江 鴻，費安興，魏莉平，鄒甜甜，何 松，李 勝

(鄂東醫(yī)療集團黃石市婦幼保健院檢驗科，湖北黃石 435000)

國際糖尿病協(xié)會權(quán)威數(shù)據(jù)顯示，糖尿病的發(fā)病呈快速增長和低齡化的態(tài)勢，已躍居全世界發(fā)病率和病死率最高的疾病之一。全球糖尿病患者在2010年已接近3億，預計到2030年將超過4.35億，糖尿病及并發(fā)證已成為全球范圍內(nèi)日益嚴重的健康問題。糖尿病將成為世界經(jīng)濟增長的主要牽制力之一，這顯示了全球糖尿病防治的嚴峻形勢。

妊娠期糖尿病(GDM)是指在妊娠期間首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的葡萄糖耐量異常，是糖尿病的一種特殊類型，其發(fā)病率在各國差異較大，為1%～14%。GDM對孕婦、胎兒和新生兒均有較大的負面影響，GDM患者中羊水過多、妊娠期高血壓、巨大兒、剖宮產(chǎn)、胎兒畸形、新生兒低血糖、低血鈣、新生兒窒息甚至死亡的發(fā)生率明顯增高，GDM產(chǎn)婦自己發(fā)展為2型糖尿病的概率也會大大增加，且其分娩的子女(特別是出生時為巨大兒的子女)成年后發(fā)生肥胖及2型糖尿病等代謝性疾病的概率也會顯著增高，這種遺傳效應導致糖尿病的發(fā)病具有明顯的家族聚集性，這對患者的整個家庭乃至整個社會都會造成極大的影響[1-3]。本研究以黃石地區(qū)孕婦人群為研究對象，通過高通量技術(shù)平臺，檢測GDM孕婦外周血胎兒游離DNA，篩選孕婦妊娠期胎兒染色體非整倍數(shù)拷貝變異，為進一步解析影響妊娠期孕婦糖尿病致病基因的分子機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年1-6月來鄂東醫(yī)療集團黃石市婦幼保健院圍保門診產(chǎn)檢的GDM孕婦的靜脈血樣本作為GDM組，共15例；健康對照組為體檢健康孕婦，共15例。孕婦年齡22～35歲，孕周12～26周。GDM的診斷標準參照《婦產(chǎn)科學》第6版[4]和國家原衛(wèi)生部妊娠期糖尿病的篩查和診斷標準(2011年)[5]。GDM組孕婦與健康對照組均為單胎，年齡、孕周差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，所有健康對照組孕婦體檢健康，無高血壓、糖尿病史等其他既往病史。本研究經(jīng)鄂東醫(yī)療集團黃石婦幼保健院倫理委員會批準(1.0版，2018-12-24)。

1.2方法

1.2.1血漿DNA抽提 GDM組是血糖耐受量異常組，健康對照組是正常血糖濃度組。通過采集孕婦外周靜脈血10 mL左右，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，1 500 g離心10 min，取分離得到的母體血漿進行胎兒游離DNA提取，參照華大基因核酸提取試劑盒進行操作。首先，配置蛋白酶K溶液，在96孔內(nèi)按照1∶10比例加入蛋白酶K和磁珠液，用封口膠密封，50 ℃恒溫振蕩器中250 r/mim洗脫1 h。然后，在每孔內(nèi)加入20 μL磁珠和400 μL binding buffer震蕩2～3 min混勻，放置磁力架中5 min，倒掉上清；分別用600 μL洗脫液離心5 min混勻，放置磁力架中5 min，倒掉上清。最后，每孔加入50 μL Elution Buffer 1 300 r/min，70 ℃，20 min，放置于磁力架中獲得DNA溶液。DNA質(zhì)量檢測是通過Qubit 4熒光定量儀上測定DNA濃度和總量，吸光度(A)260/280在1.8～2.0。

1.2.2cDNA合成及文庫構(gòu)建 采用華大基因BGI NIFT檢測試劑盒的建庫方法構(gòu)建cDNA文庫，具體步驟如下：對血漿提取的DNA通過末端修復、接頭連接、PCR擴增進行文庫制備；制備陰性對照和陽性對照混合液，分別取38.5 μL分子級水，再分別加入1.5 μL陰性對照品、陽性對照品，充分混勻。制備10.0 μL末端修復液，其中末端修復酶0.6 μL，末端修復緩沖液9.4 μL。將上述PCR管加入10 μL末端修復混合液，充分混勻，瞬間離心，置于PCR儀上，37 ℃孵育10 min，冷卻至4 ℃保存；接頭連接采用磁珠法，將總體積30 μL的連接反應混合液(24 μL連接緩沖液，1 μL連接酶和5 μL標簽接頭)加入PCR管內(nèi)，置于PCR儀上23 ℃孵育20 min，冷卻至4 ℃保持；再將PCR管過磁力架，棄掉上清液后，加入200 μL 75%乙醇，吹打混勻，過磁力架至溶液澄清，棄掉上清；加入23 μL洗脫緩沖液，充分混勻，室溫靜置5 min，置于磁力架3 min至溶液澄清，取21 μL上清液于新PCR管中。PCR反應程序為：98 ℃，2 min，1個循環(huán)；98 ℃，15 s，56 ℃，15 s，72 ℃，30 s，12個循環(huán)；72 ℃，5 min，1個循環(huán)，4 ℃，保存。以文庫濃度≥2 ng/μL為合格標準。

1.2.3上機檢測 對構(gòu)建好的cDNA文庫經(jīng)純化合格后，使用BGISEQ-50測序平臺測序。

2 結(jié) 果

2.1測序質(zhì)量質(zhì)控分析 每次檢測樣本測序有效數(shù)據(jù)量不少于3.5 M條DNA序列，每次檢測結(jié)果同時滿足陰性對照品檢測為陰性，陽性對照品檢測為陽性結(jié)果。擴增循環(huán)數(shù)設(shè)定為45個循環(huán)，隨著循環(huán)數(shù)增加，唯一比對測序條帶數(shù)>2.5 M，Q20達到95%以上，Q30均達到90%以上，GC%含量在38%～42%，可見數(shù)據(jù)質(zhì)控合格，可以進行下一步結(jié)果分析，見圖1。

注：A表示基因芯片參數(shù)；B表示基因序列讀取結(jié)果；C表示標簽拆分率。

圖1測序質(zhì)控圖

表1 GDM組和健康對照組孕婦胎兒游離DNA文庫濃度比較(ng/μL)

2.22組孕婦外周血胎兒游離DNA文庫濃度比較 GDM組孕婦和健康對照組孕婦胎兒游離DNA文庫濃度分別為(17.60±0.70)、(18.20±0.35)ng/mL，2組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.32組孕婦外周血胎兒染色體拷貝數(shù)結(jié)果分析 采用Z檢驗驗證GDM組與健康對照組，結(jié)果顯示，當陽性判斷值判斷為3時，顯著性水平P<0.01，Z<3，可判定為陰性，并且GDM組和健康對照組間染色體拷貝數(shù)無明顯差異。見表2。

表2 GDM組和健康對照組孕婦胎兒游離DNA染色體非整倍體拷貝數(shù)及風險值

3 討 論

關(guān)于GDM的發(fā)病機制學說眾多，有遺傳易感學說、胰島素抵抗學說、氧化應激學說、細胞因子分布及表達異常學說等，其中，胰島素抵抗(IR)普遍被認為是導致GDM發(fā)生發(fā)展的主要機制[6-7]。大量研究表明，糖尿病是一種多基因病，GDM是糖尿病中的獨立類型，對孕婦和胎兒均存在重大影響，GDM不僅與生理性代謝相關(guān)，起決定性作用的仍然是易感基因和致病相關(guān)基因[8-10]。因此，本研究旨在通過檢測GDM孕婦外周血胎兒游離DNA變化，分析基因表達水平是否正常，為診斷和闡明GDM及其遺傳效應提供依據(jù)。

近年來，國內(nèi)外廣泛提出了“精準醫(yī)療計劃”，特別是伴隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，基因測序的成本日益降低，基因測序技術(shù)日漸在腫瘤檢測、液體活檢和產(chǎn)前診斷等諸多領(lǐng)域凸顯重要價值和應用前景[11-13]。本研究中通過華大基因BGISEQ-50測序儀，采用聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)(cPAS)和DNA納米球(DNB)技術(shù)，將DNA分子錨與熒光探針在DNB納米球上進行聚合，并產(chǎn)生熒光信號，然后通過高分辨率成像系統(tǒng)對光信號進行拍照采集，光信號經(jīng)過數(shù)字化處理后即可獲得堿基序列。其中，DNB 通過線性擴增的方法進行增強信號，這種方法可以有效降低單拷貝的錯誤率[14]，十分有效地保證測序過程的準確。本實驗均設(shè)置對照組及質(zhì)控，測序結(jié)果顯示有效測序量達到5 M以上，測序飽和量均達到要求，兩組Q20和Q30均分別高于90%以上，GC含量均在50%范圍內(nèi)，由此證明測序結(jié)果十分可靠。

正常母親和胎兒的染色體基因在表達水平上是相同的，如果出現(xiàn)孕婦或胎兒染色體基因表達水平異常，那么可能與一些先天性疾病發(fā)生密切相關(guān)。湯冬玲[15]的研究表明，GDM就可能與基因表達水平異常直接相關(guān)，游離胎兒DNA水平的升高可能與GDM的病理變化使胎盤屏障不完善，胎兒有核細胞進入母體量增多有關(guān)。因此，孕婦外周血中胎兒DNA水平的改變可作為輔助診斷及預防 GDM的一項有效指標。本研究采用無創(chuàng)孕婦外周血游離DNA測序技術(shù)，理論上可以通過檢測游離在母體外周血的胎兒DNA來檢測胎兒的遺傳物質(zhì)，從而實現(xiàn)無創(chuàng)零風險的遺傳檢測。已有大量報道顯示，無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)準確性高，基本接近產(chǎn)前診斷的準確性，具有非侵入性、無流產(chǎn)風險的優(yōu)勢，其綜合先進的生物信息學分析技術(shù)，準確檢測出常見胎兒染色體非整倍體異常[16-18]。本研究顯示，GDM組孕婦胎兒游離DNA文庫濃度并無顯著異常，但進一步通過染色體非整倍體變異分析發(fā)現(xiàn)個別在18號染色體基因拷貝數(shù)存在微重復，但是否與糖尿病致病相關(guān)仍有待實驗進一步驗證。

4 結(jié) 論

本研究通過高通量技術(shù)揭示，GDM孕婦外周血胎兒游離DNA無明顯異常，染色體基因拷貝數(shù)無明顯差異，為進一步研究GDM形成的分子機制和臨床診斷奠定了基礎(chǔ)。