米 佳， 楊雪蓮， 祿 璐， 羅 青， 張志娟， 李曉鶯，閆亞美，*， 曹有龍

(1.寧夏農(nóng)林科學院 枸杞工程技術研究所， 寧夏 銀川 750002；2.北方民族大學 生命學院， 寧夏 銀川 750004)

蜂花粉是由蜜蜂采集植物花粉，加人一些花蜜和唾液發(fā)酵而成的花粉團[1]。蜂花粉是最完美的全營養(yǎng)食品之一，富含蛋白質(zhì)，包含了人體所需的全部必需氨基酸，此外還有碳水化合物、脂質(zhì)、糖類、纖維素、維生素和礦物質(zhì)[2]?，F(xiàn)代研究表明，蜂花粉具有抗氧化[3]、抗菌[4]、增強免疫[5]、抗過敏[6]等多種功效。枸杞蜂花粉中可溶性糖質(zhì)量分數(shù)為44.8%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為25.0%，每克枸杞蜂花粉中含有總多酚22.95 mg沒食子酸當量，總黃酮21.17 mg蘆丁當量[7]，氨基酸總質(zhì)量分數(shù)為21.62%～22.08%[8]。已報道枸杞蜂花粉醇提物有一定抑制前列腺增生的作用[9]，枸杞蜂花粉多糖能夠顯著促進短鏈脂肪酸的產(chǎn)生并調(diào)節(jié)腸道菌群[10]，能夠很好地抑制前列腺癌DU145細胞的增殖[11]，但關于枸杞蜂花粉多糖的提取工藝報道極少。

枸杞蜂花粉的多糖具有潛在的生物活性，為了進一步研究枸杞蜂花粉多糖，選擇高效的提取方法尤為重要，但相關研究報道鮮見。花粉多糖一般采用熱水提取、乙醇沉淀的方法獲得[12-14]，本文采用傳統(tǒng)的水提醇沉法優(yōu)化枸杞蜂花粉多糖的超聲波輔助提取工藝，并考察其抗氧化活性，為枸杞蜂花粉多糖的功效研究和產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞蜂花粉，收集于寧夏銀川市園林場枸杞基地；葡萄糖(GC>99.5%)、ABTS(HPLC≥98%)、TPTZ(HPLC≥98%)，美國Sigma-Aldrich公司；DPPH(HPLC≥98%)，東京化成工業(yè)株式會社；維生素C(純度>99%)，北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

BS 224 S型分析天平，德國賽多利斯公司；TU1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Centrifuge 5810R型冷凍型臺式大容量高速離心機，德國艾本德公司；全數(shù)字超聲波發(fā)生器，武漢嘉鵬電子有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1枸杞蜂花粉多糖的提取

稱取一定量的枸杞蜂花粉粉碎，用80%乙醇除去色素，抽濾至干后加入一定體積的蒸餾水超聲提取，離心取上清液，加入4倍體積無水乙醇醇沉過夜，離心(4 000 r/min，10 min)后取沉淀即為粗多糖[15]。

1.3.2多糖含量的測定

以不同濃度的葡萄糖做標準曲線進行分析測定[16]。標準曲線方程為：y=1.174 6x-0.000 3(R2=0.999 3，線性范圍0～0.7 mg/mL)。同法測定枸杞蜂花粉粗多糖的含量，按標準曲線計算濃度，見式(1)。

多糖得率=(c×f×V)/m×100%，

(1)

式(1)中，c為測定樣液的質(zhì)量濃度,mg·mL-1；f為稀釋倍數(shù)；V為提取體積,mL；m為枸杞蜂花粉質(zhì)量,mg。

1.3.3單因素實驗

取一定量的花粉，除去色素后按下列條件進行單因素實驗：在溫度70 ℃、超聲功率300 W條件下，分別以料液比(g/mL)1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35提取30 min；以料液比(g/mL)1∶25，固定超聲功率300 W，分別在50、60、70、80、90 ℃溫度條件下提取30 min；以料液比(g/mL)1∶25，固定提取溫度70 ℃，分別在180、240、300、360、420 W的超聲功率條件下提取30 min；以料液比(g/mL)1∶25，在超聲功率300 W、提取溫度70 ℃條件下，分別提取10、20、30、40、50 min。每組實驗均平行3次，考察單因素對枸杞蜂花粉多糖提取得率的影響。

1.3.4響應面試驗設計

在單因素實驗的基礎上，選擇料液比、提取時間、提取溫度、超聲功率為自變量，以得率為響應值，根據(jù)Box-Behnken設計原理，采用四因素三水平響應面分析法進行試驗設計，優(yōu)化超聲提取枸杞蜂花粉多糖的提取工藝，因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平

1.3.5體外抗氧化活性測定

1.3.5.1 ABTS+自由基清除能力測定

參照文獻[17]方法，以不同濃度的維生素C對ABTS+自由基清除率做標準曲線，結果表示為每克干物質(zhì)的維生素C當量(μmol/mg)，見式(2)。

ABTS+自由基清除率=1-A1/A0×100%，

(2)

式(2)中，A0是對照的吸光度值(即以水代替樣品)，A1是樣品的吸光度值。

1.3.5.2 DPPH自由基清除能力測定

參考文獻[18]方法，以維生素C溶液清除DPPH自由基清除率作標準曲線，結果表示為每克干物質(zhì)的自由基當量(μmol/mg)，見式(3)。

DPPH自由基清除率=
(A加樣前-A加樣后)/A加樣前×100%。

(3)

1.3.5.3 FRAP值的確定

參考文獻[19]方法，以維生素C溶液作標準曲線，結果表示為每克干物質(zhì)的維生素C當量(μmol/mg)。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1 單因素實驗結果Fig.1 Results of single factor experiments

單因素對枸杞花粉多糖得率的影響如圖1。單因素實驗結果表明，隨著料液比的增加，枸杞蜂花粉多糖得率呈明顯的上升趨勢，當料液比達到1∶25時，多糖得率最高，但繼續(xù)提高料液比使多糖的得率下降(圖1(a))。當溫度在50～60 ℃時，枸杞蜂花粉多糖的得率增長不顯著，繼續(xù)升高提取溫度至90 ℃時，多糖得率不斷提高，且差異顯著(圖1(b))。超聲功率為180 W時的多糖得率最低，240 W時多糖得率最高，且與其他功率條件下的多糖得率差異顯著，但繼續(xù)增大超聲波的功率使得多糖得率降低(圖1(c))。在10～20 min的提取時間范圍內(nèi)，多糖得率呈上升趨勢，在20 min時達到最大，但差異不顯著，再延長超聲提取時間則使多糖得率迅速下降(圖1(d))。這是因為增大溶劑用量能使植物細胞和外部溶劑之間產(chǎn)生更大的濃度差，有利于多糖的迅速擴散和溶出，但較高的溶劑用量會導致原料的物質(zhì)分子間相互作用減弱[20]。高溫能夠提高傳質(zhì)速度且增加多糖的溶解度，同時對花粉細胞壁起到一定的破壞作用，利于多糖的浸出[21]。超聲波功率的增加能夠加快提取液的振動，對細胞壁的破壞力加大，有利于有效成分的浸出，提高了多糖得率；但超聲功率過大或者超聲時間過長會造成多糖的結構或性質(zhì)的改變，如降解為單糖等物質(zhì)，降低了多糖得率[12]。因此選擇料液比(g/mL)1∶20至1∶30，提取溫度85～95 ℃，超聲功率180～300 W，提取時間10～30 min，進行響應面試驗。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1Box-Behnken試驗設計及結果

根據(jù)單因素實驗結果，選取料液比、提取溫度、超聲功率和提取時間進行四因素三水平的Box-Behnken試驗設計，結果如表2。

2.2.2回歸模型有效性及顯著性分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2響應面方案及結果進行回歸擬合分析，對回歸模型進行方差分析，并檢驗回歸方程系數(shù)的顯著性，結果如表3。

分析建立的四因子數(shù)學回歸模型見式(4)。

Y=0.89-0.002 5A+0.023B+0.023C-0.007 5D-
0.007 5AB-0.005AC-0.01AD-0.005BC+
0.01BD+0.007 5CD-0.062A2-
0.057B2-0.097C2-0.072D2。

(4)

Y=0.89+0.023B+0.023C-0.0075D-
0.01AD-0.01BD-0.062A2-
0.057B2-0.097C2-0.072D2。

(5)

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

表3 Box-Behnken試驗結果方差分析

** 表示差異極顯著(P<0.01)；*表示差異顯著(P<0.05)。

2.2.3響應面分析

各因素交互作用對枸杞蜂花粉多糖得率的影響響應曲面分析結果見圖2。其中等高線的形狀可直觀地反映出交互效應的強弱，圓形表示2個因素間交互作用不顯著，橢圓形表示2個因素間交互作用顯著[22]。

圖2 各因素交互作用對枸杞蜂花粉多糖得率影響的響應面圖Fig.2 Response surface diagrams of interactive factors on yield of polysaccharides extracted from wolfberry bee pollen

由表3可知，料液比和超聲時間、超聲溫度和超聲時間的交互作用能顯著影響枸杞蜂花粉多糖的得率(P<0.05)。由圖2(a)響應面分析結果可知，當提取溫度為90 ℃，提取功率為240 W時，隨著料液比和提取時間水平的上升，多糖得率成緩慢上升趨勢，在料液比(g/mL)1∶24至1∶26、提取時間19～21 min內(nèi)，多糖的提取得率最高。如圖2(b)，當料液比為(g/mL)1∶25，提取功率為240 W時，隨著提取溫度和提取時間的上升，多糖提取得率迅速提高，當提取溫度為89～91 ℃，提取時間為19～21 min，多糖的得率最高。隨后，隨著提取溫度和提取時間的降低，多糖得率呈現(xiàn)下降趨勢。

2.2.4驗證實驗結果

通過回歸模型的分析，枸杞蜂花粉多糖的優(yōu)化提取工藝條件為料液比為(g/mL)1∶24.83、提取溫度為90.96 ℃、超聲功率為246.65 W、提取時間為19.85 min時，枸杞蜂花粉多糖得率最高，達0.90%?？紤]到實際操作方便，將工藝條件修正為料液比(g/mL)1∶25、超聲功率240 W、提取溫度90 ℃、提取時間20 min。在此條件下，枸杞蜂花粉多糖得率為0.89%～0.91%，實際值與理論值基本相符，說明該工藝條件穩(wěn)定可靠，具有可行性。

2.3 枸杞蜂花粉多糖的體外抗氧化活性分析

ABTS+自由基能夠被抗氧化劑提供的電子或氫原子滅活，使溶液發(fā)生顏色變化，再通過該變化檢測抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性[23]。維生素C濃度為50～300 μmol/L時與ABTS+自由基清除能力呈線性相關，線性方程為y=0.044 7x+0.438(R2=0.993 7)。計算得到枸杞蜂花粉多糖的ABTS+自由基清除力為(0.190±0.020) μmol/mg。DPPH自由基是一種較為穩(wěn)定的自由基，廣泛應用于抗氧化成分的抗氧化活性評價[24]。濃度為25～250 μmol/L的維生素C與DPPH自由基清除力呈線性相關，線性方程為：y=0.128 9x-0.960 5(R2=0.995 0)。計算得到枸杞蜂花粉多糖的DPPH自由基清除力為(0.44±0.09) μmol/mg。FRAP值反映了抗氧化劑還原能力的大小[25]。濃度為25～300 μmol/L的維生素C與FRAP值呈線性相關，線性方程為y=0.000 4x+0.036 6(R2=0.998 9)。計算得到枸杞蜂花粉多糖的FRAP值為(0.07±0.00) μmol/mg。枸杞蜂花粉多糖具有較好的清除ABTS+自由基和DPPH自由基的能力，但FRAP值較低。

3 結 論

研究優(yōu)化了超聲輔助提取枸杞花粉多糖的工藝，當提取條件為料液比(g/mL)1∶25、提取溫度90 ℃、超聲功率240 W、超聲時間20 min時，枸杞花粉多糖的得率達到0.89%～0.91%；并研究了枸杞花粉多糖體外抗氧化活性，其對于ABTS+自由基清除力、DPPH自由基清除力和FRAP值分別為0.19、0.44、0.07 μmol/mg，表明其具有較好的DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力，但FRAP值較低。