要風味化合物，但其相對含量遠遠低于主要和次要風味化合物，僅占總風味化合物的6.76%～8.77%。云南怒江州草果揮發(fā)性風味物質(zhì)主要由桉樹醇、(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛和2-甲基-3-苯基丙醛以及少量的(E)-2-癸烯醛、α-松油醇、α-蒎烯、β-蒎烯、α-水芹烯、檸檬烯、鄰-異丙基苯、正辛醛、(E)-2-辛烯醛、香葉醇、 (E)-2-十二烯醛、4-茚滿甲醛、α-甲基肉桂醛、橙花叔醇18種化合物組成，其相對含量占總風味化合物的91.23%～93.24%。采用微波無溶劑萃取法萃取草果揮發(fā)油與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法相比，微波功率為500 W，萃取時間為60 min即可萃取出94.46%的揮發(fā)油，具有時間快、效率高等優(yōu)點，經(jīng)GC-TOF-MS分析鑒定，(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、2-甲基-3-苯基丙醛、α-松油醇、香葉醇、4-茚滿甲醛、α-甲基肉桂醛和橙花叔醇等部分風味化合物適合用微波無溶劑萃取，桉樹醇、α-蒎烯、β-蒎烯、α-水芹烯、檸檬烯、鄰-異丙基苯、月桂烯、羅勒烯、檜烯等化合物適合用水蒸氣蒸餾萃取。萃取前草果粉碎粒度對其萃取所得揮發(fā)油中的風味物質(zhì)組成及相對含量有較大影響，粉碎越細，揮發(fā)油的萃取量越高，水蒸氣蒸餾萃取的量可達到3.521 mL/100 g，遠高于谷風林等(1.3～2.7 mL/100 g)、Li W等(1.82 mL/100 g)的研究報道，這可能與原料及原料的粉碎粒度有關。丁艷霞等研究報道了微波輔助提取、超聲波輔助萃取和水蒸氣蒸餾萃取3種方法萃取草果精油的差異，雖然微波輔助萃取(4.50%)、超聲波輔助萃取(3.82%)的草果精油高于水蒸氣蒸餾法(2.75%)，但其使用正己烷作為溶劑，而且水蒸氣蒸餾萃取時間長達7.5 h，本實驗中采用微波無溶劑萃取和水蒸氣蒸餾萃取兩種萃取方法所得揮發(fā)油含量差異大，這可能與微波無溶劑萃取法萃取時間短有關，其萃取工藝仍需要進一步優(yōu)化，桉樹醇的相對含量隨粉碎粒度的增加而逐漸增加，(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、2-甲基-3-苯基丙醛和(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛在粉碎粒度介于20～40目之間的相對含量最高。