王 暉， 蒲 葉， 李霽陽， 殷 嫻， 廖永紅

(北京工商大學(xué) 輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院/中國輕工業(yè)清潔生產(chǎn)和資源綜合利用重點實驗室， 北京 100048)

窖泥是傳統(tǒng)固態(tài)法白酒發(fā)酵的基礎(chǔ)[1]，窖泥中含有數(shù)量龐大、種類復(fù)雜的微生物菌群，部分微生物在發(fā)酵過程中進(jìn)入白酒糟醅中繁殖和代謝，產(chǎn)生復(fù)雜多樣的代謝產(chǎn)物，形成種類豐富的風(fēng)味物質(zhì)，影響白酒風(fēng)格和品質(zhì)。乳酸菌是窖泥主要細(xì)菌類別之一，是固態(tài)法白酒發(fā)酵過程中的重要功能菌群[2]。乳酸菌可產(chǎn)生有機酸，降低發(fā)酵體系pH值，為酵母菌提供適宜的生長環(huán)境，抑制雜菌生長，利于白酒發(fā)酵及保持釀酒微生態(tài)環(huán)境[2-4]。乳酸菌的主要代謝產(chǎn)物乳酸有調(diào)和酒味的緩沖功能。乳酸與酒精發(fā)生酯化反應(yīng)形成的乳酸乙酯，具有減少酒體刺激感、增加酒體回甜感和濃厚度，延長白酒后味的作用，但含量過多則口感變差[5]；此外，乳酸菌可通過產(chǎn)生細(xì)菌素等拮抗物質(zhì)[6]以及與其他微生物競爭底物[7]等方式影響發(fā)酵體系中其他微生物的生長代謝，調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的菌群結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控整個發(fā)酵過程。適量的乳酸菌對白酒風(fēng)味起到較好的作用，影響白酒的香型和風(fēng)格。對窖泥中乳酸菌及其代謝產(chǎn)物的研究，將有助于白酒釀造功能微生物菌種資源的開發(fā)及應(yīng)用。目前，對白酒釀造乳酸菌雖有不少研究，但是主要集中在乳酸菌產(chǎn)乳酸對發(fā)酵的影響，以及乳酸菌的分離鑒定及其群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析等方面，對具體菌株發(fā)酵產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)特性方面的研究還少有報道。

本研究擬對白酒窖泥中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，在研究其產(chǎn)乳酸情況基礎(chǔ)上，對短乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌和鉛黃腸球菌發(fā)酵產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，旨在了解窖泥中乳酸菌的存在屬性和代謝特性，探索白酒釀造中通過調(diào)節(jié)乳酸菌優(yōu)化發(fā)酵和提升白酒品質(zhì)的可能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗樣品

窖泥由四川某白酒企業(yè)提供，分離所得菌種由本實驗室冷藏保存。

1.1.2主要培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉粉5 g/L，酵母粉4 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，吐溫80 1 mL/L，自然pH值。固態(tài)培養(yǎng)基加入1.5%～2.0%的瓊脂，121 ℃滅菌15 min。

乳酸菌篩選培養(yǎng)基：在MRS固體培養(yǎng)基中加入0.04%溴甲酚綠，自然pH值,121 ℃滅菌15 min。

高粱培養(yǎng)液：稱取10 g高粱(粉碎)于錐形瓶中，用適量蒸餾水潤濕后加入熱水(蒸餾水總體積為100 mL)，并在熱水浴中糊化30 min。按照50 U/g加入α淀粉酶，70 ℃液化20 min，冷卻后，按600 U/g加入糖化酶，40 ℃糖化1 h，121 ℃滅菌20 min。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HVA- 110型高壓滅菌鍋，日本Hirayama公司；HZQ- F160型全溫培養(yǎng)箱，太倉市實驗設(shè)備廠；SQP型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；CX31RBSFA型光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；Infinite 200 pro型酶標(biāo)儀，澳大利亞Tecan 公司；SBA- 40E型生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；7890B- 5977A型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；PHS- 3D型pH計, 上海精科實驗設(shè)備有限公司；S1000TMthermal cycler型PCR儀，新加坡BIO- RAD公司；DYY- 6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；BioSpectrum 510型凝膠成像儀，美國UVP公司；DHG- 9246A型恒溫干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；KQ5200DE型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；TGL- 20bR型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1乳酸菌分離純化

將窖泥樣品用生理鹽水梯度稀釋后涂布于乳酸菌篩選培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)2～3 d。挑選底部及周圍變黃的單菌落，在MRS平板上重復(fù)劃線分離菌株，單菌落純化菌株用甘油管保藏備用。

1.3.2乳酸菌鑒定

1.3.2.1 形態(tài)學(xué)特征鑒定[8]

對乳酸菌菌落特征、細(xì)胞特征進(jìn)行鑒定，并對其進(jìn)行革蘭氏染色觀察。

1.3.2.2 分子生物學(xué)鑒定[9]

1)DNA提取。細(xì)菌基因組DNA用試劑盒(天根生物有限公司)提取。

2)16S rDNA 的PCR 擴增及測序。根據(jù)細(xì)菌的16S rDNA 基因序列的保守區(qū)域，利用上游引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA-3′)和下游引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，以各菌株基因組為模板進(jìn)行PCR擴增，擴增片段長度約1 500 bp。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：10×buffer 5 μL，三磷酸脫氧核糖核苷(deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP) 1 μL，上游引物(10 μmol/L) 1 μL，下游引物(10 μmol/L) 1 μL， TaqDNA聚合酶(50 U/μL) 0.5 μL，DNA模板100 ng，超純水40 μL。PCR擴增條件為：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s，28個循環(huán)；72 ℃，90 s；72 ℃，10 min。對該擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗證，并將達(dá)到測序要求的擴增產(chǎn)物測序。

3)分離菌株16S rDNA的同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。將菌株測序結(jié)果輸入NCBI數(shù)據(jù)庫，利用Blast進(jìn)行序列比對，找到與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌株；用軟件MEGA7.0中的鄰接法(neighbor-joining method)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.3.3種子液制備

將純化菌株涂布于平板，37 ℃倒置培養(yǎng)2 d活化菌株，取1環(huán)接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h作為種子液，按相同細(xì)胞濃度定容待用。

1.3.4產(chǎn)乳酸發(fā)酵實驗

取1.3.3中的種子液，以5%接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置發(fā)酵36 h，0～24 h每隔2 h取樣，24～36 h每隔4 h取樣，每株菌共計16個取樣點，每個樣3次實驗。測定發(fā)酵液OD600值、乳酸含量和pH值，繪制菌株0～36 h生長曲線和產(chǎn)乳酸曲線。

生長曲線測定：吸取200 μL樣品至96孔板，使用酶標(biāo)儀測定600 nm處吸光值，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

乳酸含量測定：利用生物傳感分析儀測定乳酸含量。計算方法見式(1)。

樣品乳酸含量=樣品測定值×稀釋倍數(shù)。

(1)

1.3.5高粱培養(yǎng)液發(fā)酵實驗

以5%接種量將1.3.3中的種子液接種至高粱培養(yǎng)液中，37 ℃靜置發(fā)酵5 d，取發(fā)酵液作為后續(xù)分析樣品。

1.3.6發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)組分測定

采用SPME- GC- MS方法測定1.3.5中發(fā)酵5 d樣品的可揮發(fā)性風(fēng)味成分。

固相微萃取條件：選用65 μm PDMS/DVB萃取頭，在20 mL頂空瓶中加入4 mL發(fā)酵液樣品和1.5 g NaCl，60 ℃預(yù)熱10 min，插入萃取頭，萃取吸附30 min，GC解吸5 min(250 ℃)。

色譜條件：色譜柱為DB- Wax毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。升溫程序：35 ℃保持4 min，以5 ℃/min的速度升溫至150 ℃，恒溫保持4 min，然后以3 ℃/min的速度升溫至220 ℃，保持5 min。載氣He，流速1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z35～500 u。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌分離純化及形態(tài)特征分析

按照1.3.1的方法，從窖泥原料中分離純化菌株，其中11株菌株，菌落呈圓形、中等大小、凸起，微白色、濕潤，邊緣整齊，革蘭氏染色陽性，不運動、不產(chǎn)生孢子。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征可初步確定菌株為乳酸菌，依次命名為L1至L11，菌落圖及鏡檢圖見圖1(a)和圖1(b)。利用16S rDNA測序鑒定菌株的種屬，結(jié)果見表1和圖2。

2.2 乳酸菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

菌株16S rDNA序列經(jīng) NCBI序列比對及同源性分析，得最相似的物種名、相似率及其登錄號(表1)，再利用 MEGA7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。

由表1和圖2可知，鑒定窖泥分離得到的11株乳酸菌為：腸球菌屬中的鉛黃腸球菌(Enterococcuscasseliflavus)7株和乳桿菌屬中的短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)1株、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)1株和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)2株。

2.3 乳酸菌生長特性分析

按照1.3.4的方法得乳酸菌生長曲線，如圖3。由圖3可知，11株菌生長情況由下到上可分為3部分：菌株L1、L2、L3、L4、L6、L7、L8的OD600較低，0～4 h時為菌株的生長延滯期，4～10 h為菌株對數(shù)生長期，12 h時OD600最高，達(dá)0.43～0.48，此后進(jìn)入穩(wěn)定期，16 h后OD600有下降趨勢，進(jìn)入衰亡期；菌株L5的OD600居中，0～4 h為生長延滯期，4～24 h為對數(shù)生長期，24～36 h為穩(wěn)定期，OD600達(dá)0.77；菌株L9、L10、L11的OD600最高，0～4 h為生長延滯期，4～18 h為對數(shù)生長期，18 h時OD600分別為1.28、1.25和1.05，菌體濃度達(dá)到最高，此后逐步進(jìn)入穩(wěn)定期，36 h未見OD600有明顯下降。

2.4 乳酸菌產(chǎn)乳酸特性分析

按照1.3.4的方法，得11株菌產(chǎn)乳酸特征實驗結(jié)果，見圖4。菌株產(chǎn)乳酸情況可分為兩大類：1) L1至L8菌株，4 h后產(chǎn)乳酸速度明顯增快，14 h乳酸質(zhì)量濃度為3.5～4.5 g/L，24 h發(fā)酵液乳酸質(zhì)量濃度達(dá)到最高(4.5～5.5 g/L)，pH 值4.7～4.8，24～36 h曲線平緩，乳酸含量無明顯增多；2) L9、L10、L11菌株，4 h后產(chǎn)乳酸速度加快，乳酸含量明顯高于第一類菌，14 h時乳酸含量均大于6 g/L，28 h左右產(chǎn)乳酸速度減緩，穩(wěn)定至36 h，發(fā)酵液乳酸含量最高，分別達(dá)15.74 、15.58、14.74 g/L，明顯優(yōu)于其余8株菌，其乳酸含量高出2倍。文獻(xiàn)報道，干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)發(fā)酵MRS肉湯培養(yǎng)基72 h，乳酸質(zhì)量濃度為(25.231±0.121) g/L[10]，凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)發(fā)酵蔗糖培養(yǎng)基72 h，乳酸質(zhì)量濃度為20 g/L[11]。本窖泥乳酸菌產(chǎn)乳酸量與文獻(xiàn)報道結(jié)果相比較低，最終pH值為3.7～3.8，比腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconostocmesenteroides)豆清發(fā)酵20 h時pH值(4.16)[12]更低。

圖1 11株乳酸菌形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of 11 strains of lactic acid bacteria

表1 11株乳酸菌16S rDNA序列Blast比對結(jié)果

圖2 11株乳酸菌系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of 11 strains of lactic acid bacteria

2.5 乳酸菌發(fā)酵高粱培養(yǎng)液產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)分析

選取L5、L8、L9和L11菌株，按照1.3.5方法進(jìn)行高粱培養(yǎng)液發(fā)酵。第5天采用固相微萃取- 氣質(zhì)聯(lián)用(SPME- GC- MS) 法，按1.3.6方法測發(fā)酵液可揮發(fā)性風(fēng)味組分，風(fēng)味物質(zhì)總離子流圖見圖5。圖譜經(jīng)NIST 14譜庫檢索及相關(guān)資料分析，4株菌的可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及相對含量如表2，各菌產(chǎn)生酸類、醇類、酯類、酮類、吡嗪類、芳香族類和烷烴類風(fēng)味物質(zhì)的種類和相對含量的分析結(jié)果見圖6和圖7。

圖3 11株乳酸菌生長曲線Fig.3 Growth curve of 11 strains of lactic acid bacteria

圖4 11株乳酸菌產(chǎn)乳酸特性分析Fig.4 Analysis of lactic acid production characteristics of 11 strains of lactic acid bacteria

圖5 菌株發(fā)酵液風(fēng)味物質(zhì)總離子流圖Fig.5 Total ion current chromatogram of flavor compounds from fermentation liquid of strains

圖6 4株菌發(fā)酵液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量比較Fig.6 Comparison of quantity of volatile flavor substances in fermentation liquid of 4 strains

圖7 4株菌發(fā)酵液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量比較Fig.7 Comparison of content of volatile flavor substances in fermentation liquid of 4 strains

由表2可知，4株乳酸菌的發(fā)酵液中共檢測出52種可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括酸類7種、醇類10種、酯類5種、酮類3種、吡嗪類4種、芳香族6種、烷烴類17種，這與白酒中常見的呈香呈味化合物種類相符[13]。乙酸、2-甲基己酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、乙酸苯乙酯、十六酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、苯甲醛、四甲基吡嗪在酒中均有檢出[14]。菌株L5、L8、L9和L11檢測出的可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量分別為35、34、28和22種，相對含量總量分別為78.67%、81.86%、63.65%和56.1%。乙酸、己酸、辛酸、壬酸、正辛醇、乙酸苯乙酯、十六酸乙酯、苯乙醇、2，3-二氫苯并呋喃、2，6，10-三甲基十二烷、十四烷、正十五烷、正十六烷等13種可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為4株菌共有，其中乙酸、己酸、乙酸苯乙酯和苯乙醇是白酒中的重要香氣成分。乙酸、己酸是共有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中相對含量最高的兩種物質(zhì)，菌株L9和L11產(chǎn)生乙酸為10.54%和10.86%，產(chǎn)己酸為11.94%和8.56%。乙酸、丁酸、乳酸、己酸是濃香型白酒中的四大酸，占酒體總酸含量 90%以上[15]。適量的乙酸能使白酒有爽快感，適量己酸能增加酒的豐滿感，在白酒中有呈味助香作用，且乙酸、己酸分別可與乙醇形成乙酸乙酯和己酸乙酯[13,15-16]，二者對白酒的香型和風(fēng)格有重要影響。

表2 L5、L8、L9和L11乳酸菌發(fā)酵液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

“-”代表未檢出。

據(jù)報道，乙酸苯乙酯是牛欄山二鍋頭白酒中重要的香氣成分，可由扣囊復(fù)膜酵母代謝產(chǎn)生[17]。苯乙醇具有柔和、愉快而持久的玫瑰香氣，可增加酒的醇厚感[18]，錢沖等[19]在研究不同香型白酒的聚類分析和主成分分析時發(fā)現(xiàn)，苯乙醇是芝麻香型白酒的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。本研究中4株菌產(chǎn)生乙酸苯乙酯的相對含量為0.2%～1.5%，產(chǎn)生苯乙醇的相對含量為0.7%～3.0%，可對白酒香氣產(chǎn)生一定影響。

除共有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)外，L5和L8產(chǎn)生相對含量為32.86%和40.41%的乙醇。L5產(chǎn)生微量的四甲基吡嗪(相對含量0.16%)，有研究報道該物質(zhì)是醬香型白酒的特征風(fēng)味成分，具有擴張血管、改善血循環(huán)、護肝等對人體有益的功能，被認(rèn)為是白酒中的主要功能性成分之一，在不同香型白酒中普遍存在[20-21]。在L9和L11發(fā)酵液中檢測到少量3-羥基-2-丁酮(相對含量為2.22%和1.47%)。3-羥基-2-丁酮是四甲基吡嗪的前體物質(zhì)[22]，該物質(zhì)稍有糟香，并有類似蜂蜜樣的甜味，是酒中重要的芳香成分，在名優(yōu)白酒中含量尤為重要[13]。吳樹坤等[23]在研究沉香型酒醅中產(chǎn)香芽孢桿菌代謝產(chǎn)物時發(fā)現(xiàn)，3-羥基-2-丁酮是其優(yōu)勢產(chǎn)物之一。可見4株菌代謝產(chǎn)生的可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)可對白酒的風(fēng)味和口感起重要作用。

由圖6可知，除L5不產(chǎn)生酮類物質(zhì)外，4株菌發(fā)酵液均產(chǎn)生酸類、醇類、酯類、酮類、吡嗪類、芳香族類和烷烴類化合物，且除L5和L8分別產(chǎn)生15和10種烷烴類物質(zhì)外，其余各類可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的化合物種類均為1～6種。

由圖7可知，4株菌發(fā)酵液產(chǎn)生的酸類、醇類、酯類、酮類、吡嗪類、芳香族類和烷烴類化合物相對含量差別較為明顯。4株菌中L5產(chǎn)烷烴能力最強，其發(fā)酵液中烷烴類物質(zhì)的相對含量占總量的27.91%，分別是L11、L9、L8發(fā)酵液的3.36、2.97和1.81倍。L8產(chǎn)醇能力最強，其發(fā)酵液中醇類物質(zhì)的相對含量占總量的43.14%(其中乙醇高達(dá)40.41%)，分別是L11、L9、L5發(fā)酵液的7.07、4.72和1.23倍。L9產(chǎn)酯、產(chǎn)酮及產(chǎn)吡嗪能力最強，其發(fā)酵液中酯類物質(zhì)的相對含量占總量的7.35%，分別是L5、L8、L11發(fā)酵液的4.32、2.98和1.89倍；酮類物質(zhì)的相對含量占總量的3.61%，分別是L8、L11發(fā)酵液的11.65和2.46倍；吡嗪類物質(zhì)的相對含量占總量的3.3%，分別是L5、L8、L11發(fā)酵液的2.50、1.45和1.03倍。L11產(chǎn)酸和產(chǎn)芳香族類化合物能力最強，其發(fā)酵液中酸類物質(zhì)的相對含量占總量的27.98%，分別是L5、L8、L9發(fā)酵液的2.50、1.81和1.11倍；芳香族類物質(zhì)的相對含量占總量的5.96%，分別是L5、L8、L9發(fā)酵液的3.97、2.14和1.05倍。

3 結(jié) 論

從窖泥中分離得到11株乳酸菌，經(jīng)16S rDNA鑒定，分別為7株腸球菌屬(Enterococcus)菌株和4株乳桿菌屬(Lactobacillus)菌株。菌體生長代謝與產(chǎn)乳酸能力呈正相關(guān)，與文獻(xiàn)報道的結(jié)論一致[12，24]。各菌生長性能不同，產(chǎn)乳酸能力不同，鼠李糖乳桿菌和2株干酪乳桿菌產(chǎn)乳酸量明顯優(yōu)于獲得的其余乳酸菌，發(fā)酵36 h乳酸質(zhì)量濃度分別達(dá)到15.74、15.58、14.74 g/L，pH值為3.7～3.8。采用固相微萃取和GC- MS法分析L5、L8、L9和L11菌株發(fā)酵高粱培養(yǎng)液產(chǎn)可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，可知，4類乳酸菌都產(chǎn)生酸類、醇類、酯類、吡嗪類、芳香族化合物等物質(zhì)，但每類物質(zhì)所含組分物質(zhì)各不相同，且相對含量差異明顯。短乳桿菌、鉛黃腸球菌、鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌分別產(chǎn)烷烴類，醇類，酯類、酮類和吡嗪類，酸類和芳香類化合物能力較強。產(chǎn)生的13種共有物質(zhì)中，乙酸、己酸、乙酸苯乙酯和苯乙醇是白酒中的重要香氣成分，其中乙酸、己酸相對含量較高。研究發(fā)現(xiàn)，僅短乳桿菌產(chǎn)生四甲基吡嗪，短乳桿菌和鉛黃腸球菌明顯產(chǎn)生乙醇，鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌產(chǎn)生3-羥基-2-丁酮，這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對白酒風(fēng)味和口感有重要影響。

本研究顯示，窖泥中含有不同種類的乳酸菌，各菌生長及產(chǎn)乳酸性能不同；不同菌株可不同程度產(chǎn)生與白酒中常見呈香、呈味物質(zhì)種類相同的酸類、醇類、酯類、酮類、吡嗪類、芳香族類和烷烴類化合物，并可產(chǎn)生多種對白酒香氣有重要影響的風(fēng)味物質(zhì)。希望本研究結(jié)果可為進(jìn)一步挖掘白酒釀造功能微生物，拓展乳酸菌的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。乳酸菌在白酒發(fā)酵過程中的增酸應(yīng)用潛力和對風(fēng)味組分的影響作用需要繼續(xù)研究。