雷 露， 吳天祥,2，*， 王川南

(1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院， 貴州 貴陽 550025；2.貴州食品工程職業(yè)學(xué)院 糧油食品工程系， 貴州 貴陽 551400)

灰樹花(Grifolafrondosa)是一種營養(yǎng)豐富、生物活性高的藥食兩用真菌，它的菌絲體、子實(shí)體與發(fā)酵液中分離的一類富含β-(1→6)、β-(1→3)糖苷鍵的真菌多糖，即灰樹花多糖(Grifolafrondosapolysaccharide, GFP)讓其具有很高的藥用價(jià)值[1]?；覙浠ǘ嗵蔷哂锌鼓[瘤[2]，清除自由基[3-5]，抗氧化[3，7-8]，提高成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)膠原蛋白合成等生物活性[2]。快速、高效、經(jīng)濟(jì)地獲得藥用真菌胞外多糖的方法是采用液體發(fā)酵培養(yǎng)。為了能最大量獲得胞外多糖，在藥用真菌液體發(fā)酵體系中添加一定的外源刺激物，能同時(shí)促進(jìn)菌體細(xì)胞的生長和次生代謝產(chǎn)物(如EPS)的生物合成[9]。

近年來，眾多學(xué)者在利用藥用真菌液體轉(zhuǎn)化方面進(jìn)行了大量的研究，Yang等[10]研究發(fā)現(xiàn)在靈芝液體發(fā)酵中添加薏苡仁油能顯著促進(jìn)靈芝菌絲體的生長；Lin等[11]發(fā)現(xiàn)枸杞水提取物的添加能顯著促進(jìn)云芝液體發(fā)酵液菌絲體的增加。本課題組前期研究結(jié)果表明，天麻醇提物的添加可以顯著促進(jìn)灰樹花細(xì)胞生長和胞外多糖的合成[12-15]。趙亮等[16]在灰樹花發(fā)酵體系中，添加山藥、苦蕎提取物均對(duì)灰樹花胞外多糖的產(chǎn)量有促進(jìn)作用。目前，國內(nèi)外學(xué)者針對(duì)添加外源提取物增加胞外多糖產(chǎn)量的研究限于單一添加物，對(duì)復(fù)配物的添加作用研究較少。

在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)在灰樹花深層發(fā)酵體系中同時(shí)添加2種外源添加物，即天麻和苦蕎復(fù)配液。分析對(duì)灰樹花胞外多糖產(chǎn)量和菌絲體生物量的影響，并動(dòng)態(tài)分析了發(fā)酵過程中的胞外多糖含量、菌體質(zhì)量、殘?zhí)?還原糖)含量、pH值的變化，以期為今后研究復(fù)配液對(duì)提高灰樹花多糖產(chǎn)量的影響提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰樹花(菌種編號(hào)5.404)，中國普通微生物菌種保藏管理中心；苦蕎籽粒，貴州省威寧縣苦蕎種植基地；天麻，貴州省德江縣天麻種植基地。

斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。液體種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 30，KH2PO40.5，蛋白胨2，MgSO4·7H2O 0.5，酵母膏 6，自然pH值。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡糖糖 50，KH2PO42，蛋白胨5，MgSO4·7H2O 2，酵母膏10，自然pH值。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM- 30R型立式滅菌鍋、GZX- 9070 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW- CJ- 1D型凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SG8200HPT型超聲波清洗機(jī)，上海冠特超聲儀器有限公司；GL- 20G- Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；CP114型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；L5S型紫外分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司;TS- 2102C型恒溫振蕩器，上海天呈儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1灰樹花菌體培養(yǎng)方法

1)斜面種子培養(yǎng)：從母種試管中用接種鏟挑取黃豆粒大小的菌絲塊接種于PDA斜面培養(yǎng)基中部，放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，待菌體長滿整個(gè)斜面。

2)液體種子培養(yǎng)：將接種勺在培養(yǎng)好的斜面種子管中輕輕刮取蠶豆粒大小的菌絲體接種于液體種子培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶裝液量為100 mL，置于25 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)4～7 d。

3)發(fā)酵培養(yǎng)：按10%的接種量，用移液槍從液體種子培養(yǎng)基中吸取種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶裝液量為100 mL，置于25 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)。三角瓶中長出大量均勻細(xì)小的菌絲球且培養(yǎng)液清亮為最佳。

1.3.2天麻醇提物的制備

天麻粉制備：天麻洗凈，55 ℃烘干、粉碎，過80目篩備用。

天麻醇提物的制備：稱取10 g天麻粉，加入100 mL體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液浸提48 h后過濾，減壓除去乙醇，加入蒸餾水定容到100 mL，即1 g天麻粉可得10 mL醇提液。將醇提液作為灰樹花液體培養(yǎng)中的外源添加物。

1.3.3苦蕎醇提物的制備

苦蕎粉的制備：苦蕎籽粒去殼、洗凈，55 ℃烘干、粉碎，過80目篩備用。

苦蕎醇提物的制備：稱取10 g苦蕎粉，分別加入350 mL體積分?jǐn)?shù)65%、75%、85%、95%的乙醇溶液，80 ℃回流提取2 h后過濾，減壓除去乙醇，加入蒸餾水定容到100 mL，即1 g苦蕎粉可得10 mL醇提液。將醇提液作為灰樹花液體培養(yǎng)中的外源添加物。

1.4 分析方法

1.4.1生物量的測定

灰樹花菌體生長以其生物量為指標(biāo)。將發(fā)酵完成后的培養(yǎng)基用濾紙過濾，得到灰樹花菌絲體，菌絲體用蒸餾水沖洗3次，放置于60 ℃數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，稱質(zhì)量即得到菌絲體干重。結(jié)果以單位體積發(fā)酵液中的菌絲體干質(zhì)量為菌絲體生物量(g/L)。

1.4.2胞外多糖含量的測定

量取5 mL1.4.1中過濾后的濾液，加入4倍體積的95%乙醇溶液，于4 ℃冰箱中醇沉24 h，離心(4 000 r/min，15 min)去除上清液，將沉淀用95%的乙醇溶液洗滌3次，然后于60 ℃數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱烘干，加水于55 ℃水浴鍋溶解，溶解后定容至50 mL，最后取1 mL溶液用苯酚—硫酸法測定胞外多糖含量。

1.4.3還原糖含量的測定

取1 mL1.4.1中過濾后的濾液，用蒸餾水定容至50 mL，取1 mL稀釋液于25 mL的具塞比色管中，加1 mL蒸餾水，再加入1.5 mL DNS(3,5-二硝基水楊酸)試劑，搖勻后，沸水浴加熱5 min，冷卻至室溫并定容至25 mL，于520 nm處測定吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 23.0軟件分析顯著性，用Excel 2010軟件和Origin 2017軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎醇提物對(duì)灰樹花生物量和胞外多糖合成的影響

在灰樹花發(fā)酵體系中添加不同質(zhì)量濃度的苦蕎提取物，發(fā)酵7 d后菌絲體生物量和胞外多糖產(chǎn)量如圖1、圖2。隨著苦蕎質(zhì)量濃度的增加，灰樹花菌絲體生物量和胞外多糖產(chǎn)量先增加至最大后降低。這說明一定質(zhì)量濃度的苦蕎提取物能刺激灰樹花菌體生長和胞外多糖的合成，高質(zhì)量濃度的苦蕎提取物對(duì)灰樹花的生長具有一定的抑制作用。當(dāng)乙醇提取體積分?jǐn)?shù)為75%，苦蕎醇提物添加量為5 g/L時(shí)，對(duì)灰樹花菌絲體產(chǎn)胞外多糖和生物量的合成具有明顯的促進(jìn)作用(P<0.05)，分別達(dá)到最大值(1.268±0.169) g/L和(1.727±0.132) g/L時(shí)，與空白組(不加苦蕎)相比，分別增加了11.35%和19.27%。根據(jù)這一結(jié)果，選取75%乙醇用于苦蕎提取，進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同質(zhì)量濃度苦蕎醇提物對(duì)灰樹花生物量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of Fagopyrum tataricum extract on biomass of Grifola frondosa

圖2 不同質(zhì)量濃度苦蕎提取物對(duì)灰樹花胞外多糖合成的影響Fig.2 Effects of different concentrations of Fagopyrum tataricum extract on synthesis of extracellular GFP

2.2 天麻醇提物對(duì)灰樹花生物量和胞外多糖合成的影響

本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，將體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸提天麻得到的醇提物添加到灰樹花發(fā)酵液中，有益于其胞外多糖產(chǎn)量和菌絲體生物量增加[17]。故本實(shí)驗(yàn)直接在灰樹花發(fā)酵體系中添加不同質(zhì)量濃度的75%天麻醇提物，發(fā)酵7 d后灰樹花生物量和胞外多糖的產(chǎn)量如圖3。隨著天麻醇提物質(zhì)量濃度的增加，灰樹花胞外多糖產(chǎn)量和菌絲體生物量先增加后降低。這說明一定質(zhì)量濃度的天麻醇提物對(duì)灰樹花發(fā)酵起到促進(jìn)作用(P<0.05)，而高質(zhì)量濃度的天麻醇提物對(duì)灰樹花的生長具有一定的抑制作用。當(dāng)天麻醇提物的添加量達(dá)到7 g/L時(shí)，灰樹花的胞外多糖產(chǎn)量和生物量分別達(dá)到最大值(1.493±0.026) g/L和(1.965±0.012) g/L，與空白組(不加天麻)相比分別增加了31.08%和35.70%。

圖3 天麻醇提物對(duì)灰樹花胞外多糖合成和生物量的影響Fig.3 Effect of Gastrodia elata extract on systhesis of extra-cellular polysaccharide and biomass of Grifola frondosa

2.3 天麻和苦蕎復(fù)配液對(duì)灰樹花生物量和胞外多糖合成的影響

不同比例的天麻和苦蕎復(fù)配液的添加均對(duì)灰樹花的生長和胞外多糖合成有一定的促進(jìn)作用，見表1。當(dāng)復(fù)配液天麻醇提物的添加量為7 g/L，苦蕎醇提物的添加量為5 g/L時(shí)，與空白組(不加提取物)相比，灰樹花胞外多糖產(chǎn)量和生物量分別增加了49.08%和51.10%(P<0.01)；與單一添加7 g/L的天麻醇提物相比，灰樹花胞外多糖產(chǎn)量和生物量分別增加了13.76%和11.35%(P<0.05)；與單一

表1 不同比例的天麻和苦蕎復(fù)配液對(duì)灰樹花胞外多糖合成和生物量的影響

添加5 g/L的苦蕎醇提物相比，灰樹花胞外多糖產(chǎn)量和生物量分別增加33.88%和26.69%(P<0.01)。這說明了一定體積的天麻和苦蕎復(fù)配液對(duì)灰樹花的發(fā)酵起到了良好的促進(jìn)作用。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取復(fù)配液配比為天麻醇提物7 g/L、苦蕎醇提物5 g/L加入灰樹花發(fā)酵體系中。

2.4 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析

在灰樹花發(fā)酵體系中同時(shí)添加7 g/L的天麻醇提物和5 g/L的苦蕎醇提物，每隔1 d取樣，研究發(fā)酵培養(yǎng)13 d內(nèi)菌絲體生物量、胞外多糖產(chǎn)量以及殘?zhí)?還原糖)的變化情況。

2.4.1生物量和殘?zhí)堑陌l(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析

在灰樹花整個(gè)發(fā)酵周期中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長菌絲體的生物量不斷增加，在1～3 d生長處于遲緩期，3～7 d生長處于對(duì)數(shù)期，在第7天時(shí)趨于穩(wěn)定(見圖4)。與空白組相比，復(fù)配組菌體生長速率較快，消耗碳源(還原糖)更多，第7天復(fù)配組生物量比空白組提高了70.40%，殘?zhí)呛勘瓤瞻捉M降低了59.74%。其中的原因可能是在添加了天麻和苦蕎復(fù)配液后，提取物中的有效成分能夠促進(jìn)灰樹花菌體細(xì)胞的吸收，使灰樹花能夠利用更多的碳源物質(zhì)來促進(jìn)自身菌體細(xì)胞的生長。在發(fā)酵后期，葡萄糖沒有消耗完，這可能由于灰樹花在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶能將底物分解為碳源物質(zhì)供其利用，也可能是某些條件限制了灰樹花菌體細(xì)胞的生長[17-18]。

圖4 菌絲體生物量和殘?zhí)呛康膭?dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of mycelial biomass and residual sugar content

2.4.2胞外多糖和pH值的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析

在灰樹花整個(gè)培養(yǎng)階段，空白組與復(fù)配組的胞外多糖產(chǎn)量均逐漸增加至最大值后緩慢下降，見圖5。在1～3 d胞外多糖合成速率較慢，在3～7 d胞外多糖產(chǎn)量迅速增加，第7天時(shí)，空白組與復(fù)配組均達(dá)到最大值(1.139±0.264) g/L和(1.698±0.138) g/L，隨后胞外多糖產(chǎn)量開始緩慢下降，這可能是由于在發(fā)酵后期菌體細(xì)胞產(chǎn)生的酶將多糖分解為單糖物質(zhì)導(dǎo)致胞外多糖的產(chǎn)量開始下將。此外，pH值在整個(gè)發(fā)酵周期中呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，可能是在培養(yǎng)的前期，灰樹花通過糖酵解途徑以及半纖維素降解產(chǎn)生乳酸而導(dǎo)致pH值下降[19]?？瞻捉M和復(fù)配組分別在第11天和第9天時(shí)pH值開始上升，其原因是在灰樹花發(fā)酵期間，觀察到空白組發(fā)酵至第11天、復(fù)配組發(fā)酵至第9天時(shí)灰樹花菌體由均勻的球狀變細(xì)小球狀懸浮于發(fā)酵液中，發(fā)酵液由澄清變渾濁。判斷此時(shí)灰樹花菌體細(xì)胞開始自溶，細(xì)胞破碎，導(dǎo)致胞內(nèi)的堿性物質(zhì)流出。復(fù)配組自溶的時(shí)間早于空白組2 d，這可能是因?yàn)樘砑恿藦?fù)配液后，菌絲體的生長速度更快，生長周期縮短，這在生產(chǎn)應(yīng)用中會(huì)提高生產(chǎn)效率。

圖5 灰樹花胞外多糖含量和pH值的動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes of extracellular GFP content and pH

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了天麻醇提物和苦蕎醇提物復(fù)配添加比例對(duì)灰樹花胞外多糖合成以及菌絲體生長的影響并優(yōu)化了復(fù)配比例。結(jié)果表明：當(dāng)復(fù)配液中天麻醇提物添加量為7 g/L、苦蕎醇提物添加量為5 g/L時(shí)效果較佳，相比空白組(未添加提取物)和單一添加組(天麻、苦蕎)，使胞外多糖產(chǎn)量分別增加了49.08%、13.76%、33.88%，菌絲體生物量分別增加了51.10%、11.35%、26.69%，均顯著地高于空白組(P<0.01)和單一添加組(P<0.05)。因天麻苦蕎復(fù)配液影響灰樹花胞外多糖的合成以及菌絲體生長的具體機(jī)制還不明確，因此本課題組將在前期的研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察天麻、苦蕎提取物中的有效成分(蘆丁、槲皮素、天麻素、對(duì)羥基苯甲醛、對(duì)羥基苯甲醇等)[20-22]在灰樹花發(fā)酵體系中的生物轉(zhuǎn)化機(jī)理，為更有效地提高灰樹花菌體生物量和胞外多糖產(chǎn)量提供參考。