周文超，黃生耀，李 薇，熊小敏，蔡祥勝，郭 煜，馮紅梅，徐曉松，陳思聰

(1.沈陽(yáng)急救中心 急診科，遼寧沈陽(yáng) 110000；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院/廣州軍區(qū)檢驗(yàn)中心，廣東廣州510010；3.東莞仁康醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 523952；4.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 5 10080)

目前，大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究均表明,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)在移植免疫耐受的形成密切相關(guān)，一部分器官移植的受者逐漸對(duì)移植器官產(chǎn)生免疫耐受，將這部分受者血液中的CD4+T細(xì)胞被動(dòng)地轉(zhuǎn)移給其他宿主，也能獲得同樣的免疫耐受效果，此即“主動(dòng)移植耐受”。Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制功能與一些細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)等[1]。本研究通過(guò)分析肝腎移植患者前后外周血中Treg細(xì)胞的百分比的變化及細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)一步了解Treg和細(xì)胞因子與移植免疫耐受的相關(guān)性，為臨床移植免疫耐受研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年5-12月廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院肝膽外科及泌尿外科肝腎移植患者15例為移植組。其中腎移植7例，肝移植8例；男12例，女3例；年齡23～64歲，平均46歲。

1.2試劑 試劑為CD4-FITC、CD25-PE、Mouse Anti-Hunan CD127-PerCP-CyTM5.5、MouseIgG1-PE、MouseIgG1-PerCP-Cy5.5、溶血?jiǎng)?、鞘液，均?gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。TGF-β1、IL-10試劑盒均購(gòu)自德國(guó)IBL(IBL International GmbH)公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 清晨空腹采取靜脈血2 mL，用乙二胺四乙酸三鉀(EDTA-K3)抗凝，每份標(biāo)本設(shè)測(cè)定、同型對(duì)照2管，分別于2管中各加入100 μL抗凝血后，于測(cè)定管中加入CD4-FITC 10 μL、CD25-PE 10 μL、PerCP-CyTM 5.5 Mouse Anti-Hunan CD127 2 μL，同型對(duì)照加入CD4-FITC、MouseIgG1-PE各10 μL，MouseIgG1 percp-Cy5.5 2 μL，振蕩混勻，室溫避光標(biāo)記15 min；加入1 mL溶血?jiǎng)袷幓靹?，室溫避光溶?0 min；2 000 r/min離心2 min棄上清液，加鞘液1 mL，2 000 r/min離心2 min，棄上清液，加入鞘液500 μL充分混勻后上機(jī)分析。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒檢測(cè)患者外周血血清中TGF-β1、IL-10的水平，操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1器官移植患者移植前與對(duì)照組CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的比較 器官移植患者為15例，其中腎功能不全，尿毒癥期腎移植為7例；肝癌肝硬化8例。移植組CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞百分比為(5.60±2.11)%，對(duì)照組為(3.80±1.15)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)；移植組高于對(duì)照組，存在顯著性差異。見(jiàn)圖1。

注：移植前與對(duì)照組比較，*P<0.05。

圖1移植組移植前與對(duì)照組外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的比較

2.2移植前與移植后CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的比較 移植組CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞百分比為(5.60±2.11)%，移植后變?yōu)?，CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞移植前后存在顯著性差異，其差值的均數(shù)為5.60，標(biāo)準(zhǔn)差為2.11。見(jiàn)圖2。

注：A、B均為移植前Treg細(xì)胞的百分比；C為移植后Treg細(xì)胞的百分比。

圖2移植前與移植后CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞

2.3器官移植前CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的百分比與TGF-β1、IL-10水平的相關(guān)性 移植前患者CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的百分比為(5.60±2.12)%，TGF-β1水平為(728.32±356.26)ng/L，IL-10水平為(481.85±124.04)ng/L。TGF-β1和IL-10的水平與CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞百分比均呈正相關(guān)(r=0.627，P=0.012；r=0.544，P=0.036)。見(jiàn)圖3。

注：A表示與TGF-β1的相關(guān)性；B表示與IL-10的相關(guān)性。

圖3移植前Treg細(xì)胞的百分比與TGF-β1、IL-10水平的相關(guān)性

2.4器官移植前后TGF-β1、IL-10水平的比較 器官移植前TGF-β1水平為(728.32±356.26)ng/L，移植后TGF-β1水平為(685.46±281.06)ng/L，移植前高于移植后，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.308)。器官移植前IL-10水平為(481.85±124.04)ng/L，移植后水平為(458.51±95.89)ng/L，移植前高于移植后，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

注：同一指標(biāo)移植前后的比較，*P>0.05。

圖4器官移植前后TGF-β1、IL-10細(xì)胞因子水平的比較

3 討 論

肝腎移植是治療肝腎疾病終末期的有效治療方法，能延長(zhǎng)人的生命。Treg及相關(guān)細(xì)胞因子可能與移植免疫耐受密切相關(guān)，研究移植后急性排斥反應(yīng)的早期診斷，如何降低術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生，誘導(dǎo)免疫耐受的形成仍然是當(dāng)前乃致今后一段時(shí)間在此領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

相關(guān)的研究數(shù)據(jù)表明，肝移植術(shù)后，占比進(jìn)行肝臟移植術(shù)總?cè)藬?shù)的25%～33%患者完全接受肝臟移植物，這與其受體內(nèi)Treg細(xì)胞的異常表達(dá)有關(guān)[2]。誘導(dǎo)型Treg主要通過(guò)分泌細(xì)胞因子IL-10及TGF-β等發(fā)揮免疫抑制作用，IL-10 及TGF-β細(xì)胞因子在一定程度上也可誘導(dǎo)Treg 的分化，兩者相互作用[3-4]。

羅文峰等[5]研究報(bào)道顯示,腎移植術(shù)前第1～2天，急性排斥組和穩(wěn)定組的Treg細(xì)胞水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后4周內(nèi)2組Treg細(xì)胞水平均急劇下降。術(shù)后第4～8周，穩(wěn)定組受者的Treg細(xì)胞水平開(kāi)始回升，而急性排斥組繼續(xù)下降。術(shù)后第8～12周，穩(wěn)定組的Treg細(xì)胞水平明顯回升，但排斥組則仍維持在較低水平，且此階段2組Treg細(xì)胞水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生急性排斥反應(yīng)的肝移植體患者體內(nèi)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的量顯著低于未發(fā)生排斥的患者，這表明提高受體循環(huán)中CD4+CD25+Treg細(xì)胞的量可能有利于肝移植的存活。鐘嘉明[5]的研究報(bào)道顯示，肝移植術(shù)后，外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞百分比暫時(shí)下降，1年內(nèi)逐漸恢復(fù)，其下降的原因可能與應(yīng)用大量免疫抑制劑及激素有關(guān)。肝移植病人肝功能長(zhǎng)期穩(wěn)定時(shí)，外周血中的Treg細(xì)胞百分比與他克莫司血藥濃度有關(guān)，高血藥水平受者Treg細(xì)胞百分比顯著降低，低血藥水平受者Treg細(xì)胞水平雖有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[6]。

本研究結(jié)果顯示，CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞移植組顯著高于對(duì)照組。肝移植患者中，都是肝癌患者，既往的研究中肝癌組高于健康人群。移植患者移植后1、2、3周后CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞下降為0，與上述的報(bào)道存在差異[7]。Treg下降為0，可能原因?yàn)椋?1)移植術(shù)后，Treg細(xì)胞重新分布于移植物、外周血和淋巴組織中，引起外周血中Treg細(xì)胞水平降低；(2)急性排斥反應(yīng)時(shí)，大量的炎癥趨化因子使Treg細(xì)胞向移植物遷移，外周血中Treg細(xì)胞水平進(jìn)一步降低；(3)應(yīng)用大量的免疫抑制劑，可引起Treg細(xì)胞百分比降低。本研究觀察到隨著移植術(shù)成功至6周開(kāi)始出現(xiàn)Treg細(xì)胞的表達(dá)，表達(dá)范圍在0～1%，由于時(shí)間短暫，患者出院，未能繼續(xù)跟蹤，但從移植后來(lái)院復(fù)查的患者中觀察到，Treg細(xì)胞在移植半年到5年后，表達(dá)范圍在3%～11%。

器官移植前CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞百分比與TGF-β1、IL-10水平呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與于丹軍等[7]在婦科腫瘤研究結(jié)果相一致。表明Treg 可能通過(guò)引起TGF-β、IL-10 上調(diào)而發(fā)揮免疫抑制的作用。

移植患者TGF-β1、IL-10的水平下降，移植前高于移植后，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？赡芘c移植前患者體內(nèi)存在的TGF-β1、IL-10水平有關(guān)。具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步的觀察研究。

4 結(jié) 論

Treg細(xì)胞及細(xì)胞因子在器官移植免疫中發(fā)揮著重要的作用，本研究觀察Treg細(xì)胞與細(xì)胞因子TGF-β1、IL-10水平在移植前呈正相關(guān)。Treg細(xì)胞在移植后數(shù)周下降為0，幾周后緩慢出現(xiàn)表達(dá)，細(xì)胞因子移植后下降。臨床中有關(guān)Treg細(xì)胞與細(xì)胞因子在移植前后監(jiān)測(cè)的數(shù)據(jù)稀少，還需要更多的研究來(lái)明確這類(lèi)細(xì)胞作為一種免疫指標(biāo)的作用。