田蘭馨，徐 慧，彭 柔， 慈 雪，王秀敏

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病，患者往往有劇烈瘙癢，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。近年來(lái)隨著對(duì)AD 免疫機(jī)制的深入研究，揭示AD 是炎癥反應(yīng)惡性循環(huán)的結(jié)果。Th1/Th2 細(xì)胞失衡被認(rèn)為是AD 發(fā)病的主要機(jī)制，在急性期以Th2 細(xì)胞反應(yīng)為主，介導(dǎo)體液免疫；慢性期時(shí)，以Thl 細(xì)胞反應(yīng)為主，參與細(xì)胞免疫反應(yīng)。白細(xì)胞介素（IL）是一類可以在白細(xì)胞及免疫細(xì)胞間相互作用的細(xì)胞因子，在介導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞活化、增殖與分化及炎癥反應(yīng)中起重要作用。IL-32 作為一種多向性的促炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子，在增強(qiáng)炎癥的反應(yīng)上扮演重要的角色。主要通過(guò)增加多種炎性細(xì)胞因子的分泌以及促進(jìn)細(xì)胞向炎癥區(qū)遷徙而發(fā)揮作用。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）屬IL-7 家族成員，在皮膚黏膜天然免疫中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)AD患者皮損處角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocyte，KC）可高表達(dá)TSLP，而AD 患者非皮損處皮膚則幾乎不表達(dá)TSLP[1]。還有研究發(fā)現(xiàn)IL-32 可以通過(guò) caspase-1 和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）途徑上調(diào) TSLP 的表達(dá)，且這兩個(gè)因子均能通過(guò)介導(dǎo)相關(guān)因子的表達(dá)，來(lái)調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞的增殖和分化。因此兩者在Th1、Th2、Th17 及其他 Th 細(xì)胞亞群的平衡調(diào)節(jié)中，起到一定的協(xié)同作用，共同參與變應(yīng)性炎癥反應(yīng)[2]。目前為止，在AD 患者中，兩者的關(guān)系及表達(dá)意義國(guó)內(nèi)報(bào)道較少，本研究通過(guò)檢測(cè)48 例AD 患者治療前后外周血IL-32、TSLP 的表達(dá)水平及與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析，探討兩者在AD 發(fā)病中的作用。

1 病例與方法

1.1 病例

試驗(yàn)組選取醫(yī)院皮膚科門診2017 年1 月―2017年11 月就診的確診為AD 的患者，診斷均符合AD的Williams 診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。選取患者48 例，其中男25例，女23 例，年齡8 ～27 歲，平均（17±1.84）歲，病程2 個(gè)月～17 年，所有受檢患者近3 個(gè)月未接受糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、紫外線等系統(tǒng)治療。健康對(duì)照選取2017 年1 月―2017 年10 月來(lái)自濱州地區(qū)中小學(xué)及大學(xué)的健康志愿者30 例，男14 例，女16 例，年齡10 ～23 歲，平均（16±2.28）歲，體格檢查及實(shí)驗(yàn)室檢查均正常。無(wú)系統(tǒng)性疾患，近期沒(méi)有局部和全身的感染性疾患，均無(wú)過(guò)敏性疾病史。兩組在性別、年齡等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑

人 TSLP 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 試劑盒及人IL-32 ELISA 試劑盒（上海羽朵生物科技有限公司），他克莫司軟膏（兒童濃度0.03%，成人濃度0.1%）（安斯泰來(lái)制藥有限公司）及復(fù)方甘草酸苷膠囊（北京凱因科技股份有限公司）。

1.3 標(biāo)本收集及IL-32、TSLP水平測(cè)定

健康對(duì)照組及試驗(yàn)組治療前與治療8 周后抽取空腹靜脈血5 ml，分離血清。采用競(jìng)爭(zhēng)性抑制法ELISA 檢測(cè)IL-32、TSLP 水平。具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 給藥方法及療效判定

外用他克莫司軟膏，每日2 次外用，療程為8周；口服復(fù)方甘草酸苷膠囊，每日3 次，每次3 粒（16 歲以下兒童1 次1 粒，每日3 次），療程為8 周。在治療前及治療8 周后分別計(jì)算AD 病情嚴(yán)重程度（SCORAD）評(píng)分。

1.5 療效觀察指標(biāo)及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

在治療前及治療后采用歐洲AD 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)SCORAD 評(píng)估患者疾病嚴(yán)重程度。SCORAD 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)包括皮膚病變范圍(A)和皮損嚴(yán)重程度(B)和主觀癥狀(C)——瘙癢和睡眠影響程度。皮膚病變范圍的面積評(píng)分：以l%的皮損面積計(jì)為1 分，其中手部包括腕部，足部包括踝部，軀干包括臀部。瘙癢和睡眠影響程度評(píng)分：按最近的3 晝夜平均來(lái)評(píng)分，各評(píng)分分為0 ～10 分，0 分為無(wú)瘙癢或睡眠無(wú)影響，10 分為患者所能想像最嚴(yán)重的瘙癢或根本無(wú)法入睡?？偡钟?jì)算公式：總分=A/5+7B/2+C。總分范圍為0～103分，＜25 分為輕度，25 ～50 分為中度，＞50 分為重度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床療效評(píng)估

試驗(yàn)組48 例患者均按要求完成規(guī)定療程，2 例患者出現(xiàn)輕微皮膚發(fā)紅伴燒灼感，考慮與他克莫司刺激有關(guān)，適度冷敷后癥狀緩解，未影響治療。治療前SCORAD 評(píng)分（51.53±16.89）分，明顯高于治療后（28.53±11.27）分，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.73，P＜0.01）。

2.2 兩組患者血清IL-32、TSLP水平

AD 患者血清IL-32 表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.65，P＜0.01）。治療前后比較：治療前外周血血清IL-32 表達(dá)水平顯著高于治療后，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.77，P＜0.01）；治療后外周血清IL-32 水平高于正常組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.81，P＞0.05）（表1，圖1）。

AD 患者血清TSLP 表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=28.01，P＜0.01）。治療前后比較，治療前外周血血清TSLP 表達(dá)水平顯著高于治療后，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.45，P＜0.01）；治療后外周血清TSLP 水平高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.46，P＜0.01）（表1，圖2）。

表1 AD患者血清IL-32和TSLP水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，pg/ml）

表1 AD患者血清IL-32和TSLP水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，pg/ml）

組 別 例數(shù) IL-32 TSLP試驗(yàn)組治療前 48 75.65±12.47 99.77±11.95治療后 48 40.29± 7.61 51.27±10.12對(duì)照組 30 37.22± 6.71 30.71± 7.90

圖1 AD患者血清IL-32水平檢測(cè)

圖2 AD患者血清TSLP水平檢測(cè)

2.3 相關(guān)性分析

本實(shí)驗(yàn)中AD 患者治療前的血清TSLP 水平與SCORAD 評(píng)分之間有相關(guān)性，為正相關(guān)（r= 0.57，P＜0.05）。AD 患 者 治 療 前 的 血 清IL-32 水 平 與SCORAD 評(píng)分之間無(wú)直線相關(guān)性（r=0.29，P＜0.05）。治療前IL-32 與 TSLP 血清水平之間有相關(guān)性，為正相關(guān)（r= 0.52，P＜0.01），見(jiàn)表2 及圖3。

表2 AD患者外周血各細(xì)胞因子及SCORAD評(píng)分的相關(guān)性

3 討論

IL-32 的基因最早是在1992 年從自然殺傷（NK）細(xì)胞中克隆出來(lái)，當(dāng)時(shí)命名為NK4（natural killer cell transcript 4），但其功能未知。 2005 年Kim 等[4]利用生物芯片技術(shù)研究IL-18 誘導(dǎo)高表達(dá)基因，從中發(fā)現(xiàn)一個(gè)高表達(dá)的細(xì)胞因子樣基因，命名為IL-32。IL-32主要是由NK 細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞及外周血中的單核細(xì)胞產(chǎn)生。Meyer 等[5]在研究中發(fā)現(xiàn)，人初始KC 可以表達(dá)IL-32，且受到干擾素（IFN）-γ、腫瘤壞死因子（TNF）-α 的刺激后增加，其與KC 的凋亡密切相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)AD 患者皮損表面 IL-32 的表達(dá)較健康人皮膚處升高，而且IL-32 血清水平和AD 患者病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，國(guó)內(nèi)少見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。TSLP 屬IL-7 家族成員，其受體由IL-17Rα 和TSLPR 組成，屬于Th2 型細(xì)胞因子。TSLP 可由皮膚的KC、黏膜上皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞產(chǎn)生，在皮膚黏膜天然免疫中起重要作用。TSLP 可以通過(guò)TSLP-DC-OX40L 軸在患者體內(nèi)產(chǎn)生一系列Th2 細(xì)胞介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這些均提示TSLP 是啟動(dòng)AD Th2 型免疫反應(yīng)的“重要開(kāi)關(guān)”[6]。近年來(lái)國(guó)外研究表明TSLP 不僅可以啟動(dòng)AD 患者Th2 型的免疫反應(yīng)，而且可以直接刺激感覺(jué)神經(jīng)引起瘙癢[7,8]。另外，TSLP 目前被發(fā)現(xiàn)是預(yù)測(cè)嬰兒AD 發(fā)生發(fā)展的重要生物學(xué)標(biāo)志，高水平的TSLP 表達(dá)對(duì)有家族史的受試者進(jìn)一步提升了它的預(yù)測(cè)價(jià)值[9]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究IL-32、TSLP 相關(guān)通路在AD 發(fā)病機(jī)制中的作用，為AD 未來(lái)的靶向治療提供新的思路。

圖3 AD患者IL-32和TSLP水平與SCORAD評(píng)分之間的相關(guān)性

相關(guān)研究已證明IL-32 可以通過(guò) caspase-1 和NF-κB 途徑介導(dǎo) Th2 細(xì)胞表達(dá)TSLP，IL-32 可以通過(guò)上調(diào) TSLP 的表達(dá)，來(lái)促使炎癥反應(yīng)的發(fā)生，而隨著 TSLP 的耗竭或通過(guò)抑制 caspase-1 來(lái)減弱IL-32-TSLP 這一通路的作用，便可以抑制炎癥反應(yīng)[1]。這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符，兩者在AD 患者中的血清水平較正常對(duì)照組均明顯升高，且二者關(guān)系呈顯著正相關(guān)。此外，TSLP 激活的樹(shù)突狀細(xì)胞（TSLP-DCs）可選擇性表達(dá) OX40L，OX40L 與受體 OX40 結(jié)合，在不同微環(huán)境下發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。在有關(guān)實(shí)驗(yàn)中，筆者了解到濕疹患者外周血中 IL-32 mRNA與 OX40L mRNA 的表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示在濕疹的發(fā)病過(guò)程中，IL-32 可能先通過(guò)激活 NF-κB 和caspase-1 途徑上調(diào) TSLP 的表達(dá)，然后 TSLP-DCs 表達(dá)的OX40L 進(jìn)一步產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。此外，IL-32-TSLP 均能通過(guò)介導(dǎo)相關(guān)因子的表達(dá)，來(lái)調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞的增殖和分化，活化Th1 向Th2 細(xì)胞分化，從而促進(jìn)Th2 細(xì)胞的生成并分泌Th2 型細(xì)胞因子和促炎性因子，促進(jìn)lgE、嗜酸粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等的產(chǎn)生，進(jìn)而引起過(guò)敏性炎癥反應(yīng)。因此兩者在Th 細(xì)胞亞群的平衡調(diào)節(jié)中，起到重要的協(xié)同作用。因而可以推測(cè)，IL-32-TSLP 可能成為濕疹、AD以及其他變態(tài)性炎癥反應(yīng)疾病的診療的一個(gè)新靶點(diǎn)，相關(guān)詳細(xì)機(jī)制通路還需要進(jìn)一步的研究。

他克莫司軟膏是一種新型外用大環(huán)內(nèi)酯類免疫調(diào)節(jié)劑，是治療AD 的非皮質(zhì)類固醇類外用制劑，療效確切，不良反應(yīng)較少。有研究證明其作用機(jī)制主要是通過(guò)抑制鈣調(diào)磷酸酶而抑制激活性T 淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核因子（nu-clear factorof activated T cells，NFAT）的轉(zhuǎn)錄，繼而抑制T 淋巴細(xì)胞的活化及其介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)。它能有效地與細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的FK506結(jié)合蛋白-12 結(jié)合并形成復(fù)合物，競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合鈣調(diào)蛋白的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶，抑制酶活性，最終抑制與特應(yīng)性皮炎發(fā)病相關(guān)的細(xì)胞因子生成，這一作用是選擇性地針對(duì)AD 發(fā)病機(jī)制的核心[10]。且他克莫司不會(huì)抑制膠原合成，故長(zhǎng)時(shí)間使用不會(huì)導(dǎo)致用藥部位皮膚出現(xiàn)萎縮和增加感染發(fā)生概率，安全性較高，用于維持性治療AD 的優(yōu)勢(shì)十分顯著。他克莫司的免疫調(diào)節(jié)作用除了通過(guò)經(jīng)典的抑制T 淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)磷酸酶的活性而抑制大量的與Th2 和Th1 細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)外，還能直接或間接抑制與炎癥反應(yīng)起始有關(guān)的KC 轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp50 和NF-κBp65 的活化，進(jìn)而抑制NF-kB 調(diào)控的促炎細(xì)胞因子、趨化因子和協(xié)同刺激分子表達(dá)，產(chǎn)生抗天然免疫炎癥反應(yīng)的作用。IL-32 轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路中包括NF-κB 通路，IL-32 與相應(yīng)受體結(jié)合激活NF-κB 通路，影響多種細(xì)胞因子、黏附因子、免疫受體、急性時(shí)相蛋白、應(yīng)激反應(yīng)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，且IL-32 可以通過(guò)NF-κB 途徑介導(dǎo) Th2細(xì)胞表達(dá)TSLP，影響AD 炎癥反應(yīng)。

復(fù)方甘草酸苷是以甘草中的活性物質(zhì)為主要成分的復(fù)方制劑，具有抗炎、抗過(guò)敏及類固醇樣作用和免疫調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞活化，誘發(fā)IFN-γ產(chǎn)生，活化NK 細(xì)胞以及抗病毒作用。它還可使血清中IgE 明顯下降乃至正常。此外可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，促使免疫細(xì)胞增強(qiáng)活性，提升患者對(duì)于外界刺激的抵抗力和免疫功能，促使細(xì)胞免疫代謝功能恢復(fù)正常，達(dá)到減少過(guò)敏反應(yīng)的目的，且明顯緩解變應(yīng)性炎癥性皮膚病的臨床癥狀。

本實(shí)驗(yàn)中，AD 患者在使用他克莫司軟膏和復(fù)方甘草酸苷膠囊治療后，IL-32、TSLP 的血清水平以及SCORAD 評(píng)分明顯下降，較治療前差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這進(jìn)一步印證了各種刺激誘發(fā)的KC 的NF-κB 過(guò)度活化可作為啟動(dòng)或維持AD 炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)。而他克莫司軟膏不僅通過(guò)經(jīng)典的抑制T 淋巴細(xì)胞活化而抑制Th2 和Th1 的免疫炎癥反應(yīng)，還可以通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)的上游激活時(shí)間而間接調(diào)控與天然免疫反應(yīng)密切相關(guān)的中心轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的核表達(dá)或活化，進(jìn)而調(diào)控與之有關(guān)的通路引起的皮膚天然免疫炎癥反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，IL-32、TSLP 均在AD 發(fā)病過(guò)程中起重要的作用。他克莫司聯(lián)合復(fù)方甘草酸苷治療后，二者血清水平明顯下降，推測(cè)IL-32-TSLP 可能成為AD及其他變應(yīng)性炎癥性疾病治療的一個(gè)新靶點(diǎn)，但由于IL-32 和TSLP 各自與受體結(jié)合后作用的多樣化，兩分子間相互作用的更多機(jī)制還有待今后進(jìn)一步探究。