汪婧瑜， 張業(yè)輝， 阮奇珺， 張友勝， 劉學銘， 陳智毅， 程鏡蓉， 王旭蘋

(廣東省農業(yè)科學院 蠶業(yè)與農產品加工研究所/農業(yè)農村部功能食品重點實驗室/廣東省農產品加工重點實驗室， 廣東 廣州 510610)

烏鱧(Channaargus)是營養(yǎng)價值較高的名貴淡水魚類，肉質細嫩鮮美，營養(yǎng)豐富。烏鱧生存能力極強，可離水存活2～3 d，死后機體不易腐敗變質，具有特殊的生理結構，因而烏鱧肉是制備營養(yǎng)保健食品的優(yōu)選原料。鋅缺乏可導致生長遲緩，性腺功能低下，免疫系統(tǒng)受損，神經功能障礙等疾病[1]，尤其在嬰兒、學齡前兒童、孕婦、哺乳期婦女以及老年人中普遍存在[2]。新型的肽- 鋅復合物可以利用小肽的吸收模式促進鋅元素的吸收，提高鋅的生物利用度，起到額外補充鋅元素的作用。但是在現(xiàn)有的螯合技術中，螯合時間長、能耗大，不僅影響了螯合物的生產效能，也在一定程度上制約了淡水魚水解肽螯合物的研究和應用。

超聲波技術作為新型的非熱加工技術，能快速、高效地提高食品品質，還具有開發(fā)功能獨特新產品的潛力[3]。超聲波技術的特殊效應如空穴效應、機械效應、熱效應、化學效應等，不僅能輔助提取、加速反應，還能改變蛋白質的分子特性，從而改善蛋白質的理化性質和功能特性[4-6]。目前關于超聲波加快螯合反應速率、提高螯合物穩(wěn)定性的研究還較少，本研究以營養(yǎng)豐富的烏鱧為原料，探究超聲波處理對烏鱧短肽- 鋅(Channaargusshort peptide-zinc，CASP-Zn)結構及抗氧化活性的影響，以期為烏鱧蛋白的深加工提供參考，為超聲波技術在螯合肽生產中的應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏鱧，購于廣東省廣州市華潤萬家超市；胰蛋白酶(牛胰，250 U/mg)、鹽酸、氫氧化鈉、鉻黑T、乙二胺四乙酸(EDTA)、硫酸鋅、無水乙醇、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、過氧化氫、鄰苯三酚等試劑，均為分析純。 混合標準品：細胞色素C(12 500 u)、桿菌肽(1 450 u)、Gly-Gly-Tyr-Arg(451 u)、Gly-Gly-Gly(189 u)，均為優(yōu)級純，中國計量科學研究院。

1.2 儀器與設備

BSA224S- CW型分析天平，德國Sartorius公司；FE- 28型pH計，瑞士Mettler Toledo公司；TGL- 16M型高速冷凍離心機，湖南湘儀有限公司；1- 2LD- Plus型真空冷凍干燥儀，德國 Marin Christ 公司；UV- 1800型紫外可見分光光度計，日本島津公司；F- 7000型熒光分光光度計，日本日立公司；Transsonic T1- H- 10型超聲波清洗儀，德國Elma公司；Leo- 1530vp型場發(fā)射電子掃描顯微鏡，德國LEO公司；JME- 2100型高分辨透射電子顯微鏡，日本電子株式會社。

1.3 實驗方法

1.3.1CASP-Zn的制備

取實驗室自制烏鱧短肽(CASP)[7]，配成質量分數(shù)為2%的溶液，按2∶1(短肽與硫酸鋅質量比)的比例加入硫酸鋅，攪拌均勻。調溶液pH值為7.0，在70 ℃下，按不同超聲功率(0、120、240、360、480 W)超聲一段時間。加入4倍體積無水乙醇醇沉1 h，10 000 r/min離心10 min。取沉淀，60 ℃鼓風干燥，得到不同CASP- Zn樣品。螯合率的測定：采用EDTA滴定法[8]。

1.3.2CASP分子量分布測定

樣品的處理：用流動相配制標準品；先用質量分數(shù)為15%的TCA與短肽溶液等體積混合除去雜蛋白，再用雙倍的流動相與去除雜蛋白的短肽溶液混合，0.22 μm濾頭過濾，制備1 mL的樣品。

色譜條件：TSK gel G2000SWXL型色譜柱(300 mm×7.8 mm)；流動相為乙腈、水、三氟乙酸，體積比為10∶90∶0.1，流速為0.5 mL/min；檢測波長為UV 220 nm，柱溫為30 ℃，進樣體積為20 μL 。

1.3.3CASP-Zn結構分析

氨基酸分析：采用GB/T 5009.124—2016[9]中方法進行測定。

紫外光譜分析：將CASP- Zn樣品配制成質量濃度為1 mg/mL的溶液，于190～400 nm測定CASP-Zn紫外吸收光譜，以蒸餾水為空白對照。

熒光光譜分析：參照曾慶瑞等[10]的方法。將不同CASP- Zn樣品配制成2 mg/mL的溶液，在室溫下設置激發(fā)波長為280 nm，于290～520 nm波長測定CASP-Zn發(fā)射光譜。以蒸餾水為對照。

掃描電鏡分析：將CASP- Zn干燥粉末樣品均勻涂在樣盤雙面膠上，噴金鍍膜處理后，利用場發(fā)射電子掃描顯微鏡，在放大10 000倍條件下觀察CASP-Zn微觀結構。

1.3.4CASP-Zn抗氧化活性的測定

DPPH自由基清除率的測定：參照Borawska等[11]的方法。

超氧陰離子自由基清除率的測定：參照Cheung等[12]的方法。

H2O2清除率測定：參照趙姝雯等[13]的方法。

1.4 數(shù)據處理

采用SPSS軟件進行數(shù)據分析，采用Origin 9.0軟件繪圖。數(shù)據用平均值±標準差(Mean±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 CASP的分子量分布

圖1反映了CASP的分子量大小分布情況。由圖1發(fā)現(xiàn)，CASP的主要成分由3部分組成，屬于混合肽，其保留時間分別為20.388、22.803、23.444 min?；旌蠘藴势分校毎谻、桿菌肽、Gly- Gly- Tyr- Arg、Gly- Gly- Gly的保留時間分別為16.079、20.117、21.594、22.919 min。混合標準品中，各標準品分子量大小分別為12 500、1 450、451、189 u。通過與標準品比較，得出CASP三個組分的分子量大小都在1 450 u以下，基本以小分子短肽為主。

峰4～7分別為標準品細胞色素C、桿菌肽、Gly- Gly- Tyr- Arg、Gly- Gly- Gly。圖1 混合標準品及CASP的分子量分布Fig.1 Molecular weight distribution of mixed standard and CASP

2.2 CASP與CASP- Zn氨基酸分析

短肽與螯合鋅的氨基酸組成成分見表1。由CASP中共檢測出15種氨基酸，CASP- Zn檢測出16種氨基酸，其中CASP中Glu含量最高，為3.35 mg/g；Asp含量次之，為2.95 mg/g。CASP- Zn中Glu含量最高，為5.23 mg/g；Asp含量次之，為4.83 mg/g。呈酸性的氨基酸含量顯著增加，說明CASP中酸性氨基酸與鋅離子發(fā)生了螯合反應。CASP中芳香族氨基酸Tyr、Phe總質量比為2.76 mg/g，占總氨基酸的11.34%，而CASP- Zn中芳香族氨基酸質量比為2.70 mg/g，占總氨基酸的 8.13%。

表1 CASP與CASP- Zn的氨基酸組成

1)由于酸水解導致色氨酸(Trp)被破壞，所以未能檢測到Trp；2) *為抗氧化活性較強的氨基酸。

與CASP相比，CASP- Zn中芳香族氨基酸含量下降。另外，CASP中，抗氧化活性較強的氨基酸Met、Try、Lys、His總質量比為5.71 mg/g，占總氨基酸質量比的23.46%；CASP- Zn的抗氧化性氨基酸總質量比為6.82 mg/g，占總氨基酸的20.54%。說明，與鋅離子螯合后，CASP的抗氧化活性發(fā)生改變。

2.3 超聲波處理對CASP- Zn螯合率的影響

不同超聲功率和超聲時間對CASP- Zn螯合率的影響顯著，實驗結果見圖2。隨著超聲功率的加強，CASP- Zn的螯合率升高，超聲功率為360 W時，CASP- Zn的螯合率最高，達到93.0%左右，但是超聲功率再增加，其螯合率反而下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是超聲波的空穴效應改變了短肽的結構，促進了短肽與微量元素的螯合，提高了螯合率。當超聲功率太強時，短肽發(fā)生聚合和變性[14]，降低了短肽與微量元素的結合能力，使得螯合率下降。另外，在較短的超聲時間內(15 min)，CASP- Zn的螯合率達到較高值。隨著超聲時間的延長，其螯合率趨于穩(wěn)定，這可能是超聲波促進螯合反應的發(fā)生，使得螯合反應在較短時間內達到平衡。說明超聲波處理不僅能提高螯合率，還能加速螯合反應的發(fā)生，這與李籽萱等[15]的研究結果相似。

圖2 超聲波處理對CASP- Zn螯合率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment on chelating rate of CASP- Zn

2.4 超聲波處理對CASP- Zn結構的影響

2.4.1超聲波處理對CASP-Zn光譜結構的影響

短肽與螯合物形成的變化可以通過紫外吸收光譜的強度和位移變化來判斷[16]，超聲波處理后CASP- Zn的紫外光譜如圖3。從圖3中可以看出，短肽與超聲波處理后CASP- Zn的紫外最大吸收峰在274 nm左右，其中短肽的最大吸收峰強度為0.832，不同功率超聲波處理后CASP- Zn的吸收峰強度分別為0.601、0.659、0.592、0.728、0.571。通過比較發(fā)現(xiàn)，CASP- Zn的吸收峰強度較短肽弱；360 W超聲波處理的CASP- Zn的最大吸收峰強度較其他處理的最強。這一變化說明，鋅離子與短肽發(fā)生反應，形成新的物質CASP- Zn。經過超聲波處理后，由于超聲波的特殊效應，改變短肽的結構，影響鋅離子與短肽的結合位點，從而改變了CASP- Zn的結構，產生不同的紫外吸收峰。

圖5 超聲波處理對CASP- Zn微觀結構的影響Fig.5 Effect of ultrasonic treatment on surface microstructure of CASP- Zn

芳香氨基酸(Phe、Tyr、Trp)可以在一定的激發(fā)波長下產生內源性熒光[17]。超聲波處理后，CASP- Zn的熒光強度發(fā)生變化，實驗結果見圖4。從圖4中可以看出，CASP與超聲波處理后CASP- Zn的熒光強度為352～357 nm。與CASP相比，CASP- Zn的熒光強度下降；而超聲波處理后，CASP- Zn的熒光強度發(fā)生改變，與其他超聲波處理的CASP- Zn相比，360 W超聲波處理的CASP- Zn的熒光強度最強。產生這一變化的原因可能是，鋅離子與短肽中芳香族氨基酸反應，改變了芳香族氨基酸的結構，使得熒光強度降低。氨基酸組成分析顯示，短肽與螯合鋅芳香族氨基酸含量不同，驗證鋅離子與短肽形成螯合物，導致熒光猝滅；也有研究表明，螯合過程中，由于短肽的折疊或聚集，金屬離子的引入會導致固有熒光的猝滅[18]，而超聲波處理，加速螯合反應，促進了鋅離子與短肽結合，從而改變熒光強度。

圖3 超聲波處理對CASP- Zn紫外光譜的影響Fig.3 Effects of ultrasound treatment on UV spectra of CASP- Zn

圖4 超聲波處理對CASP- Zn熒光光譜的影響Fig.4 Effects of ultrasound treatment on fluorescence spectra of CASP- Zn

2.4.2超聲波處理對CASP-Zn微觀結構的影響

超聲波處理改變了CASP- Zn的微觀結構，實驗如圖5。從圖5中可以看出，短肽表面光滑平整；CASP- Zn表面不平整，有孔狀結構。未經過超聲波處理的CASP- Zn表面有粒狀結晶，孔隙較大；120 W超聲波處理的CASP- Zn，表面顆粒呈粒狀和片狀，孔隙變?。?40 W超聲波處理的CASP- Zn，表面呈片狀，孔隙變大；360 W超聲波處理的CASP- Zn，表面呈片狀，且堆疊在一起，沒有孔隙；480 W超聲波處理的CASP- Zn，表面粒狀結晶分布密集，孔隙很小。比較發(fā)現(xiàn)，經過360 W超聲波處理后的CASP- Zn結合最緊密，這表明360 W超聲波處理后的CASP- Zn結構最穩(wěn)定，進一步說明超聲波處理能提高螯合物的穩(wěn)定性。

2.5 超聲波處理對CASP- Zn抗氧化活性的影響

研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣肽- 鋅復合物具有抗氧化活性[17]。通過對CASP- Zn的DPPH自由基、超氧陰離子自由基和H2O2清除率的測定，反映了CASP- Zn的抗氧化活性，實驗結果見圖6。從圖6發(fā)現(xiàn)，隨著樣品質量濃度的升高，CASP和CASP- Zn對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和H2O2的清除率逐漸增強，但與維生素C相比，CASP和CASP- Zn對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和H2O2的清除率都弱于維生素C。這說明CASP和CASP- Zn具有一定的抗氧化活性。在同一質量濃度下，CASP和超聲波處理前后的CASP- Zn的DPPH自由基、超氧陰離子自由基和H2O2的清除率差異顯著。超聲波處理后，CASP- Zn對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和H2O2的清除率發(fā)生改變。從圖6(a)中發(fā)現(xiàn)，360 W超聲波處理后，CASP- Zn的DPPH自由基清除率較其他超聲波處理的強，0 W和480 W超聲波處理的CASP- Zn的DPPH自由基清除率相接近。120 W和240 W超聲波處理的CASP- Zn的DPPH自由基清除率相接近。從圖6(b)中可以看出，不同超聲波處理的CASP- Zn超氧陰離子自由基清除率變化不顯著，其中，0 W超聲波處理的CASP- Zn超氧陰離子自由基清除率較高。由圖6(c)發(fā)現(xiàn)，經過240 W超聲波處理的CASP- Zn的 H2O2清除率較強，但與其他超聲波處理的CASP- Zn相比，H2O2清除率變化差異不大。這可能是因為短肽與鋅離子螯合后，具有抗氧化活性的氨基酸結構發(fā)生改變，從而改變其抗氧化活性；而超聲波處理改變短肽的結構，促進螯合反應，進而影響了鋅離子與抗氧活性較強氨基酸的結合，從而使得CASP- Zn表現(xiàn)出不同的抗氧化活性。另外，360 W超聲波處理后CASP- Zn具有較強的抗氧化活性，可能與其穩(wěn)定的結構有關。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6 超聲波處理對CASP- Zn抗氧化性的影響Fig.6 Effect of ultrasonic treatment on antioxidant activity of CASP- Zn

3 結 論

1) 不同超聲功率和超聲時間對CASP- Zn的螯合率產生影響。通過比較發(fā)現(xiàn)，360 W超聲波處理后的CASP- Zn螯合率最強，可以達到93.0%左右。另外，短時間(15 min)的超聲處理就能使得CASP- Zn的螯合率達到較高值。

2) 光譜和電鏡分析顯示，經過超聲波處理的CASP- Zn結構發(fā)生改變。這可能是因為超聲波的空穴效應改變了短肽的結構，影響了短肽與鋅離子的結合位點；也可能是超聲波促進了螯合反應發(fā)生，增強了短肽與鋅離子之間交聯(lián)作用，從而使得肽- 鋅復合物的結構發(fā)生改變。360 W超聲波處理后的CASP- Zn結構變化最大，其結構也更穩(wěn)定。

3) CASP- Zn具有抗氧化活性，經過超聲波處理后，其抗氧化活性發(fā)生改變。360 W超聲波處理后的CASP- Zn具有較強的DPPH自由基清除率，不同超聲波處理的CASP- Zn對超氧陰離子自由基和H2O2的清除率變化不顯著。

通過研究超聲波處理對CASP- Zn螯合率、微觀結構以及抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)超聲波處理不僅能縮短反應時間，還提高肽- 鋅復合物的穩(wěn)定性及抗氧化性，有利于烏鱧資源的精深加工和開發(fā)利用。