孫 博， 邵蕾娜， 殷 嫻， 王鳳寰， 張 雨

(北京工商大學(xué) 輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 北京 100048)

硒元素是人體必需微量元素之一，是維持人體正常生理功能的重要營(yíng)養(yǎng)成分，具有保護(hù)組織和細(xì)胞膜免受氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高人體免疫力，保護(hù)肝臟等的生理功能[1-3]。由于硒在人體內(nèi)的安全閾值很低，硒攝取量連續(xù)低于40 μg/d會(huì)出現(xiàn)缺硒癥狀，高于400 μg/d則可能產(chǎn)生硒中毒現(xiàn)象[4]；因此，補(bǔ)硒需慎重。食品中硒的毒性和活性取決于硒的化學(xué)結(jié)構(gòu)，相比于無機(jī)硒，有機(jī)硒具有更高的生物利用度和更低的毒性[5]。由于人工合成有機(jī)硒成本高且技術(shù)難度大，因此生物轉(zhuǎn)化法是目前最常用的有機(jī)硒合成方法，其中以微生物作為載體研究和運(yùn)用最多的是富硒酵母[6]。納豆是大豆經(jīng)納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)發(fā)酵而形成的一種豆制品，具有預(yù)防中風(fēng)、心臟病、骨質(zhì)疏松、肥胖癥及由病原菌引起的消化道疾病等的作用[7]。納豆芽孢桿菌作為枯草芽孢桿菌的亞種，其本身具有良好的耐硒能力，可成為一種新型的有機(jī)硒微生物轉(zhuǎn)化載體，具有非常廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景，而使用納豆菌誘變選育富硒載體的相關(guān)研究較少。

常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)誘變具有操作簡(jiǎn)單、誘變效果好、成功率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，是常用的微生物誘變技術(shù)[8]。研究旨在利用ARTP對(duì)納豆芽孢桿菌BSN424進(jìn)行誘變，以期建立ARTP誘變和篩選富硒納豆芽孢桿菌的方法，并對(duì)突變菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，最終獲得硒轉(zhuǎn)化率較高、遺傳穩(wěn)定性較好的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌種

誘變出發(fā)菌株為一株納豆芽孢桿菌，編號(hào)為BSN424，由北京工商大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室從納豆粉中分離得到。

1.1.2培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，去離子水1 000 mL，瓊脂粉15 g/L，pH值7.0。121 ℃滅菌15 min。

改良大豆蛋白胨培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，大豆蛋白胨10 g，七水合硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀2.3 g，無水氯化鈣0.1 g，十二水合磷酸氫二鈉1.26 g，去離子水1 000 mL，自然pH值。115 ℃滅菌15 min。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑

酵母浸粉，英國(guó)Oxoid公司；蛋白胨、大豆蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉，北京康倍斯科技有限公司，以上均為生物試劑。分析純?cè)噭┢咸烟恰⒙然c、七水合硫酸鎂、磷酸二氫鉀、無水氯化鈣、十二水合磷酸氫二鈉、亞硒酸鈉、氫氧化鈉及優(yōu)級(jí)純?cè)噭┻^氧化氫(體積分?jǐn)?shù)30%)、鹽酸、硝酸、硼氫化鉀，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ARTP誘變系統(tǒng)，北京思清源生物科技有限公司；LC- AFS6500型液相色譜原子熒光聯(lián)用儀，北京海光儀器有限公司；Mars 6型微波消解儀，美國(guó)CEM公司；EHD- 40型電熱消解儀，北京東航科儀儀器有限公司；Ecotron型恒溫震蕩培養(yǎng)箱，瑞士INFORS公司；Infinite M200型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌種活化

從凍藏的BSN424菌株保藏管中蘸取一環(huán)菌液，劃線涂布于LB固體培養(yǎng)基。37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后，挑取培養(yǎng)基上的單菌落接種于含4 mL改良大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基的搖菌管中， 37 ℃、220 r/min條件下恒溫培養(yǎng)12 h。取400 μL菌液轉(zhuǎn)接到含40 mL改良大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，37 ℃、220 r/min條件下恒溫培養(yǎng)12 h，得到活化二代的種子液，備用。

1.3.2納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

通過測(cè)定納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線，確定適宜的培養(yǎng)時(shí)間和加硒時(shí)間。種子液以1%的接種量接入到改良大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶中裝液量為100 mL。37 ℃、220 r/min培養(yǎng)，每隔2 h取樣，采用比濁法，測(cè)定納豆芽孢桿菌的OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.3適宜硒質(zhì)量濃度的選擇

將活化好的種子液以1%的接種量分別接種于硒質(zhì)量濃度不同(0、2、4、6、8、10、12、14 μg/mL)的改良大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，8 000 r/min離心5 min，觀察菌體顏色變化，確定最適加硒質(zhì)量濃度[9]。

1.3.4ARTP誘變

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中后期的納豆芽孢桿菌菌液離心收集，用生理鹽水洗滌2次后，稀釋成OD600值在0.6～0.8的菌懸液，取10 μL菌懸液滴加在載片上，涂布均勻后放入ARTP誘變系統(tǒng)中進(jìn)行誘變，誘變條件見表1。

表1 ARTP誘變條件

將經(jīng)過誘變處理后的載片置于裝有1 mL生理鹽水的1.5 mL離心管中，震蕩洗脫60 s左右，將洗脫后的菌懸液按10倍梯度稀釋6次，分別記為10-1～10-6。將10-4、10-5、10-6的稀釋菌懸液涂布在LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，每個(gè)梯度做3組平行實(shí)驗(yàn)，未經(jīng)誘變的載片作對(duì)照組，在相同條件下培養(yǎng)，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。通過平板菌落數(shù)來計(jì)算誘變致死率，并獲得致死率曲線，致死率的計(jì)算見式(1)[10]：

(1)

式(1)中，T為不經(jīng)誘變處理的對(duì)照組平板菌落數(shù)，CFU；M為經(jīng)誘變處理后的平板菌落數(shù)，CFU。

1.3.5硒含量的測(cè)定

采用氫化物發(fā)生- 原子熒光光譜儀(HG- AFS)檢測(cè)硒含量。HG- AFS是一種具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的分析儀器，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分析成本低、氣相干擾少、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[11]。檢測(cè)條件見表2。

1.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1 mg/mL亞硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(以硒元素含量計(jì))配制：準(zhǔn)確稱取亞硒酸鈉109.5 mg，用去離子水定容至50 mL，過濾除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配。取硒質(zhì)量濃度為1 mg/mL的亞硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次用1.2 mol/L HCl溶液稀釋至硒質(zhì)量濃度分別為200、160、120、80、40、20、10 ng/mL，用HG- AFS以表2條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液及空白對(duì)照的熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 HG- AFS檢測(cè)條件

1.3.5.2 培養(yǎng)基中初始硒含量測(cè)定

納豆芽孢桿菌富硒培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基中添加亞硒酸鈉溶液，迅速混勻，立即取樣1 mL，用1.2 mol/L HCl溶液稀釋10倍后，測(cè)定硒含量，即為培養(yǎng)過程中添加亞硒酸鈉溶液時(shí)培養(yǎng)基中的初始硒含量。

1.3.5.3 發(fā)酵上清液中殘留硒含量測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液以10 000 r/min離心10 min，并吸取1 mL上清液加入微波消解消化管中，再加入4 mL硝酸和1 mL 30%過氧化氫溶液，根據(jù)GB 14880—2012以表3條件進(jìn)行消化處理[12]。

表3 微波消解條件

消解結(jié)束后，于趕酸儀上加熱至管中液體體積剩余1 mL左右，冷卻后加入4 mL 濃鹽酸，再次加熱至管中液體體積剩余1 mL左右，將六價(jià)硒還原成四價(jià)硒，冷卻。用1.2 mol/L HCl溶液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容，混勻，測(cè)定硒含量，即為發(fā)酵上清液中殘留硒含量。

1.3.5.4 菌體培養(yǎng)物中硒含量測(cè)定

發(fā)酵液以10 000 r/min離心10 min，棄去上清液，獲得菌體培養(yǎng)物，用磷酸鹽緩沖液反復(fù)洗滌3次，以去除附著于細(xì)胞表面的硒化合物，冷凍干燥后，保存?zhèn)溆肹13]。

準(zhǔn)確稱取10 mg菌體凍干粉末，加入微波消解消化管中，消解后測(cè)定菌體培養(yǎng)物中的硒含量。

1.3.6突變菌株耐硒能力測(cè)定

隨機(jī)挑取經(jīng)ARTP誘變后的LB固體培養(yǎng)基上的單菌落于每孔含有1 mL改良大豆蛋白胨培養(yǎng)基(硒質(zhì)量濃度6 μg/mL)的96孔深孔板中，每塊孔板接種93株突變菌株，3株出發(fā)菌株BSN424，共10塊板。930株突變菌株于振蕩培養(yǎng)箱中37 ℃、220 r/min恒溫培養(yǎng)24 h后，觀察菌液顏色變化情況，挑選顏色較淺菌株并使用酶標(biāo)儀測(cè)定菌懸液OD600值。

1.3.7突變菌株復(fù)篩

將挑選出的耐硒能力較強(qiáng)的菌株接種于含適宜硒質(zhì)量濃度的改良大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶中裝液量為100 mL，37 ℃、220 r/min條件下富硒培養(yǎng)24 h后，測(cè)定其硒轉(zhuǎn)化率和富硒量，計(jì)算見式(2)、式(3)[14]。

(2)

(3)

式(2)、式(3)中，m0為菌體細(xì)胞內(nèi)硒質(zhì)量，μg；m1為添加的總硒質(zhì)量，μg；m2為菌體細(xì)胞干質(zhì)量，μg；ρ0為培養(yǎng)基初始硒質(zhì)量濃度，μg/mL；ρ1為發(fā)酵上清液硒質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.3.8突變菌株遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

將復(fù)篩后富硒能力較高的突變株在LB固體培養(yǎng)基上連續(xù)7代傳代培養(yǎng)，并將各代分別進(jìn)行相應(yīng)種子液的制備以及改良大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng)，通過比較突變菌株的富硒量來測(cè)定突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin Pro 2019軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時(shí)間及加硒時(shí)間的確定

納豆芽孢桿菌BSN424生長(zhǎng)曲線如圖1。培養(yǎng)3 h后，菌體開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期；培養(yǎng)24 h后，菌體開始降解。由于亞硒酸鈉對(duì)菌體生長(zhǎng)有抑制作用，加硒時(shí)間不宜過早，而在對(duì)數(shù)期，菌體生長(zhǎng)代謝旺盛，硒轉(zhuǎn)化率高。Yin等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期添加無機(jī)硒，所得酵母細(xì)胞生物量、總硒含量及有機(jī)硒比例最高。靳志強(qiáng)等[16]研究也發(fā)現(xiàn)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期添加亞硒酸鈉得到的菌體，其總硒含量及硒轉(zhuǎn)化率均最大。故從菌體生長(zhǎng)及硒轉(zhuǎn)化率方面考慮，選擇在納豆芽孢桿菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期添加無機(jī)硒，即在培養(yǎng)3 h后添加亞硒酸鈉溶液，培養(yǎng)24 h。

圖1 納豆芽孢桿菌BSN424生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus natto BSN424

2.2 培養(yǎng)基中適宜硒質(zhì)量濃度的確定

納豆芽孢桿菌在一定硒質(zhì)量濃度條件下可將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，但當(dāng)環(huán)境中硒含量過高時(shí)，菌體會(huì)把大量的無機(jī)硒還原為紅色的單質(zhì)硒，故使菌體呈現(xiàn)出不同程度的紅色[17]。納豆芽孢桿菌BSN424在不同硒質(zhì)量濃度條件下的菌體顏色見表4。如表4所示，在設(shè)定的硒質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，菌體顏色變紅程度與培養(yǎng)基中硒質(zhì)量濃度成正相關(guān)。硒質(zhì)量濃度在6 μg/mL時(shí)菌體顏色變化不明顯，低于6 μg/mL時(shí)顏色沒有變化，說明培養(yǎng)基中硒質(zhì)量濃度超過6 μg/mL時(shí)會(huì)使其在細(xì)胞內(nèi)大量轉(zhuǎn)化為紅色的硒單質(zhì)。為了減少單質(zhì)硒的轉(zhuǎn)化，使更多的無機(jī)硒在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，選擇6 μg/mL作為培養(yǎng)基的適宜硒質(zhì)量濃度。

2.3 ARTP誘變適宜照射時(shí)間的確定

誘變處理后根據(jù)納豆芽孢桿菌致死率繪制致死率曲線，如圖2。由圖2可知，誘變致死率隨照射時(shí)間增加而增大，照射20 s時(shí)可殺死90%的菌體；當(dāng)照射時(shí)間達(dá)到60 s時(shí)，誘變致死率已達(dá)到100%。由現(xiàn)代育種理論可知，誘變致死率在90%～95%時(shí)正向突變率最高。因此實(shí)驗(yàn)選擇的適宜誘變時(shí)間為25 s，致死率為94.3%。

2.4 突變菌株耐硒篩選結(jié)果

利用含亞硒酸鈉抗性培養(yǎng)基的96孔深孔板培養(yǎng)突變菌株，并通過菌懸液OD600值和菌體顏色變化篩選突變菌株。通過對(duì)比誘變出發(fā)菌株與誘變菌株的菌體顏色，挑選出在6 μg/mL硒質(zhì)量濃度下轉(zhuǎn)化單質(zhì)硒較少的菌株，同時(shí)再對(duì)比菌懸液的OD600值，以挑選出生長(zhǎng)較好的突變菌株。經(jīng)對(duì)比，初篩共挑選出64株耐硒誘變菌株。

表4 納豆芽孢桿菌BSN424在不同硒質(zhì)量濃度下培養(yǎng)24 h后菌體顏色變化

2.5 突變菌株富硒篩選結(jié)果

2.5.1硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

HG- AFS測(cè)定的硒質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=90.505 3X+295.939 6，R2=0.999 44。

2.5.2突變菌株富硒能力分析

2.5.2.1 突變菌株的硒轉(zhuǎn)化率

出發(fā)菌株BSN424及64株初篩得到的耐硒誘變菌株經(jīng)搖瓶富硒發(fā)酵后測(cè)定的硒轉(zhuǎn)化率見圖4。

由圖4可知，誘變出發(fā)菌株BSN424的硒轉(zhuǎn)化率為21.8%，共有34株突變菌株的硒轉(zhuǎn)化率高于出發(fā)菌株， 其中硒轉(zhuǎn)化率最高的突變菌株編號(hào)為BN- I214，硒轉(zhuǎn)化率達(dá)到37.8%，比誘變出發(fā)菌株高出了16%。

圖2 不同照射時(shí)間下ARTP誘變致死率曲線Fig.2 ARTP mutagenic lethal rate curve with different treatment time

圖3 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of selenium

圖4 突變菌株搖瓶復(fù)篩后的硒轉(zhuǎn)化率Fig.4 Selenium conversion rate of mutagenic strains after shake flask screening

2.5.2.2 突變菌株的富硒量

挑選突變菌株中硒轉(zhuǎn)化率最高的6株突變菌株：BN- I214、BN- 41、BN- 83、BN- I512、BN- 44、BN- 1111及誘變出發(fā)菌株BSN424，分別測(cè)定其搖瓶富硒發(fā)酵后的富硒量，見圖5。

圖5 突變菌株搖瓶復(fù)篩后富硒量Fig.5 Selenium content of mutagenic strains after shake flask screening

由圖5可知，誘變出發(fā)菌株BSN424的搖瓶發(fā)酵富硒量為742.12 μg/g，6株突變菌株的富硒量均大于誘變出發(fā)菌株，說明以硒轉(zhuǎn)化率作為篩選富硒納豆芽孢桿菌的依據(jù)是可行的，其中突變菌株BN- 44的富硒量最高，達(dá)1 136.43 μg/g，比出發(fā)菌株提高了53.13%。

2.6 突變菌株遺傳穩(wěn)定性分析

用LB固體培養(yǎng)基分別將富硒量較高的突變菌株(BN- I214、BN- 41、BN- 44)傳代7代，將各代菌株制成種子液后接種到改良大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基進(jìn)行富硒搖瓶發(fā)酵，測(cè)定富硒量，結(jié)果見圖6。

圖6 突變菌株遺傳穩(wěn)定性Fig.6 Genetic stability of mutagenic strains

由圖6可知，經(jīng)ARTP誘變的3株突變菌株經(jīng)傳代7代后富硒量沒有明顯的下降，均具有較好的遺傳穩(wěn)定性，其中BN- 44富硒量最高。因此，綜合考慮選擇BN- 44菌株作為最終篩選得到的納豆芽孢桿菌富硒誘變菌株。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)通過對(duì)納豆芽孢桿菌BSN424生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，確定適宜加硒時(shí)間為培養(yǎng)后第3小時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為24 h；通過適宜硒質(zhì)量濃度的選擇，確定富硒培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中適宜硒質(zhì)量濃度為6 μg/mL。研究表明ARTP誘變育種方法能有效地對(duì)納豆芽孢桿菌BSN424進(jìn)行誘變，適宜誘變時(shí)間為25 s，經(jīng)耐硒能力、富硒能力及富硒量的測(cè)定，篩選出一株富硒納豆芽孢桿菌BN- 44，富硒量為1 136.43 μg/g，相比出發(fā)菌株的742.12 μg/g提高了53.13%，具有較強(qiáng)的富硒能力。本實(shí)驗(yàn)以期為有機(jī)硒生物轉(zhuǎn)化法中尋找益生菌富硒載體及其誘變育種提供一定依據(jù)，但突變菌株BN- 44富硒量提高的原理尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究。